肝癌免疫耐受機制研究進展

張 鋒（綜述） 殷 欣（審校）

（復(fù)旦大學附屬中山醫(yī)院肝癌研究所 上海 200032）

原發(fā)性肝癌是臨床面對的一個難題，目前其發(fā)病率在世界范圍排名第六，死亡率在所有惡性腫瘤中排名第三［1］。肝癌是一種典型的炎癥驅(qū)動的腫瘤，其往往由長期的慢性肝炎、肝硬化發(fā)展而來［2］。在危險因素如乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）或丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染、黃曲霉素B1暴露、過度飲酒、非酒精性脂肪肝的作用下，肝臟產(chǎn)生持續(xù)的炎癥反應(yīng)（包括持續(xù)的氧化應(yīng)激、肝細胞壞死和再生以及纖維改變），而這些事件都通過體細胞基因遺傳變異以及表觀遺傳修飾的累積，導致肝癌的發(fā)生發(fā)展［3］。

對于早期肝癌，我們常常采用射頻消融、手術(shù)切除、肝移植的方法［4］。而對于不能手術(shù)切除的晚期肝癌，分子靶向藥物如索拉菲尼、樂伐替尼（一線）以及瑞格非尼（二線）均被證明可以顯著延長患者生存期（overall survival，OS）和腫瘤進展時間（time to progress，TTP）［1］。然而，現(xiàn)有的肝癌治療策略仍然不能有效控制進展期肝癌并防止其復(fù)發(fā)，這些現(xiàn)實情況都迫切要求我們發(fā)展新的肝癌治療策略。

在這樣的背景下，近年來，免疫治療逐漸成為基礎(chǔ)及臨床研究的熱點。肝癌能夠通過多種機制誘導腫瘤免疫耐受，逃避機體免疫殺傷，最終不斷進展并轉(zhuǎn)移。因此，探索肝癌誘導機體免疫耐受的機制并制定針對性的免疫治療策略，是未來肝癌治療領(lǐng)域新的發(fā)展方向。本文將對肝癌誘導腫瘤免疫耐受的機制進行總結(jié)，從而為肝癌的抗腫瘤免疫治療提供新思路。

免疫耐受機制在肝癌免疫耐受的形成過程中，發(fā)揮主要作用的成分包括：（1）細胞成分；調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory T cells，Tregs）、髓系衍生抑制細胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）、樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）、腫瘤相關(guān)巨噬細胞（tumor-associated macrophages，TAMs）等；（2）抑制性細胞因子；轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor，TGF-β）、白細胞介素-10（interleukin-10，IL-10）等；（3）免疫檢查點受體；程序性死亡受體-1（programmed cell death protein-1，PD-1）、細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)蛋白-4（cytotoxic T-lymphocyteassociated protein-4，CTLA-4）、淋巴細胞活化基因-3（lymphocyte activation gene-3，LAG-3）、黏蛋白分子-3（T-cell immunoglobulin mucin-3，Tim-3）等。

調(diào)節(jié)性T細胞（Tregs） Tregs是一群以顯著免疫抑制功能為特點、參與維持免疫穩(wěn)態(tài)的細胞。這群細胞特征性地表達CD 25（IL-2受體α鏈）、CD4［5］。而后研究者又發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子FoxP3的穩(wěn)定表達可作為人類或小鼠Tregs更為特異的標志［6］。盡管如此，在機體發(fā)生免疫應(yīng)答時除Tregs之外的一些T細胞也可以表達CD25。而Foxp3也被發(fā)現(xiàn)可以在一些人類效應(yīng)T細胞上短暫表達。因此，用CD4、CD25和Foxp3來對人類Tregs進行分析仍存在一定不準確性。

盡管Tregs在維持機體免疫穩(wěn)態(tài)方面不可或缺，但在惡性腫瘤條件下，它們可以抑制機體的抗腫瘤免疫并促進腫瘤進展［7-8］。在肝癌患者腫瘤組織以及外周血中，我們都觀察到了Tregs濃度的升高，而這些Tregs也被證明能夠損害CD8+T細胞的功能［9］。此外，Gao等［10］運用多因素回歸分析證明，肝癌組織高濃度Tregs合并低濃度CD8+T細胞是患者生存及復(fù)發(fā)的獨立影響因素。近年，隨著單細胞RNA測序技術(shù)的發(fā)展，有研究指出肝癌組織浸潤的Tregs的T細胞抗原受體序列（T cell receptor，TCR）序列基本不同于其他CD4+細胞，而在肝癌組織浸潤的功能受損的CD8+T細胞中，約37%擁有和其他肝臟浸潤CD8+T細胞同源的TCR序列［11］，這也證明了肝癌組織中升高的Tregs大部分源自外周，而功能受損CD8+T細胞多半起源于肝內(nèi)。這些發(fā)現(xiàn)均為進一步針對肝癌患者免疫治療的研究提供了新思路。

在肝癌患者中，Tregs主要通過以下機制誘導免疫耐受的形成：（1）Tregs高表達IL-2受體α鏈（CD25），大量消耗IL-2，使效應(yīng)T細胞相對缺乏IL-2的刺激，從而抑制增殖、促進凋亡；（2）通過非接觸依賴機制如分泌抑制性細胞因子IL-10、TGF-β、IL-35來抑制效應(yīng) T 細胞的抗腫瘤免疫應(yīng)答［12］；（3）通過共抑制分子CTLA-4的表達使T細胞激活受阻［13］；（4）通過顆粒酶 B發(fā)揮細胞溶解作用，觸發(fā)免疫效應(yīng)細胞的凋亡［14］；（5）通過表達 CD39、CD73來促進腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）轉(zhuǎn)變?yōu)橄佘眨佘湛梢砸种菩?yīng)T細胞的功能［15］；（6）通 過 吲 哚 胺 2，3雙 加 氧 酶（indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO）抑制效應(yīng)T細胞的功能［16］。

髓系衍生抑制細胞（MDSCs） MDSCs是從骨髓起源的、不成熟的、具有異質(zhì)性的一類細胞。其幾乎能在所有類型腫瘤以及感染、自身免疫性疾病、外傷等病理條件下被誘導增多。根據(jù)其表型和形態(tài)學特點，主要分為多形核（polymorphonuclear-MDSCs，PMN-MDSCs）、單 核 系（monocytic-MDSCs，M-MDSCs）和 早 期 階 段 MDSCs（early stage-MDSCs，eMDSCs）［17］。 越 來 越 多 的 研 究 證明，這些MDSCs不僅在表型和形態(tài)上有所區(qū)別，還有著各自獨特的功能和生化特點，在不同病理條件下扮演不同的角色。但是，現(xiàn)有的亞類之間仍存在部分重疊，因此研究者仍需對MDSCs進行更為細致的分析，才能對其更好地進行鑒定。

在健康肝臟，衰老肝細胞通過CCR2（C-C motifchemokinereceptor2）-CCL2（C-C motif chemokine receptor 2）信號招募 MDSCs［18］，而這些MDSCs可以分化為巨噬細胞并阻礙肝癌發(fā)生。但在肝癌進展時，MDSCs失去分化能力并通過多種機制損害機體抗腫瘤免疫，其被多個研究證明是肝癌患者預(yù)后以及術(shù)后復(fù)發(fā)的重要影響因素［19-20］。

在肝癌患者，MDSCs已被證明可以通過如下機制損害效應(yīng)T細胞以及自然殺傷細胞（natural killer cell，NK）的功能：（1）通過表達更高的精氨酸酶活性，耗竭T細胞功能所需L-精氨酸、L-半胱氨酸來抑制 T 細胞功能［21］；（2）產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS）和 活 性 氮（reactive oxygen species，RNS）。這些活性成分通過下調(diào)T細胞TCR鏈的表達、損害IL-2受體信號通路、干擾TCR和主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）的相互作用從而抑制T細胞功能［22］；（3）誘導 CD4+CD25+Foxp3+Tregs擴增，間接抑制效應(yīng) T 細胞的功能［23］；（4）促進肝巨噬細胞程序性死亡受體-配體1（programmed cell deathligand 1，PD-L1）表達，抑制 T 細胞功能［24］；（5）通過NK p30受體來抑制NK細胞的細胞毒性和細胞因子的釋放［25］。

樹突狀細胞（DCs） DCs是專業(yè)抗原呈遞細胞（antigen presenting cells，APCs）的一種，幾乎在所有組織中存在。由于其能夠同時調(diào)控免疫應(yīng)答及免疫耐受，故在調(diào)節(jié)免疫方面扮演著非常重要的角色［26］。DCs是一個具有異質(zhì)性的群體，主要組成為：（1）漿細胞樣樹突狀細胞（plasmacytoid dendritic cells，pDCs），具有分泌大量1型干擾素的功能，因此經(jīng)?；钴S在抗病毒免疫的第一線［27］；（2）經(jīng)典樹突狀細胞（classical dendritic cells，cDCs），又可分為cDC1、cDC2［28］，由不同的骨髓祖細胞分化而來［29］，它們能夠特異性激活細胞毒性反應(yīng)以及輔助性T細胞 17（T helper cell 17，Th17）或 Th2 應(yīng)答［30-31］；（3）在腫瘤背景下，往往還存在另一種亞群單核細胞衍生 樹 突 狀 細 胞（monocyte-derivedDCs，Mo-DCs）［32］，這些細胞和 TAMs緊密相關(guān)，并往往具有致免疫耐受的能力［33］。一篇涉及18 000多位腫瘤患者、39種不同類型腫瘤的meta分析證明腫瘤的預(yù)后不僅取決于DCs的成熟和激活狀態(tài)，還與其亞群組成有關(guān)［34］。

在肝癌患者，我們通常將這部分在肝癌免疫微環(huán)境中發(fā)揮免疫抑制作用的DCs亞群稱為調(diào)節(jié)性DCs。調(diào)節(jié)性DCs不是指特定的細胞群體，而是具有異質(zhì)性的具有免疫抑制功能的DCs的總稱。有報道稱，在肝癌早期到進展期的過程中，DCs往往會從免疫激活的狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槊庖咭种频臓顟B(tài)［35］。

調(diào)節(jié)性DCs誘導肝癌免疫耐受的機制包括：（1）腫瘤抗原呈遞能力降低以及不成熟的DCs表型如低表達的共刺激分子和 MHC分子［36］；（2）通過分泌IL-10誘導FcγRIIlo/-B細胞激活從而抑制T細胞功能［37］，此外也能促進 CD4+T 細胞分泌 IL-10［38］；（3）Song等［39］證明 TGF-β可以刺激 DCs向調(diào)節(jié)性DCs轉(zhuǎn)變，并通過上調(diào)PD-L1表達、促進效應(yīng)T細胞凋亡以及Tregs生成來誘導肝癌免疫耐受形成；（4）表達免疫檢查點分子如PD-L1、PD-L2，通過與T細胞表面PD-1結(jié)合傳遞抑制信號，在小鼠模型上研究者證明通過阻斷DCs表面PD-L1可以提高DCs觸發(fā) T 細胞免疫應(yīng)答的能力［40］；（5）通過色氨酸代謝酶IDO1/IDO2耗效應(yīng)T細胞所需氨基酸，從而抑制效應(yīng)T細胞功能［41］。

腫瘤相關(guān)巨噬細胞 我們通常把在腫瘤區(qū)域浸潤的巨噬細胞稱為TAMs?，F(xiàn)已證明，TAMs能夠促進腫瘤細胞增殖、血管生成、侵襲及轉(zhuǎn)移，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色［42］。根據(jù)巨噬細胞平衡理論，TAMs擁有兩種不同的表型：經(jīng)典激活的巨噬細胞（M1）是由Th1分泌細胞因子干擾素-γ（interferon-γ，INF-γ）或脂多糖（lipopolysaccharides，LPSs）等微生物抗原激活的，它們通過釋放氧自由基或毒性介質(zhì)發(fā)揮經(jīng)典的細胞毒性作用；而選擇性激活的巨噬細胞（M2）抗原呈遞能力很低，通常由Th2分泌的細胞因子 IL-4、IL-13、TGF-β或糖皮質(zhì)激素誘導產(chǎn)生，可以減輕炎癥從而促進組織修復(fù)［43］。

在肝癌患者，肝癌細胞可以通過分泌血管內(nèi)皮生 長 因 子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、血小板衍生生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF）、TGF-β、CCL-2、巨噬細胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factor，M-CSF）募集并激活 TAMs［43］。此外，肝癌細胞表面磷脂酰肌醇聚糖-3的表達也被證明參與了對TAMs的招募［44］。越來越多的研究證據(jù)表明，肝癌組織TAMs通常表現(xiàn)為M2表型并和患者不良預(yù)后［45］以及腫瘤侵襲性［46］相關(guān)。

TAMs誘導肝癌免疫耐受的機制包括：（1）產(chǎn)生TGF-β、IL-10，并誘導腫瘤周圍間質(zhì)單核細胞表面 PD-L1 的表達，從而抑制細胞毒性反應(yīng)［47］；（2）Gordon 等［48］發(fā)現(xiàn) TAMs表面也表達 PD-1，通過與PD-L1結(jié)合可以下調(diào)TAMs吞噬活性，但該機制是否在肝癌中同樣扮演重要角色還需進一步的研究；（3）TAMs產(chǎn)生的前列腺素 E2（prostaglandin E2，PGE2）、IL-10、IDO 可以誘導 Tregs產(chǎn)生［49］，而趨化因子 CCL17、CCL18、CCL22可以誘導 Tregs的聚集［43］，從而間接抑制抗腫瘤免疫。

其他細胞成分 腫瘤相關(guān)成纖維細胞（cancerassociated fibroblasts，CAFs）、肝星形細胞（hepatic stellate cells，HSCs）和內(nèi)皮細胞（endothelial cells，ECs）也參與了肝癌免疫耐受微環(huán)境的形成。其中HCC 相關(guān) CAFs（1）通過釋放 PGE2、IDO 來誘導NK 細胞功能紊亂［50］；（2）通過 IL-6-STAT3通路來促進調(diào)節(jié)性 DCs的產(chǎn)生［41］；（3）通過分泌 IL-6、基質(zhì)細胞衍生因子-1（stromal cell derived factor-1，SDF-1）誘導 MDSCs產(chǎn)生并激活［51］；（4）誘導腫瘤浸潤中性粒細胞表面PD-L1表達［52］。研究者在小鼠原位肝癌模型上證明HSCs可以通過激活COX2-PGE2-EP4信號通路，誘導Tregs和MDSCs產(chǎn)生，從而實現(xiàn)免疫抑制［53-54］。此外，HSCs和 ECs也可以產(chǎn)生SDF-1并誘導骨髓細胞在腫瘤區(qū)域的聚集［55］，而激活的內(nèi)皮細胞也可通過TGF-β來介導Tregs的產(chǎn)生。

抑制性因子在肝癌免疫微環(huán)境中，腫瘤細胞及多種免疫細胞可通過分泌免疫抑制因子來誘導免疫耐受的形成，其中以 TGF-β、IL-10、VEGF等較具代表性。TGF-β是一種可以調(diào)節(jié)細胞增殖、遷移、黏附的多效性細胞因子［56］，其可通過多種途徑抑制機體抗腫瘤免疫，包括誘導DCs向調(diào)節(jié)性DCs轉(zhuǎn)化［39］、促進腫瘤相關(guān)巨噬細胞向M2型分化、促進CD4+T細胞轉(zhuǎn)變?yōu)門regs，并抑制CD8+T細胞和NK細胞的功能［56］；IL-10是具有廣譜抗炎作用的抑制性細胞因子［57］。在肝癌免疫微環(huán)境中，IL-10可由DCs、HSCs、MDSCs等多種細胞分泌［57］。研究表明，IL-10既可作用于APCs，抑制其呈遞抗原及表達MHCII分子、共刺激分子CD80/CD86，也可直接抑制T細胞功能以及促炎細胞因子IL-1、IL-6、IL-12、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）的釋放［58］；傳統(tǒng)觀點認為，VEGF在腫瘤組織中主要發(fā)揮促進血管生成的作用，但如今其被報道可在肝癌免疫微環(huán)境中促進免疫抑制細胞浸潤和免疫檢查點分子的表達［58］。

此外，肝癌細胞或免疫細胞還可以產(chǎn)生一系列可溶性因子來調(diào)節(jié)免疫。IDO是色氨酸代謝的關(guān)鍵酶，IDO表達的升高可以通過耗竭T細胞功能所需的色氨酸來抑制效應(yīng)T細胞功能，且其代謝產(chǎn)生的犬尿氨酸也可誘導Tregs生成［59］。在肝癌患者，IDO 在 DCs、TAMs、CAFs、ECs、肝細胞的表達均可升高［50，60］，而其也被證明與肝癌侵襲性以及患者不良預(yù)后相關(guān)［61］。此外，在肝癌免疫微環(huán)境中，精氨酸酶-1主要在MDSCs和M2型TAMs表達升高，其主要通過耗竭T細胞功能所需L-精氨酸來維持免疫耐受［62-63］；腺苷也可作為免疫調(diào)節(jié)因子，來自腺苷受體A2a的信號可以抑制巨噬細胞激活、CD4+和 CD8+T 細胞功能以及誘導 Tregs產(chǎn)生［15，64］。

免疫檢查點研究表明，即使在腫瘤組織存在足量的腫瘤相關(guān)抗原（tumor-associated antigen，TAA）-特異細胞毒性T細胞，腫瘤往往仍會進展。這是因為人體可以通過多種機制損害細胞毒性T細胞的功能［65］。其中最顯著的途徑就是免疫檢查點途徑，包括 PD-1-PD-L1/PD-L2、CTLA-4、Tim-3、LAG-3、淋巴細胞衰減子（B and T lymphocyte attenuator，BTLA）［66］。目前研究最多的、臨床相關(guān)性最大的是PD-1/PD-L1、CTLA-4。

PD-1在一系列免疫細胞上均可表達，包括活化的T細胞、B細胞、NK細胞以及Tregs、MDSCs、DCs、TAMs［48，67］。 PD-1 傳 遞 的 信 號 可 以 誘 導CD8+/CD4+T細胞的凋亡、抑制Tregs的凋亡、以及損害DCs和TAMs的功能。PD-1有PD-L1和PD-L2兩個配體。PD-L1在造血細胞、內(nèi)皮細胞、上皮細胞表面均有表達，而PD-L2只在造血細胞表面表達。在肝癌免疫微環(huán)境中，PD-L1主要表達在kupffer細胞表面，此外還有APCs、腫瘤細胞表面［68］。當高表達PD-L1的細胞與高表達PD-1的CD8+T細胞相互作用，可引起效應(yīng)T細胞的功能障礙。目前，PD-1抗體納武單抗已在臨床I/II期試驗中被證明對進展期肝癌有效，并具有良好的安全性［69］，已被美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準作為進展期或轉(zhuǎn)移性肝癌的二線治療藥物［70］。而PD-1另一抗體派姆單抗的療效也已在臨床II期試驗中得到驗證［71］，并被FDA批準用于經(jīng)索拉菲尼治療的肝癌患者［70］。此外，PD-L1抗體得瓦魯單抗也已進入臨床I/II期試驗［72］。

CTLA-4是CD28的同系物，它可以通過直接傳遞抑制信號或與CD28競爭性結(jié)合APCs表面的CD80/CD86來抑制 T細胞功能［73］。CTLA-4不僅在活化T細胞上表達，也在Tregs表面表達，并在Tregs發(fā)揮免疫抑制功能的過程中扮演重要的角色。如HCC衍生Tregs可以通過CTLA-4下調(diào)脾臟DCs上CD80/CD86的表達［74］。有研究者通過對31例肝癌患者的研究發(fā)現(xiàn)抗CTLA-4抗體可以使TAA-特異細胞毒性T細胞的數(shù)量增加60%，并提高其抗腫瘤能力［75］。CTLA-4抗體依匹單抗、曲美替尼對于進展期肝癌的療效目前也已進入臨床Ⅰ/Ⅱ期試驗［72］。

Tim-3作為一種新發(fā)現(xiàn)的免疫檢查點分子，已在實驗室中被證明可作為多種腫瘤的治療靶點，其在多種免疫細胞表面如CD4+/CD8+T細胞、Tregs上均有表達，并可作為多種配體包括半凝乳素-9（galetin-9，Gal-9）、磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PtdSer）、高遷移率族蛋白B1（high mobility group box-1 protein，HMGB1）、癌胚抗原相關(guān)的細胞黏附分子-1（carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule-1，CEACAM-1）的受體，其中Gal-9主要在APCs表面表達。研究者發(fā)現(xiàn)在HBV相關(guān)HCC，Tim-3/Gal-9信號通路可以介導T細胞的老化［76］。此外，TGF-β可以上調(diào)TAMs表面Tim-3表達并促使 TAMs分泌 IL-6以及向 M2轉(zhuǎn)化［77］。

LAG-3被證明在肝癌浸潤淋巴細胞上表達，尤其是 CD8+T細胞［40］。LAG-3和 Gal-3的相互作用可以抑制CD8+T細胞以及NK細胞的功能，其表達與肝癌患者預(yù)后具有明顯的相關(guān)性［78-79］。

BTLA也是一種表達在活化淋巴細胞表面的共抑制分子，它的配體是可表達在肝癌細胞表面的單純皰疹病毒進入介質(zhì)（herpesvirus entry mediator，HVEM），因此腫瘤細胞表面具有HVEM表達的肝癌患者腫瘤侵襲性更強且預(yù)后更差［80］。

結(jié)語近年來，免疫治療在肝癌的系統(tǒng)治療中扮演著越來越重要的角色，關(guān)于肝癌免疫治療的基礎(chǔ)及臨床研究進展也在不斷更新。然而，以PD-1或PD-L1、CTLA-4抗體為代表的免疫治療疾病緩解率低，其最主要的原因是肝癌免疫耐受微環(huán)境的形成機制錯綜復(fù)雜，單藥免疫治療難以獲得較高臨床緩解率。Tregs、MDSCs，TAMs、調(diào)節(jié)性 DCs等多種免疫細胞及其分泌的免疫抑制因子共同誘導了肝癌免疫耐受微環(huán)境。這提示我們在制定抗腫瘤免疫治療策略時，必須結(jié)合多個免疫治療靶點或其他肝癌治療策略如化療、靶向治療，從而進一步改善晚期肝癌患者的生存質(zhì)量。