基因重組發(fā)光菌應(yīng)用于環(huán)境樣品毒性的測(cè)試

方貴楨， 胡立新， 黃國(guó)勇， 趙建亮， 應(yīng)光國(guó)

(華南師范大學(xué)環(huán)境學(xué)院∥廣東省化學(xué)品污染與環(huán)境安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室∥環(huán)境理論化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510006)

由于生活和生產(chǎn)的需求，中國(guó)的化學(xué)品生產(chǎn)量和使用量數(shù)目龐大，且仍保持日趨增多的趨勢(shì). 但相應(yīng)的化學(xué)品行業(yè)管理制度和風(fēng)險(xiǎn)防控措施不到位，許多化學(xué)品未經(jīng)有效處理就直接排放到環(huán)境中. 科學(xué)研究表明:工業(yè)生產(chǎn)中產(chǎn)生廢氣、廢水、廢渣未經(jīng)處理后排放會(huì)導(dǎo)致土壤中的重金屬含量增加[1]；種植業(yè)化學(xué)品通過(guò)化學(xué)肥料、化學(xué)農(nóng)藥和農(nóng)膜的使用釋放到環(huán)境中[2]，導(dǎo)致環(huán)境中化學(xué)品污染及健康風(fēng)險(xiǎn)問(wèn)題日漸突出. 現(xiàn)階段，化學(xué)分析可以獲得環(huán)境樣品的種類(lèi)和含量等信息，但不能準(zhǔn)確反映樣品的毒性以及評(píng)估這些化學(xué)品暴露引發(fā)的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)[3]，為此，本文采用生物毒性測(cè)試來(lái)表征環(huán)境樣品的生物毒性及其生態(tài)風(fēng)險(xiǎn).

傳統(tǒng)的生物毒性試驗(yàn)可以用的試驗(yàn)生物包括藻類(lèi)[4]、原生動(dòng)物類(lèi)[5]、魚(yú)類(lèi)[6]、植物[7]和其他生物體，但這些受試生物大多需要特殊設(shè)備和專(zhuān)業(yè)操作人員、試驗(yàn)周期長(zhǎng)、重復(fù)率低，試驗(yàn)生物標(biāo)準(zhǔn)化也備受爭(zhēng)議[8-9]. 而細(xì)菌，具有生物機(jī)體小、種群數(shù)量大、生長(zhǎng)繁殖快、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、對(duì)環(huán)境變化敏感等優(yōu)點(diǎn)，與傳統(tǒng)的生物毒性試驗(yàn)相比，細(xì)菌毒性試驗(yàn)可以在短時(shí)間內(nèi)對(duì)受試物的毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)，預(yù)測(cè)受試物的環(huán)境毒性，可操作性強(qiáng). 發(fā)光細(xì)菌是一類(lèi)可以自身發(fā)出藍(lán)綠色熒光的細(xì)菌，發(fā)光強(qiáng)度持續(xù)、穩(wěn)定，一旦遭遇到外界不利因素，如遇到有毒的物質(zhì)時(shí)，其發(fā)光強(qiáng)度會(huì)受到抑制，抑制的程度跟暴露環(huán)境中毒物的質(zhì)量濃度(毒性)大小有關(guān).

為了驗(yàn)證基因重組發(fā)光菌在生物毒性測(cè)試中的可靠性，本研究采用微板測(cè)試法(MTA)，分別利用基因重組發(fā)光菌和費(fèi)氏弧菌對(duì)8種重金屬化合物(ZnSO4、CuSO4、FeCl3、HgCl2、MnCl2、CdCl2、CoCl2和K2Cr2O7)進(jìn)行生物毒性測(cè)試. 利用非線(xiàn)性擬合工具GraphPad Prism 4中Sigmoid函數(shù)和Matlab 的LS-SVM函數(shù)研究其劑量-效應(yīng)關(guān)系，計(jì)算其半數(shù)致死效應(yīng)質(zhì)量濃度，從而評(píng)價(jià)重金屬對(duì)基因重組發(fā)光菌和費(fèi)氏弧菌的生物毒性. 進(jìn)一步以基因重組發(fā)光菌為受試生物，比較了“綠色溶劑”(離子液體)和有機(jī)溶劑的毒性效應(yīng)，論證基因重組發(fā)光菌在生物毒性測(cè)試中的可行性.

1 研究方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 儀器與試劑 儀器：高速冷凍臺(tái)式離心機(jī)(Beckman， CA92821，美國(guó))；多功能酶標(biāo)儀(BioTek，美國(guó))、 震蕩培養(yǎng)箱(上海知楚，中國(guó))；白色96微孔板(COSTAR，美國(guó))；生物安全柜(上海博訊，中國(guó))；高壓蒸汽滅菌器(Panasonic，日本)；不同量程的單、多通道移液器(Eppendorf，德國(guó)). 試劑：硫酸卡那霉素(Amresco，美國(guó))；CuSO4(Sigma-Aldrich，美國(guó))；ZnSO4·7H2O(AR，上海麥克林)；HgCl2(AR，貴州銅仁利祥)；FeCl3·6H2O、MnCl2·4H2O、CdCl2·2.5H2O、CoCl2·6H2O、K2Cr2O7均購(gòu)買(mǎi)于天津市大茂化學(xué)試劑廠(chǎng). 甲醇(HPLC級(jí)，德國(guó))、無(wú)水乙醇、乙腈(HPLC級(jí)，美國(guó))、二甲基亞砜(DMSO，HPLC級(jí)，上海麥克林)、丙酮(HPLC級(jí)，美國(guó)). 6種不同烷基鏈長(zhǎng)度的離子液體(ILs)購(gòu)買(mǎi)于中科院蘭州化學(xué)物理研究所.

1.1.2 測(cè)試菌株 采用的測(cè)試菌株是插入了luxCDABE基因的基因重組發(fā)光菌E.coliHB101 pUCD607[10](以下簡(jiǎn)稱(chēng)基因重組發(fā)光菌).Lux基因是海洋細(xì)菌費(fèi)氏弧菌(Vibriofischeri)中與細(xì)菌生物發(fā)光相關(guān)的基因，將攜帶有該基因的pUCD607質(zhì)粒導(dǎo)入非發(fā)光細(xì)菌中，可使其穩(wěn)定表達(dá)lux基因. 只要代謝正常，菌株就可以持續(xù)產(chǎn)生生物發(fā)光. 當(dāng)菌株接觸到能夠影響其代謝活性的有毒物質(zhì)時(shí)，生物發(fā)光就會(huì)減弱. 生物發(fā)光受抑制的程度可以用適當(dāng)?shù)墓怆妭鞲衅鳈z測(cè)，從而推算毒物的毒性大小. 費(fèi)氏弧菌來(lái)源于杭州綠潔水務(wù)科技股份有限公司，是海洋中一種革蘭氏陰性菌，由于細(xì)菌之間相互交流，啟動(dòng)相關(guān)基因的表達(dá)而引起生物發(fā)光. 任何影響細(xì)胞代謝的作用都會(huì)導(dǎo)致其發(fā)光的減少，所以費(fèi)氏弧菌被普遍作為環(huán)境測(cè)試指標(biāo)[11].

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度以重金屬離子來(lái)計(jì)算. 以ZnSO4·7H2O(Zn2+)為例，稱(chēng)取439.83 mg的ZnSO4·7H2O加蒸餾水溶解，最后定容到100 mL，得到Zn2+儲(chǔ)備液的質(zhì)量濃度為1 g/L. 其他重金屬離子按照同樣的方法配制成1 g/L儲(chǔ)備液. 離子液體1-乙基-3-甲基咪唑氯鹽(IM-2)、1-丁基-3-甲基咪唑氯鹽(IM-4)、1-己基-3-甲基咪唑氯鹽(IM-6)的儲(chǔ)備液的質(zhì)量濃度為200 g/L，1-辛基-3-甲基咪唑氯鹽(IM-8)的儲(chǔ)備液的質(zhì)量濃度為100 g/L，1-癸基-3-甲基咪唑氯鹽(IM-10)、1-十二基-3-甲基咪唑氯鹽(IM-12)的儲(chǔ)備液的質(zhì)量濃度為50 g/L,有機(jī)溶劑直接用純的試劑作為儲(chǔ)備液. 所有的儲(chǔ)備液均避光室溫保存.

1.2.2 基因重組發(fā)光菌試驗(yàn) 含有30 μg/L硫酸卡那霉素的液體培養(yǎng)基的配制：稱(chēng)取10 g胰蛋白胨、10 g NaCl、5 g酵母粉、1 g葡萄糖溶于1 000 mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH到7. 然后121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min. 待培養(yǎng)基的溫度降到55 ℃時(shí)，加入100 μL 0.3 g/L的硫酸卡那霉素，搖勻備用.

基因重組發(fā)光菌的培養(yǎng)：從冰箱中取一瓶基因重組發(fā)光菌的凍干粉，加入0.5 mL 0.1 mol/L 的KCl溶液，放到搖床中(20 ℃、150 r/min)培養(yǎng)20 min，進(jìn)行菌種的復(fù)蘇. 然后取200 μL菌液接種到50 mL之前準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基中，20 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)24 h. 然后取100 μL培養(yǎng)了24 h的菌液接種到50 mL新的液體培養(yǎng)基中，20 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)24 h.

以白色96微孔板為載體，基因重組發(fā)光菌E.coliHB101 pUCD 607為試驗(yàn)生物，以相對(duì)發(fā)光單位為檢測(cè)信號(hào)，采用微板毒性分析法進(jìn)行EC50的測(cè)定. 將96孔微板的第1列的6個(gè)孔加蒸餾水作為空白對(duì)照，第2～12列設(shè)計(jì)為化合物的11個(gè)質(zhì)量濃度梯度. A～F行為6個(gè)平行，每孔加入150 μL的樣品，用多通道移液器往每一列加入50 μL重新懸浮的基因重組發(fā)光菌. 由于試驗(yàn)暴露的時(shí)間較短，基因重組發(fā)光菌受時(shí)間影響較大，酶標(biāo)儀掃描整塊微板中加有樣品的72孔時(shí)間為36 s，為了減少誤差，加入菌液的時(shí)間控制約36 s. 加入菌液開(kāi)始計(jì)時(shí)，放到酶標(biāo)儀中軌道震蕩15 s，計(jì)時(shí)器到14 min 45 s，點(diǎn)擊酶標(biāo)儀的開(kāi)始按鈕(酶標(biāo)儀有15 s的緩沖時(shí)間)，測(cè)定每一個(gè)微孔的相對(duì)發(fā)光單位. 舍棄發(fā)光值的最高值和最低值，計(jì)算出 4個(gè)空白發(fā)光值的平均值(I0)和樣品每個(gè)質(zhì)量濃度的平均值(I)，按公式(1)計(jì)算出不同物質(zhì)在不同質(zhì)量濃度下對(duì)基因重組發(fā)光菌的抑制率(E)[12]:

E=(I0-I)/I0×100%.

(1)

1.2.3 費(fèi)氏弧菌試驗(yàn) 費(fèi)氏弧菌培養(yǎng)基的配制：稱(chēng)取5 g蛋白胨、0.5 g酵母粉、3 mL甘油、30 g NaCl、6.10 g NaH2PO4·H2O、2.75 g KH2PO4·3H2O、0.204 g MgSO4·7H2O、0.5 g (NH4)2HPO4溶于1 000 mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH到7，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min.

費(fèi)氏弧菌的培養(yǎng)：取一瓶費(fèi)氏弧菌凍干粉加入2 mL培養(yǎng)液室溫復(fù)蘇5 min，將其全部接種到50 mL費(fèi)氏弧菌培養(yǎng)基中，20 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)36 h. 然后取200 μL菌液接種到新的培養(yǎng)基中，20 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)36 h，放到4 ℃冰箱備用. 在測(cè)試過(guò)程中，如果費(fèi)氏弧菌的發(fā)光值超過(guò)酶標(biāo)儀的量程，用2%的NaCl進(jìn)行稀釋.

將96微孔板的第1列的6個(gè)孔作為空白對(duì)照(直接用蒸餾水)，第2～12列設(shè)計(jì)為化合物的11個(gè)質(zhì)量濃度梯度. A～F行為6個(gè)平行，每孔加入150 μL的樣品，用多通道移液器從第1～12列的每一列加入20 μL 20%的NaCl調(diào)節(jié)滲透壓，然后加入30 μL費(fèi)氏弧菌菌液. 后續(xù)的步驟與基因重組發(fā)光菌保持一致.

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)差異性分析在GraphPad Prism 4上進(jìn)行，劑量-效應(yīng)曲線(xiàn)擬合中Sigmoid函數(shù)在GraphPad Prism 4上運(yùn)行，LS-SVM函數(shù)在Matlab上運(yùn)行.

2 結(jié)果與討論

2.1 毒性測(cè)試參照物驗(yàn)證

現(xiàn)行發(fā)光菌毒性測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)方法(GB/T 15441-1995)[13]是以汞離子為毒性參照，然而汞離子為高毒物質(zhì)，對(duì)環(huán)境和試驗(yàn)操作人員有害. 近年來(lái)，研究人員經(jīng)多次篩選，發(fā)現(xiàn)鋅離子易溶、穩(wěn)定且對(duì)人和環(huán)境危害較小，作為陽(yáng)性對(duì)照具有安全、穩(wěn)定等優(yōu)勢(shì)，因此建議選用鋅離子作為發(fā)光菌毒性測(cè)試陽(yáng)性對(duì)照物質(zhì)[14].

為此，本試驗(yàn)選取了上述2種離子作為陽(yáng)性對(duì)照物質(zhì)，對(duì)比了其試驗(yàn)效果. 從表1可知，鋅離子對(duì)基因重組發(fā)光菌的抑制敏感性(EC50)比汞離子大. 從圖1可以看出鋅離子的重現(xiàn)性更好，通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)：鋅離子EC50的變異系數(shù)較小(16.79%)，說(shuō)明鋅離子作為陽(yáng)性對(duì)照物質(zhì)具有較好的穩(wěn)定性.

圖1 陽(yáng)性對(duì)照物質(zhì)鋅離子對(duì)基因重組發(fā)光菌的毒性效應(yīng)

Figure 1 The toxic effects of positive control substance zinc ions on gen recombinant luminescent bacteria

2.2 基因重組發(fā)光菌毒性測(cè)試的靈敏度比較

為檢測(cè)基因重組發(fā)光菌毒性測(cè)試方法的靈敏度，本試驗(yàn)選用環(huán)境中常見(jiàn)的8種重金屬(ZnSO4、CuSO4、FeCl3、HgCl2、MnCl2、CdCl2、CoCl2和K2Cr2O7)為目標(biāo)化合物，對(duì)其測(cè)試靈敏度進(jìn)行比較.

以8種重金屬離子為目標(biāo)化合物，以費(fèi)氏弧菌為受試生物進(jìn)行毒性測(cè)試，用Boltzmann Sigmoidal函數(shù)對(duì)化合物質(zhì)量濃度與費(fèi)氏弧菌發(fā)光抑制率進(jìn)行擬合，得到上述重金屬離子對(duì)應(yīng)的EC50，如表1所示分別為1.978、17.860、5.214、0.150、47.370、18.290、2.898和11.980 mg/L. 以8種重金屬離子為目標(biāo)化合物，以基因重組發(fā)光菌為受試生物進(jìn)行毒性測(cè)試，用Boltzmann Sigmoidal函數(shù)對(duì)化合物質(zhì)量濃度與基因重組發(fā)光菌發(fā)光抑制率進(jìn)行擬合，得到上述重金屬離子所對(duì)應(yīng)的EC50分別為1.203、1.646、1.226、0.659、9.935、8.718、1.045和10.550 mg/L.

表1 8種重金屬對(duì)費(fèi)氏弧菌和基因重組發(fā)光菌的劑量-效應(yīng)曲線(xiàn)擬合信息

注：a、b和c分別表示Boltzmann Sigmoidal的擬合參數(shù)，EC50表示半數(shù)效應(yīng)質(zhì)量濃度，R2表示相關(guān)系數(shù)的平方.

通過(guò)比較重金屬對(duì)費(fèi)氏弧菌和基因重組發(fā)光菌的毒性作用，結(jié)果表明：以基因重組發(fā)光菌為受試生物的毒性測(cè)試結(jié)果(EC50)比費(fèi)氏弧菌靈敏度更高. 如圖2所示，在銅離子、錳離子、鐵離子和鎘離子的毒性作用方面，基因重組發(fā)光菌和費(fèi)氏弧菌EC50之間存在顯著性差異(P<0.05)，表明基因重組發(fā)光菌在毒性測(cè)試方面具有較高的靈敏度. 不同重金屬對(duì)同種細(xì)菌的毒性差異以及同種重金屬對(duì)不同細(xì)菌的毒性差異主要取決于以下3點(diǎn): (1)受試生物的敏感性；(2)不同重金屬的生物可利用性；(3)重金屬離子毒性的表達(dá)能力，即與水中其它陰離子絡(luò)合能力[15].

圖2 8種重金屬對(duì)基因重組發(fā)光菌和費(fèi)氏弧菌的毒性比較

Figure 2 The comparison of the toxicity of eight heavy metals to gene recombinant luminescent bacteria andVibriofischeri

2.3 應(yīng)用重組發(fā)光菌對(duì)有機(jī)溶劑和“綠色溶劑”進(jìn)行毒性測(cè)試

離子液體是指在室溫或者室溫附近溫度下呈液體狀態(tài)的物質(zhì)，主要由陰離子和陽(yáng)離子2部分構(gòu)成，具有蒸汽壓較低、熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性較高、導(dǎo)電性較高、熱容量較大等特點(diǎn)[16]，與一般的有機(jī)溶劑相比，離子液體不具有揮發(fā)性，對(duì)大氣環(huán)境的影響很小. 基于這些特點(diǎn)，綠色化學(xué)的研究者認(rèn)為：離子液體可作為揮發(fā)性有機(jī)溶劑的替代物. 然而，近年來(lái)有研究表明：離子液體的大規(guī)模使用也會(huì)對(duì)水環(huán)境造成很大的危害[17]. 鑒于此，本試驗(yàn)比較了6種常用的有機(jī)溶劑和6種不同烷基鏈長(zhǎng)度的離子液體對(duì)重組發(fā)光菌的毒性效應(yīng).

結(jié)果表明：6種有機(jī)溶劑對(duì)基因重組發(fā)光菌的毒性效應(yīng)中，只有甲醛對(duì)基因重組發(fā)光菌的劑量-效應(yīng)曲線(xiàn)是經(jīng)典的S-型曲線(xiàn)(圖3)，其他5種有機(jī)溶劑均存在hormesis效應(yīng)，與之前學(xué)者的研究結(jié)果一致[18-20]. 從毒性數(shù)據(jù)可以看出，相比之下二甲基亞砜的EC50最大(表2)，說(shuō)明其對(duì)發(fā)光細(xì)菌的毒性最小. 甲醛對(duì)發(fā)光細(xì)菌的毒性效應(yīng)最大，EC50達(dá)到5.122 g/L(表2). 從甲醇對(duì)基因重組發(fā)光菌的毒性效應(yīng)可以看出，甲醇對(duì)基因重組發(fā)光菌的EC50為36.120 g/L，隨著暴露質(zhì)量濃度的降低，發(fā)光抑制率逐漸減小. 當(dāng)甲醇的暴露質(zhì)量濃度達(dá)到10.110 g/L時(shí)，隨著處理質(zhì)量濃度的降低，甲醇對(duì)基因重組發(fā)光菌產(chǎn)生刺激作用，在處理質(zhì)量濃度達(dá)到2.319 g/L時(shí)，刺激效應(yīng)最強(qiáng)(-65.36%). 乙醇、丙酮、二甲基亞砜和乙腈對(duì)發(fā)光菌的劑量-效應(yīng)曲線(xiàn)與甲醇類(lèi)似，在較低劑量下均存在刺激效應(yīng). 其零點(diǎn)效應(yīng)質(zhì)量濃度分別為54.050、26.050、122.500、38.700 g/L，最大刺激效應(yīng)濃度為9.246、4.687、12.890、11.510 g/L(表2). 據(jù)報(bào)道，有機(jī)溶劑乙腈、甲醇、乙醇和丙酮對(duì)發(fā)光細(xì)菌-青海弧菌Q67的EC50值分別為36.530、71.730、79.630、46.580 g/L[18]，本研究的基因重組發(fā)光菌對(duì)于以上4種有機(jī)溶劑的EC50分別為47.880、36.120、52.140、10.270 g/L，相對(duì)于甲醇、乙醇、丙酮，基因重組發(fā)光菌比青?；【鶴67靈敏性高，而相對(duì)于乙腈，青?；【鶴67靈敏性更高，可能是由2種菌自身的內(nèi)部條件所決定的，有待更進(jìn)一步的研究.

關(guān)于有機(jī)溶劑在低劑量下對(duì)基因重組發(fā)光菌產(chǎn)生刺激作用，研究人員主要存在2種觀(guān)點(diǎn)：一種是有機(jī)溶劑在低劑量下誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)NADH氧化酶，使細(xì)菌分裂加速，發(fā)光強(qiáng)度增加；另一種是低劑量下有機(jī)溶劑引起發(fā)光細(xì)菌DNA突變而影響發(fā)光[21].

表2 6種有機(jī)溶劑對(duì)基因重組發(fā)光菌的劑量-效應(yīng)曲線(xiàn)擬合信息

注：ZEC表示零效應(yīng)點(diǎn)質(zhì)量濃度，EC表示最大刺激效應(yīng)點(diǎn)質(zhì)量濃度，EC50表示半數(shù)效應(yīng)質(zhì)量濃度，R2表示相關(guān)系數(shù)的平方，表3同.

研究表明(圖4)：6種不同烷基鏈長(zhǎng)度的咪唑氯鹽離子液體對(duì)重組發(fā)光細(xì)菌的毒性效應(yīng)中，IM-2在處理質(zhì)量濃度低于22.010 g/L時(shí)存在刺激效應(yīng)，隨著處理質(zhì)量濃度的降低，刺激效應(yīng)在4.687 g/L時(shí)達(dá)到最大. 其他5種離子液體對(duì)基因重組發(fā)光菌的劑量-效應(yīng)曲線(xiàn)均是經(jīng)典的S-型(圖4). 烷基鏈上碳原子個(gè)數(shù)從4～12，其相對(duì)應(yīng)的EC50分別為9.131、0.219、0.012、0.024和0.016 g/L(表3).

隨著咪唑氯鹽離子液體烷基鏈長(zhǎng)度的增加，其毒性效應(yīng)存在增加的趨勢(shì)，表現(xiàn)出明顯的烷基鏈-效應(yīng)關(guān)系. 通過(guò)對(duì)烷基鏈上碳原子個(gè)數(shù)與其對(duì)應(yīng)的EC50進(jìn)行分析，可以發(fā)現(xiàn)烷基鏈-效應(yīng)關(guān)系符合S-型曲線(xiàn)，且呈現(xiàn)顯著的相關(guān)性(R2=1.000). 研究表明:離子液體隨著烷基鏈長(zhǎng)度的增加，對(duì)大腸桿菌的存活率的影響越來(lái)越大，離子液體能夠損傷細(xì)胞膜，影響細(xì)胞膜的通透性，使得胞內(nèi)細(xì)胞器和生物大分子外泄，從而抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)[22].

圖4 6種不同烷基鏈長(zhǎng)度離子液體對(duì)基因重組發(fā)光菌的劑量-效應(yīng)曲線(xiàn)

表3 6種離子液體對(duì)基因重組發(fā)光菌的劑量-效應(yīng)曲線(xiàn)擬合信息

綜上所述，通過(guò)對(duì)咪唑氯鹽離子液體和常見(jiàn)有機(jī)溶劑進(jìn)行EC50比較發(fā)現(xiàn):有機(jī)溶劑的EC50比離子液體的值大(P<0.05)，說(shuō)明離子液體對(duì)發(fā)光菌的毒性顯著高于有機(jī)溶劑(圖5)，具有較強(qiáng)的毒性作用. 作為有機(jī)溶劑替代物的“綠色溶劑”可能存在潛在的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn).

圖5 有機(jī)溶劑和離子液體對(duì)基因重組發(fā)光菌的毒性比較

Figure 5 The comparison of toxicity of organic solvents and ionic liquids to gene recombinant luminescent bacteria

3 結(jié)論

(1)因鋅離子對(duì)環(huán)境污染較小以及穩(wěn)定性較高，基因重組發(fā)光菌毒性測(cè)試以鋅離子代替汞離子作為陽(yáng)性對(duì)照，具有一定的可行性.

(2)通過(guò)對(duì)基因重組發(fā)光菌和費(fèi)氏弧菌毒性測(cè)試靈敏度的比較發(fā)現(xiàn)，基因重組發(fā)光菌具有較高的靈敏度和穩(wěn)定性.

(3)通過(guò)對(duì)咪唑氯鹽離子液體和常見(jiàn)有機(jī)溶劑進(jìn)行EC50比較發(fā)現(xiàn)，離子液體對(duì)基因重組發(fā)光菌的毒性效應(yīng)顯著高于常用有機(jī)溶劑.