瑞芬太尼調(diào)控miR-148a對骨肉瘤細(xì)胞生物行為的影響

孟楊，王紹偉，王憲峰，徐海偉

骨肉瘤是臨床常見惡性腫瘤之一，常發(fā)病于青少年時期，其病死率較高，目前臨床主要采用外科手術(shù)與化療等方式治療骨肉瘤，但治療效果不佳[1]。由于骨肉瘤具有高度特異性導(dǎo)致其極易產(chǎn)生耐藥性從而影響治療效果[2-3]。因而尋找新型安全有效的藥物是臨床治療骨肉瘤亟待解決的關(guān)鍵問題。研究表明瑞芬太尼可抑制肝癌、肺癌等多種腫瘤細(xì)胞增殖，并可降低細(xì)胞遷移侵襲能力[4-5]。但瑞芬太尼對骨肉瘤細(xì)胞生物行為的影響及其機(jī)制尚未見報道。研究表明微小RNA-148a(microRNA-148a，miR-148a)在骨肉瘤患者中表達(dá)下調(diào)，其可作為骨肉瘤早期診斷及評估患者預(yù)后的生物標(biāo)志物[6]。過表達(dá)miR-148a可抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖，抑制miR-148a表達(dá)可促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞增殖[7]。因此，本研究主要探討瑞芬太尼對骨肉瘤細(xì)胞增殖、凋亡的影響，初步分析其對miR-148a表達(dá)的調(diào)控作用，為臨床合理應(yīng)用瑞芬太尼治療骨肉瘤提供理論依據(jù)，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)骨肉瘤細(xì)胞MG63：購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，DMEM培養(yǎng)基購自美國Thermo Fisher公司；胎牛血清與胰蛋白酶均購自美國Gibco公司；(2)試藥與試劑：瑞芬太尼購自湖北宜昌人福藥業(yè)有限責(zé)任公司。miR-148a抑制劑(anti-miR-148a)、anti-miR-NC購自廣州銳博生物科技有限公司；Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司；MTT細(xì)胞增殖檢測試劑盒購自黃石研科生物科技有限公司；Annexin V-FITC / PI雙染法細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自上海鈺博生物科技有限公司；Total RNA Kit試劑盒購自美國Omega Biotech公司；M-MLV第一鏈試劑盒購自美國Life Technologies公司；SYBR Green qPCR Super Mix-UDG試劑盒購自美國Life Technologies公司；RIPA裂解液購自美國Cell Signaling Technology公司；PVDF膜購自美國Millipore公司；ECL試劑盒購自美國Pierce公司；兔抗人細(xì)胞周期蛋白1(CyclinD1)、P21一抗購自美國Santa Cruz公司；兔抗人B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)蛋白(Bcl-2-associated X protein，Bax)、B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 骨肉瘤標(biāo)本 收集2017年3月—2018年5月山東省棗莊礦業(yè)集團(tuán)棗莊醫(yī)院骨科收治骨肉瘤患者36例為研究對象，均接受手術(shù)治療，切除骨肉瘤組織經(jīng)病理證實(shí)為骨肉瘤、癌旁組織，二者放入液氮中，術(shù)后轉(zhuǎn)移至-80 ℃超低溫冰箱內(nèi)保存。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者知情同意且簽署同意書。

1.3 實(shí)驗方法 2017年8月—2018年12月于山東省棗莊礦業(yè)集團(tuán)棗莊醫(yī)院實(shí)驗室進(jìn)行實(shí)驗。 (1)瑞芬太尼1 mg溶解于0.9%氯化鈉注射液1 ml中，過濾，用DMEM培養(yǎng)基將原液分為不同濃度的干預(yù)液(0.1、1、10、100、200 μmol/L)。培養(yǎng)MG63細(xì)胞，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱，培養(yǎng)液為DMEM培養(yǎng)基(含有10%胎牛血清與青霉素—鏈霉素混合溶液)，待細(xì)胞融合度為90%時進(jìn)行傳代培養(yǎng)，選取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗研究，用終濃度為0.1、1、10、100、200 μmol/L的瑞芬太尼處理MG63細(xì)胞，分別為瑞芬太尼0.1 μmol/L組、1 μmol/L組、10 μmol/L組、100 μmol/L組、200 μmol/L組，未經(jīng)任何處理的細(xì)胞作為對照組，應(yīng)用MTT法檢測細(xì)胞增殖抑制情況。(2)選用抑制率約為50% 瑞芬太尼濃度用于后續(xù)研究，將MG63細(xì)胞隨機(jī)分為瑞芬太尼10 μmol/L+anti-miR-NC亞組(anti-miR-NC轉(zhuǎn)染入MG63細(xì)胞，用終濃度為10 μmol/L的瑞芬太尼處理MG63細(xì)胞)、瑞芬太尼10 μmol/L+anti-miR-148a亞組(anti-miR-148a轉(zhuǎn)染入MG63細(xì)胞，用終濃度為10 μmol/L的瑞芬太尼處理MG63細(xì)胞)，各亞組處理時間均為48 h，收取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究。

1.4 觀測指標(biāo)與方法

1.4.1 MTT檢測細(xì)胞增殖：取對數(shù)生長期MG63細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，用DMEM培養(yǎng)液(含有10%胎牛血清)制備單細(xì)胞懸液接種于96孔板(3×104個細(xì)胞/孔)，培養(yǎng)24 h后，按不同分組分別于24 h、48 h、72 h時每孔加入MTT溶液20 μl(5 mg/ml)，室溫孵育4 h，棄上清，加入DMSO(150 μl/孔)，勻速振蕩10 min，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測各孔吸光度值(OD 490 nm)。實(shí)驗重復(fù)3次，取平均值。

1.4.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡：取各組MG63細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌2次，每次10 min，細(xì)胞沉淀轉(zhuǎn)移至流式檢測管，加入1×binding buffer重懸細(xì)胞500 μl，依次加入Annexin V-FITC、PI各5 μl，充分混勻，室溫條件下暗室避光孵育10 min，于1 h內(nèi)上機(jī)，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.4.3 qRT-PCR法檢測RNA表達(dá)：應(yīng)用Total RNA Kit試劑盒提取骨肉瘤組織、癌旁組織細(xì)胞總RNA，應(yīng)用NanoDrop檢測RNA濃度與純度，應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，參照SYBR Green qPCR Super Mix-UDG試劑盒配置qRT-PCR反應(yīng)體系，qRT-PCR反應(yīng)條件：95℃ 10 s(循環(huán)1次)，95℃ 10 s，60℃ 60 s(循環(huán)40次)。應(yīng)用ABI 7500實(shí)時PCR進(jìn)行檢測，采用2-ΔΔCt法計算miR-148a的相對表達(dá)量，miR-148a以U6為內(nèi)參，miR-148a正向引物為5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’，反向引物為5’-GCGTCAGTGCACTACAGAACTT-3’；U6正向引物為5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反向引物為5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

1.4.4 蛋白免疫印跡(Western blot)檢測Cyclin D1、P21、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)：收集各組MG63細(xì)胞，加入RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，測定蛋白濃度，采用SDS-PAGE電泳分離蛋白，蛋白上樣量30 μg/孔，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，加入一抗(1∶1 000)，搖床上4℃孵育過夜，TBST洗滌3次×10 min，加入相應(yīng)二抗(1∶2 000)，室溫條件下?lián)u床勻速孵育1 h，TBST洗滌2次×10 min，曝光，顯影，應(yīng)用Image J軟件分析各條帶灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 各組MG63細(xì)胞增殖比較 與對照組比較，瑞芬太尼0.1 μmol/L組、瑞芬太尼1 μmol/L組、瑞芬太尼10 μmol/L組、瑞芬太尼100 μmol/L組、瑞芬太尼200 μmol/L組MG63細(xì)胞OD值顯著降低(P<0.01)；Cyclin D1蛋白的表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)，P21蛋白的表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)，瑞芬太尼不同劑量組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，呈劑量依賴效應(yīng)，其中選用抑制率約為50%瑞芬太尼濃度做后續(xù)實(shí)驗，見圖1、表1。

2.2 各組MG63細(xì)胞凋亡率比較 與對照組比較，瑞芬太尼0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L組MG63細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.01)，Bax蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)，Bcl-2蛋白的表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)，見圖2、表2。

注：1.對照組；2.瑞芬太尼0.1 μmol/L組；3.瑞芬太尼1 μmol/L組；4.瑞芬太尼10 μmol/L組；5.瑞芬太尼100 μmol/L組；6.瑞芬太尼200 μmol/L組

圖1 不同濃度的瑞芬太尼對MG63細(xì)胞增殖蛋白表達(dá)的影響

注：1.對照組；2.瑞芬太尼0.1 μmol/L組；3.瑞芬太尼1 μmol/L組；4.瑞芬太尼10 μmol/L組；5.瑞芬太尼100 μmol/L組；6.瑞芬太尼200 μmol/L組

圖2 瑞芬太尼對MG63細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響

表2 瑞芬太尼對MG63細(xì)胞凋亡的影響

表1 瑞芬太尼對MG63細(xì)胞增殖的影響

2.3 miR-148a在骨肉瘤中的表達(dá)及瑞芬太尼對MG63細(xì)胞中miR-148a表達(dá)的影響 與癌旁組織比較，骨肉瘤組織中miR-148a的表達(dá)水平顯著降低(1.02±0.10 vs. 0.31±0.03,t/P=20.402/<0.001)；與對照組比較，瑞芬太尼10 μmol/L組MG63細(xì)胞中miR-148a的表達(dá)水平顯著升高(0.22±0.02 vs. 0.68±0.07,t/P=18.956/<0.001)。

桑：在蓋博犧牲之后，浮西努曾用很長時間來思考感情的問題。在她這個年紀(jì)，正是見解成熟，思力旺盛的時期，并且能夠很好地處理一些情感上的問題，準(zhǔn)確些說，可以更合理地把自己從種種困惑中解脫出來。只能說即使是若干世紀(jì)之后，時間還是這樣不緊不慢，天氣仍是詭譎神秘，一定仍會有人像自己，像是輪回轉(zhuǎn)世一樣，仿佛自己又復(fù)生了一般。對于為蓋博殉情的蘇珊娜，浮西努最終選擇了原諒，并把她的遺物與蓋博合葬在德克薩斯。

2.4 抑制miR-148a對瑞芬太尼抑制MG63細(xì)胞增殖的影響 與瑞芬太尼10 μmol/L+anti-miR-NC亞組比較，瑞芬太尼10 μmol/L+anti-miR-148a亞組MG63細(xì)胞增殖活力顯著升高，Cyclin D1蛋白的表達(dá)水平顯著升高，P21蛋白的表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)，見圖3、表3。

注：1.對照組；2.瑞芬太尼10 μmol/L組；3.瑞芬太尼10 μmol/L+anti-miR-NC亞組;4.瑞芬太尼10 μmol/L+anti-miR-148a亞組

圖3 抑制miR-148a對瑞芬太尼抑制MG63細(xì)胞增殖蛋白表達(dá)的影響

2.5 抑制miR-148a對瑞芬太尼促進(jìn)MG63細(xì)胞凋亡的影響 與瑞芬太尼10 μmol/L+anti-miR-NC亞組比較，瑞芬太尼10 μmol/L+anti-miR-148a亞組MG63細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，Bax蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，見圖4、表4。

注：1.對照組；2.瑞芬太尼10 μmol/L組；3.瑞芬太尼10 μmol/L+anti-miR-NC亞組;4.瑞芬太尼10 μmol/L+anti-miR-148a亞組

圖4 抑制miR-148a對瑞芬太尼促進(jìn)MG63細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

骨肉瘤是指間質(zhì)細(xì)胞從軟骨階段發(fā)展形成腫瘤骨樣組織，早期診斷及治療可有效提高骨肉瘤患者的生存率[8]。近年來，研究表明1種或2種藥物聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同抗腫瘤的作用[9-10]。因此，本研究觀察瑞芬太尼對骨肉瘤的抗腫瘤作用，初步探討其作用機(jī)制，旨在為該藥物的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

瑞芬太尼可抑制肺癌手術(shù)患者血清IL-6水平而抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)[11]。研究表明瑞芬太尼可能通過下調(diào)IL-7R表達(dá)而抑制肺腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[12]。瑞芬太尼可能通過抑制Akt通路而抑制胰腺癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13]。瑞芬太尼屬于μ受體激動劑，研究指出瑞芬太尼可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[14]。本結(jié)果顯示，不同濃度的瑞芬太尼處理骨肉瘤MG63細(xì)胞后，細(xì)胞增殖活力顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高，與上述報道相似，提示瑞芬太尼可抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡；同時顯示瑞芬太尼可顯著提高M(jìn)G63細(xì)胞中P21的表達(dá)水平，降低Cyclin D1的表達(dá)水平，與相關(guān)文獻(xiàn)報道結(jié)果一致[15]。提示瑞芬太尼可能通過上調(diào)P21的表達(dá)及下調(diào)Cyclin D1的表達(dá)進(jìn)而抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖。而瑞芬太尼處理后MG63細(xì)胞中Bax蛋白水平顯著升高，Bcl-2蛋白水平顯著降低，與相關(guān)報道相似[16]。提示瑞芬太尼可能通過上調(diào)Bax表達(dá)及下調(diào)Bcl-2表達(dá)而促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞凋亡。

表3 抑制miR-148a對瑞芬太尼抑制MG63細(xì)胞增殖的影響

表4 抑制miR-148a對瑞芬太尼促進(jìn)MG63細(xì)胞凋亡的影響

miR-148a在鼻咽癌、胃癌組織或細(xì)胞中表達(dá)水平降低，上調(diào)miR-148a表達(dá)可抑制癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。研究表明miR-148a還可抑制胃癌細(xì)胞遷移及侵襲[17-18]。相關(guān)研究報道指出miR-148a過表達(dá)可通過抑制靶基因HPIP表達(dá)而抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖[19]。本結(jié)果顯示，瑞芬太尼處理后MG63細(xì)胞中miR-148a的表達(dá)水平顯著升高，提示瑞芬太尼可能通過上調(diào)miR-148a表達(dá)而影響骨肉瘤細(xì)胞增殖及凋亡。進(jìn)一步研究顯示抑制miR-148a可逆轉(zhuǎn)瑞芬太尼對MG63細(xì)胞增殖的抑制作用，還可逆轉(zhuǎn)瑞芬太尼對MG63細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用。本實(shí)驗結(jié)果證實(shí)，瑞芬太尼可通過促進(jìn)miR-148a表達(dá)而降低骨肉瘤細(xì)胞增殖能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，瑞芬太尼對骨肉瘤細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用，并可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其可能通過上調(diào)miR-148a表達(dá)而發(fā)揮作用，為瑞芬太尼臨床應(yīng)用于骨肉瘤的治療奠定理論基礎(chǔ)。但關(guān)于瑞芬太尼在動物體內(nèi)的相關(guān)實(shí)驗及其安全性研究均需進(jìn)一步探討。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

孟楊、王憲峰：論文撰寫，進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，論文修改；王紹偉、徐海偉：實(shí)施研究過程，數(shù)據(jù)收集，分析整理