CⅡTA表達(dá)與喉鱗狀細(xì)胞癌（LSCC）患者預(yù)后的關(guān)系

薛 乙 湯 迪 翟長文 袁存存 衡 宇 周 梁 陶 磊△ 路麗明

（1復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院耳鼻喉科，2病理科 上海 200031；3上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫研究所 上海 200025）

喉癌是頭頸部腫瘤中最常見的類型［1］。喉癌中最常見的病理類型是喉鱗狀細(xì)胞癌（laryngeal squamous cell carcinoma，LSCC），約占 96%［2］。喉癌的主要病因是吸煙、飲酒、老年和男性［3-4］。目前LSCC的治療方法主要有手術(shù)、放療和化療等，盡管診療手段不斷提高，但在過去40年LSCC術(shù)后5年的生存率并無明顯改善［5］。因此迫切需要探索新的治療方法或預(yù)測LSCC術(shù)后與預(yù)后相關(guān)的生物學(xué)指標(biāo)，為治愈或延緩進(jìn)展提供新的策略。

MHC-Ⅱ類反式激活蛋白（classⅡtrans-activator，CⅡTA）屬于NOD樣受體家族成員，是參與機(jī)體炎癥反應(yīng)的主要成分［6］。炎癥是參與腫瘤形成的重要因素之一［7］。CⅡTA是調(diào)節(jié)MHC-Ⅱ分子調(diào)控的主控開關(guān)，也是IFN-γ激活MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ分子轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵基因［8］。CⅡTA所調(diào)控的 MHC-Ⅰ/Ⅱ分子的表達(dá)水平與頭頸部腫瘤免疫逃逸機(jī)制有密切的關(guān)系，表明CⅡTA在腫瘤免疫調(diào)節(jié)中的重要性［9］。MHC-Ⅱ分子高表達(dá)的腫瘤通常預(yù)后較好，如非小細(xì)胞性肺癌［10］、肝鱗狀細(xì)胞癌［11］等，而CⅡTA表達(dá)與腫瘤預(yù)后關(guān)系的研究較少，然而最近研究發(fā)現(xiàn)CⅡTA高表達(dá)的腫瘤與較好的預(yù)后相關(guān)［11-12］，這引起了我們對CⅡTA表達(dá)水平與LCCC預(yù)后關(guān)系進(jìn)行探索性研究。

關(guān)于CⅡTA表達(dá)與LSCC患者預(yù)后關(guān)系的研究國內(nèi)外尚未見報(bào)道。本研究結(jié)合CⅡTA在LSCC組織的表達(dá)水平與LSCC患者臨床特征進(jìn)行相關(guān)性分析，并對CⅡTA表達(dá)水平與LSCC患者的預(yù)后進(jìn)行初步研究，以期對LSCC的診療或預(yù)后評估提供新的思路。

資料和方法

臨床資料本研究經(jīng)復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)（編號KJ200801），所有患者均簽署知情同意書。收集我院2013年9月至2015年6月收治的80例喉癌患者術(shù)后的腫瘤組織樣本并制作成組織芯片。入組標(biāo)準(zhǔn)：（1）首次行腫瘤根治性手術(shù)，且術(shù)前未接受過放療、化療；（2）確診為喉鱗狀細(xì)胞癌（術(shù)后病理）；（3）隨訪和臨床病例資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）喉非鱗狀細(xì)胞癌（神經(jīng)內(nèi)分泌癌，腺癌，梭形細(xì)胞癌等）；（2）伴有其他腫瘤病史；（3）伴有全身系統(tǒng)性疾病病史（系統(tǒng)性紅斑狼瘡，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等）。根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)，排除非鱗狀細(xì)胞癌4例，伴有其他腫瘤1例，失訪5例，術(shù)前放療患者3例，最終納入67例。喉癌的TNM臨床分期參考第8版美國癌癥協(xié)會（American Joint Committee on Cancer，AJCC）制定的標(biāo)準(zhǔn)。吸煙和飲酒人群的界定為：吸煙≥20支/天（持續(xù)時(shí)間≥1年）；飲酒≥200 mL/d（持續(xù)時(shí)間≥1年）。目前已經(jīng)戒煙/戒酒的人群（曾經(jīng)吸煙/飲酒），統(tǒng)計(jì)為有吸煙史/飲酒史。隨訪終止時(shí)間為2018年10月16日，隨訪終止或患者死亡為觀察終止時(shí)間，總生存期（overall survival，OS）為LSCC術(shù)后到觀察終止時(shí)間。

免疫組化免疫組化主要試劑：一抗，兔抗人多克隆CⅡTA抗體（美國Novus公司，NBP2-59072）；二抗，HRP山羊抗兔（中國Beyotime公司，A0208）；山羊血清（英國Abcam公司，ab7481）。參考CⅡTA免疫組織化步驟，完成實(shí)驗(yàn)。首先，二甲苯浸泡脫蠟，梯度酒精（100%、95%、70%、50%）脫水各5 min；封閉內(nèi)源性過氧化物酶（3%H2O2，15 min），PBS漂洗 3遍（5 min/遍）；抗原修復(fù)，抗原修復(fù)液（ddH2O：檸檬酸鈉緩沖液=100∶1），微波爐（高火10 min，解凍2 min，中火7 min），待恢復(fù)至室溫取出；加入一抗（1∶300山羊血清稀釋；對照組加入PBS）；4℃過夜；16 h后取出：依次用PBST、PBS漂洗（均為3遍，5 min/遍）；加入二抗（1∶50山羊血清稀釋）；PBS漂洗3次（每次5 min），DAB顯色5 min左右，顯微鏡檢查染色情況，蘇木素復(fù)染，進(jìn)行后續(xù)處理，封片。

免疫組化結(jié)果分析光學(xué)顯微鏡下觀察位點(diǎn)染色情況，選取3個(gè)不同的視野，按照染色程度與面積計(jì)算染色的強(qiáng)弱，每次評分均由2位病理科醫(yī)師雙盲獨(dú)立完成，且由第3位病理科醫(yī)師復(fù)評以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。染色強(qiáng)度評分：0（-），1（+），2（++），3（+++）。染色面積評分：0（0），1（1%～25%），2（26%～50%），3（51%～75%），4（76%～100%）。根據(jù)染色面積乘以染色強(qiáng)度的結(jié)果分為：CⅡTA低表達(dá)組（0～6分）；CⅡTA高表達(dá)組（7～12分）。LSCC的腫瘤/間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)，均可認(rèn)為CⅡTA表達(dá)陽性。

GEPIAGEPIA是一種新開發(fā)的網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器，基于癌癥基因數(shù)據(jù)庫（TCGA）和基因組織表達(dá)數(shù)據(jù)庫（GTEx），且有腫瘤（9 736個(gè)）和正常樣本（8 587個(gè)）的RNA測序表達(dá)數(shù)據(jù)。GEPIA（http：//gepia.cancer-pku.cn/）可提供多種功能［13］，如腫瘤患者生存分析、類似基因的檢測以及某種基因在腫瘤或正常組織表達(dá)的差異性分析等。利用GEPIA分析CⅡTA的表達(dá)與頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（head and neck squanmous cell carcinoma，HNSCC）患者預(yù)后的關(guān)系。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 23.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。用χ2檢驗(yàn)分析CⅡTA的表達(dá)水平與LSCC患者臨床特征的關(guān)系。用Kaplan-Meier法分析LSCC患者術(shù)后5年的OS，Log-rank檢驗(yàn)計(jì)算P值。對CⅡTA表達(dá)情況、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素進(jìn)行Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型多因素回歸分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

LSCC癌組織中CⅡTA表達(dá)水平與患者臨床特征的關(guān)系本次研究共納入67例患者（男性66例，女性1例），年齡38～84歲，平均61歲。根據(jù)免疫組化結(jié)果，分為CⅡTA高表達(dá)組（圖1A）和低表達(dá)組（圖1B）。對CⅡTA的表達(dá)與患者年齡、性別、吸煙、飲酒、臨床分期、喉癌分型、腫瘤大小等臨床特征的關(guān)系進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示CⅡTA的表達(dá)水平與LSCC患者臨床特征的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表1）。

圖1 LSCC腫瘤組織中CⅡTA的免疫組化結(jié)果Fig 1 IHC results of CⅡTA in LSCC tumor tissues

COX回歸多因素分析結(jié)果本研究將CⅡTA的表達(dá)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、飲酒等臨床指標(biāo)納入COX多因素回歸模型，結(jié)果顯示飲酒、CⅡTA的表達(dá)水平、腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與LSCC患者術(shù)后生存時(shí)間密切相關(guān)（表2）。飲酒、CⅡTA的表達(dá)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均為LSCC術(shù)后OS的獨(dú)立影響因素。

LSCC癌組織中CⅡTA表達(dá)水平與預(yù)后的關(guān)系67例LSCC患者，死亡33例，生存34例。CⅡTA高表達(dá)組41例，平均生存時(shí)間（49.3±2.6）個(gè)月，5年生存率為41.5%（24/41）；CⅡTA低表達(dá)組26例，平均生存時(shí)間（35.3±3.9）個(gè)月，5年生存率為38.5%（10/26）。Kaplan-Meier法分析LSCC患者術(shù)后5年的OS結(jié)果顯示，CⅡTA高表達(dá)比CⅡTA低表達(dá)的患者預(yù)后好（圖2A，P＜0.05）。

TCGA數(shù)據(jù)庫CⅡTA表達(dá)與HNSCC預(yù)后的關(guān)系運(yùn)用TCGA數(shù)據(jù)庫對CⅡTA的表達(dá)與HNSCC的預(yù)后進(jìn)行分析，可結(jié)合CⅡTA表達(dá)與LSCC預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行與之對比分析。結(jié)果顯示，HNSCC患者中CⅡTA高表達(dá)組比低表達(dá)組預(yù)后好（圖2B，P＜0.05）。

表2 多變量Cox比例回歸生存分析Tab 2 Multivariate Cox proportional regression survival analysis

圖2CⅡTA與LSCC/HNSCC預(yù)后的關(guān)系Fig 2 Relationship between CⅡTA and prognosis of LSCC/HNSCC

討 論

隨著MHC-Ⅰ/Ⅱ分子在腫瘤免疫逃逸的作用及機(jī)制的研究不斷明確，人們逐步認(rèn)識到CⅡTA在腫瘤免疫的重要性。CⅡTA基因的缺陷會導(dǎo)致裸淋巴細(xì)胞綜合征［14］，而CⅡTA分子的表達(dá)異常與頭頸部鱗狀細(xì)胞癌［15］、原發(fā)性縱隔大 B 細(xì)胞淋巴瘤［16］等疾病發(fā)生相關(guān)。Yazawa等［17］認(rèn)為腫瘤細(xì)胞表達(dá)的MHC-Ⅱ分子可以將抗原肽呈遞給輔助性T淋巴細(xì)胞，有助于抗腫瘤免疫反應(yīng)。最近有研究認(rèn)為CⅡTA在不同腫瘤組織中的表達(dá)，其預(yù)后也不盡相同［12，18］，這為探索CⅡTA表達(dá)與腫瘤的關(guān)系提供了一定的研究基礎(chǔ)。我們對CⅡTA分子表達(dá)水平與LSCC患者術(shù)后預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行了初步的研究。

CⅡTA可在多種腫瘤組織中表達(dá)，如三陰性乳腺癌［12］、原發(fā)性縱隔大 B細(xì)胞淋巴瘤［16］、脂肪肉瘤［19］等。根據(jù)IHC結(jié)果，我們分析認(rèn)為CⅡTA在LSCC的腫瘤細(xì)胞以及部分腫瘤間質(zhì)細(xì)胞中均有表達(dá)。并將CⅡTA表達(dá)情況分為高表達(dá)組（圖1A）和低表達(dá)組，對CⅡTA的表達(dá)水平與LSCC的臨床特征進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果可能與研究樣本量的多少有關(guān)，值得進(jìn)一步研究。盡管CⅡTA表達(dá)與LSCC臨床特征的分析無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型多因素回歸分析結(jié)果顯示飲酒、CⅡTA表達(dá)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是LSCC術(shù)后生存時(shí)間的獨(dú)立影響因素（P＜0.05），這表明LSCC的發(fā)生可能是一個(gè)復(fù)雜的多因素結(jié)果。

Kaplan-Meier法對LSCC術(shù)后5年的生存分析顯示，CⅡTA高表達(dá)比低表達(dá)的LSCC患者術(shù)后預(yù)后好，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Xie等［11］研究認(rèn)為，肝鱗狀細(xì)胞癌腫瘤組織中CⅡTA高表達(dá)經(jīng)常伴有MHC-Ⅱ分子的表達(dá)，且術(shù)后的無進(jìn)展生存期更長。Forero等［12］在對三陰性乳腺癌患者術(shù)后長達(dá)11年的隨訪后認(rèn)為，CⅡTA高表達(dá)的三陰性乳腺癌有較好的預(yù)后，CⅡTA表達(dá)是三陰性乳腺癌術(shù)后無進(jìn)展生存期的獨(dú)立預(yù)后因素。我們推測CⅡTA高表達(dá)的LSCC患者預(yù)后較好可能與MHC-Ⅱ分子的表達(dá)增加相關(guān)，其在LSCC腫瘤微環(huán)境中增強(qiáng)一系列的免疫應(yīng)答反應(yīng)，加強(qiáng)機(jī)體對腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。我們運(yùn)用GEPIA數(shù)據(jù)庫分析CⅡTA的mRNA水平對HNSCC患者的預(yù)后價(jià)值，對研究結(jié)果進(jìn)行輔助性驗(yàn)證，結(jié)果顯示CⅡTA高表達(dá)組比低表達(dá)組預(yù)后好，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

然而，有研究認(rèn)為CⅡTA的表達(dá)可能是增加腫瘤患者死亡風(fēng)險(xiǎn)的重要因素。Tan等［18］認(rèn)為CⅡTA表達(dá)升高能夠增加腎透明細(xì)胞癌的死亡風(fēng)險(xiǎn)，CⅡTA的過表達(dá)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞表達(dá)MHC-Ⅱ分子參與免疫反應(yīng)，加劇機(jī)體的免疫炎癥反應(yīng)而導(dǎo)致癌癥進(jìn)展加快。CⅡTA表達(dá)水平與腫瘤預(yù)后的關(guān)系不同，這可能與CⅡTA分子所處的腫瘤微環(huán)境不同密切相關(guān)，以至于CⅡTA在不同腫瘤類型發(fā)揮的作用可能不同，仍待進(jìn)一步的研究和探討。本研究仍有許多局限性：納入的臨床病例樣本量不夠大；納入的女性LSCC病例數(shù)相對較少；隨訪時(shí)間不夠長。

總之，CⅡTA作為調(diào)控MHC-Ⅱ分子表達(dá)的關(guān)鍵基因，在參與腫瘤免疫調(diào)控中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果顯示CⅡTA高表達(dá)的LSCC患者比低表達(dá)者預(yù)后好（OS）。本研究結(jié)果提示CⅡTA表達(dá)水平可能對LSCC患者術(shù)后診療及預(yù)后的預(yù)測有一定的參考意義。