餐飲食品中蠟樣芽孢桿菌的實時熒光PCR檢測方法研究*

柯振華

[福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗研究院 國家加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心(福州)，福建 福州 350002]

蠟樣芽孢桿菌為革蘭氏陽性菌，兼性需氧型，可形成橢圓形芽孢。大多數(shù)引起食物中毒的蠟樣芽孢桿菌有鞭毛，可運動，在普通瓊脂上生成的菌落呈不透明灰白色，表面干燥，邊緣常呈擴展狀，菌落較大，直徑4～6 mm。

由蠟樣芽孢桿菌引起的食物中毒一般發(fā)生在夏秋季，具有比較明顯的季節(jié)性[1～5]。如果食物被少量蠟樣芽孢桿菌污染，且繼續(xù)置于適宜蠟樣芽孢桿菌生長的溫度下儲存，菌體會迅速大量地繁殖，進而釋放毒素，被人誤食之后，嚴重的會導(dǎo)致死亡[6～9]。

我國由蠟樣芽孢桿菌引起的食物中毒多為淀粉類食品引起，例如餿飯、米粉、酒釀、炒飯等，而國際上多是乳制品、肉、蔬菜、甜點心、調(diào)味汁等引起的食物中毒，該菌的致病能力與其分泌的毒素有關(guān)[10～17]。由于蠟樣芽孢桿菌的廣泛分布及其所分泌毒素對人們造成的嚴重威脅，建立高效穩(wěn)定可靠的蠟樣芽孢桿菌檢測方法體系對食品安全具有重大意義。

隨著外賣的興起以及人民生活消費方式的轉(zhuǎn)變，餐飲食品已經(jīng)成為人們?nèi)粘Ｉ畹闹匾糠?，由于餐飲食品加工儲運的特殊性以及自然界中蠟樣芽孢桿菌的廣泛分布，在餐飲食品中存在較大的蠟樣芽孢桿菌污染風險。在我國，對蠟樣芽孢桿菌的檢測主要基于國家標準方法GB 4789.14—2014《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 蠟樣芽胞桿菌檢驗》，該方法步驟較多，操作過程復(fù)雜，檢測過程需要3～5 d的時間，難以滿足餐飲食品快速檢測需求，因此，急需開發(fā)一種快速準確的餐飲食品中蠟樣芽孢桿菌的篩查方法。PCR作為基因檢測技術(shù)，具有高靈敏度、高特異性等優(yōu)點，目前已經(jīng)被國內(nèi)外科學(xué)家廣泛應(yīng)用于病原菌的篩查檢測[18～24]。

為了節(jié)約檢測時間，提高檢測效率，本研究擬基于實時熒光PCR檢測技術(shù)開發(fā)一套完整的餐飲食品中蠟樣芽孢桿菌的檢測方法體系。主要技術(shù)路線包括使用胰酪胨大豆多黏菌素肉湯培養(yǎng)基對樣品中的目標菌進行預(yù)增菌，采用熱裂解法提取樣品核酸，運用實時熒光PCR技術(shù)特異性地檢測樣液中的蠟樣芽孢桿菌基因成分。

在建立穩(wěn)定可靠的蠟樣芽孢桿菌檢測體系后，為了驗證所建立方法體系的有效性與適用性，我們在市場中隨機抽樣采集了315份餐飲食品樣本開展檢測工作。檢測結(jié)果表明，應(yīng)用本研究方法可在抽樣檢驗的25份餐飲食品中檢測出蠟樣芽孢桿菌基因成分，檢出率為7.93%。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標準菌株

1.1.2 餐飲食品樣品

購自市場中各大超市、餐館、集體食堂、快餐店、小吃店等。采用無菌抽樣方式采集樣品，每份樣品獨立包裝并按序列編號，做好標記，每份樣品至少采集200 g(mL)，冷藏(4 ℃)條件下4 h內(nèi)送至實驗室進行檢驗。

1.1.3 試劑

胰酪胨大豆多黏菌素肉湯培養(yǎng)基購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；

實時熒光PCR反應(yīng)用預(yù)混液購自上海生工生物工程股份有限公司；

DNA提取試劑盒購自德國凱杰公司。

1.2 主要儀器

核酸蛋白測定儀：美國伯樂公司；

7500實時熒光定量PCR檢測系統(tǒng)：美國應(yīng)用生物系統(tǒng)有限公司；

臺式離心機：德國艾本德公司；

生物安全柜：德國貝克公司；

Milli-Q超純水儀：德國密理博公司；

VITEK Compact II全自動微生物鑒定藥敏系統(tǒng)：法國梅里埃公司。

1.3 方法

1.3.1 預(yù)增菌

蠟樣芽孢桿菌標準菌株接種于100 mL胰酪胨大豆多黏菌素肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)12 h。餐飲食品取25 g，加入225 mL 胰酪胨大豆多黏菌素肉湯培養(yǎng)基中，拍擊混勻150 s，37 ℃振蕩培養(yǎng)12 h。

1.3.2 DNA模板的制備方法

在核酸提取方法的選擇上，我們主要采取兩種方法提取試樣DNA，第一種方法是熱裂解法，第二種方法是試劑盒法。

⑴ 熱裂解法提取DNA：用移液器小心移取預(yù)增菌液2.0 mL，置于離心管中，10000 r/min離心10 min。棄上清，沉淀用150 μL TE緩沖液懸浮，于100 ℃金屬浴加熱10 min，加熱結(jié)束后，10000 r/min離心10 min。取上清作為DNA模板溶液。

⑵ 試劑盒法提取DNA：按照Qiagen試劑盒操作說明書進行DNA提取。

表1 引物探針信息

1.3.3 引物探針的設(shè)計與合成

本文根據(jù)蠟樣芽孢桿菌基因組保守序列設(shè)計合成蠟樣芽孢桿菌特異性的引物與探針，具體引物探針信息見表1，引物探針委托上海生工生物工程有限公司合成。

1.3.4 實時熒光PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)參數(shù)

實時熒光PCR反應(yīng)體系：在30 μL PCR體系中，實時熒光PCR預(yù)混液15 μL，上游、下游引物各1 μL，探針0.5 μL，模板DNA溶液3.0 μL，滅菌蒸餾水補足體積至30 μL。

實時PCR反應(yīng)參數(shù)：94 ℃、10 min，94 ℃、15 s，60 ℃、1 min，45個循環(huán)。

1.3.5 靈敏度試驗

采用熱裂解法提取的蠟樣芽孢桿菌基因組DNA作為模板溶液，使用核酸蛋白測定儀測定基因組DNA的濃度與純度，將其梯度稀釋后進行實時PCR反應(yīng)，繪制各濃度梯度的PCR擴增曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法特異性驗證試驗

為了驗證所建立蠟樣芽孢桿菌實時熒光PCR方法的特異性，本研究將蠟樣芽孢桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌、大腸埃希氏菌O157∶H7、單核細胞增生李斯特氏菌與大腸埃希氏菌等菌株接種于前增菌培養(yǎng)液中，培養(yǎng)12 h后采用熱裂解法提取各菌株的基因組DNA。

根據(jù)優(yōu)化后的實時熒光PCR方法，使用蠟樣芽孢桿菌檢測引物探針對上述6株常見病原菌基因組DNA進行檢測。結(jié)果顯示，目標菌蠟樣芽孢桿菌出現(xiàn)明顯的擴增曲線，而在其他陰性對照菌株DNA樣品中均無擴增曲線，特異性實驗結(jié)果見圖1。

2.2 方法靈敏度試驗

我們采用TE緩沖液將提取得到的蠟樣芽孢桿菌DNA溶液分別稀釋至100、10、1.0、0.1、0.01、0.001、0.0001 ng/μL，使用本研究方法體系分別對上述7個濃度梯度的DNA溶液進行實時熒光PCR測試，實驗重復(fù)6次。

在6次重復(fù)試驗中，100、10、1.0、0.1、0.01 ng/μL濃度的蠟樣芽孢桿菌DNA溶液中均出現(xiàn)了擴增曲線，結(jié)果如圖2所示，0.001、0.0001 ng/μL的蠟樣芽孢桿菌DNA溶液未出現(xiàn)擴增曲線。結(jié)果表明，在DNA濃度的水平上，本研究方法的檢測靈敏度為0.01 ng/μL的蠟樣芽孢桿菌DNA溶液。

2.3 315份餐飲食品中蠟樣芽孢桿菌的檢測結(jié)果

用本研究建立的檢測方法對市場中采集的315份餐飲食品中的蠟樣芽孢桿菌進行PCR檢測分析。

結(jié)果表明，應(yīng)用本方法在25份餐飲食品樣品中檢測出蠟樣芽孢桿菌特異性基因成分，檢出率為7.93%（25/315）。檢出陽性結(jié)果的餐飲食品增菌液經(jīng)微生物檢測方法以及VITEK驗證，均為陽性，結(jié)果說明本方法檢測結(jié)果與微生物檢驗方法結(jié)果高度一致，充分說明本研究方法的準確性與可靠性。

3 討論

蠟樣芽孢桿菌由于其分布的廣泛性及所分泌毒素的危害性，引起人們的普遍關(guān)注。我國現(xiàn)行的國家標準方法如GB 4789.14—2014對于蠟樣芽孢桿菌的檢測需要3～5 d的時間，難以滿足餐飲食品對檢驗時效性的要求。鑒于餐飲食品的特殊性以及蠟樣芽孢桿菌的危害性，本研究旨在建立一種能在短時間內(nèi)精確篩查餐飲食品中蠟樣芽孢桿菌的方法。

針對模板DNA的制備，本研究探索并比較了熱裂解法與試劑盒法在細菌DNA提取中的應(yīng)用差異。對同一份增菌液，本研究同時采用熱裂解法以及試劑盒法進行DNA提取，PCR實驗結(jié)果表明兩種方法所提取菌液DNA都能擴增出目標基因序列，擴增曲線以及CT值無顯著性差異。但是，由于試劑盒成本較高且提取步驟多、耗時長，針對大批量樣品的DNA制備適用性不強，而熱裂解法提取菌液DNA時只需加入TE緩沖液，通過金屬浴加熱后離心的方式獲得菌液DNA，操作步驟簡潔，耗時短，一次性可以處理大批量的樣品。綜合考慮，本研究抽樣檢驗的餐飲食品樣品主要采取熱裂解法提取DNA。

本文以蠟樣芽孢桿菌基因組中的 基因為靶序列，設(shè)計并合成特異性的引物與探針，PCR特異性實驗結(jié)果顯示，所設(shè)計引物探針僅針對蠟樣芽孢桿菌DNA有擴增曲線，針對其他菌株DNA未見擴增曲線，充分說明了引物探針的特異性良好。本文通過試驗不斷篩選和優(yōu)化適宜的引物探針濃度與退火溫度等條件，從而保證蠟樣芽孢桿菌PCR檢測方法的穩(wěn)定性和結(jié)果的可重復(fù)性。

本文將DNA熱裂解提取法與實時熒光PCR檢測技術(shù)相結(jié)合，應(yīng)用于餐飲食品中蠟樣芽孢桿菌的檢測中，建立了一整套由樣品預(yù)增菌到DNA提取到實時熒光PCR檢測的方法，所建立方法簡便快捷，在18 h內(nèi)即可完成所有檢測工作，檢出限可達到0.01 ng/μL菌液DNA，特別適用于大批量樣品中蠟樣芽孢桿菌的快速篩查檢測，具有較好的推廣應(yīng)用前景。同時，針對餐飲食品及相關(guān)食品如面米制品、乳制品等中蠟樣芽孢桿菌的篩查檢測，本方法也具有較高的實用和推廣價值。