有機(jī)磷水解酶對甲基對硫磷的快速降解及檢測

白俊巖 高熳熳 孫磊 程書梅 霍書英

摘要：甲基對硫磷是一種毒性較強(qiáng)的有機(jī)磷農(nóng)藥，常被用作菜農(nóng)用作殺蟲劑，有機(jī)磷水解酶可通過切斷甲基對硫磷中的PO鍵實(shí)現(xiàn)對甲基對硫磷的快速、高效降解。通過對有機(jī)磷水解酶降解條件進(jìn)行優(yōu)化，得到有機(jī)磷水解酶最優(yōu)的農(nóng)藥降解條件：酶濃度為1 ∶1 000、pH值為8、降解溫度為37 ℃、降解時間為10 min。通過氣相色譜法測得有機(jī)磷水解酶對1、5、10 μg/mL甲基對硫磷的降解率均達(dá)到98%以上，因此在生產(chǎn)中有機(jī)磷水解酶可作為針對甲基對硫磷的高效快速降解酶進(jìn)行推廣使用。

關(guān)鍵詞：甲基對硫磷;有機(jī)磷水解酶;對硝基酚;快速降解;農(nóng)藥殘留

中圖分類號： S481+.8;X592文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）04-0186-06

收稿日期：2018-12-16

基金項(xiàng)目：國家重點(diǎn)研發(fā)計劃（編號：2016YFF0202302-03）。

作者簡介：白俊巖（1994—），女，河北承德人，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称饭こ?。E-mail：1129901984@qq.com。

通信作者：霍書英，博士，副教授，從事農(nóng)藥殘留和生殖內(nèi)分泌研究。E-mail：huoshuying@163.com。

我國是一個傳統(tǒng)的農(nóng)業(yè)大國，農(nóng)藥的使用量一直居于世界首位，每年達(dá)80萬～100萬t[1]。為減輕病害蟲對農(nóng)產(chǎn)品的影響，濫用農(nóng)藥的現(xiàn)象經(jīng)常發(fā)生。由于農(nóng)藥殘留檢測方法受限，管理監(jiān)察力度不夠，高毒農(nóng)藥的生產(chǎn)以及使用情況時有發(fā)生，造成水果蔬菜等農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量下降，農(nóng)藥殘留量超標(biāo)，嚴(yán)重危害人類的健康[2]。

甲基對硫磷是一種毒性較強(qiáng)的有機(jī)磷農(nóng)藥，雖然已被國家禁用，但總有菜農(nóng)偷偷用來作高效殺蟲劑，有機(jī)磷農(nóng)藥的廣泛使用在提高農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)出的同時也存在食品安全隱患[3]。因此，嚴(yán)格進(jìn)行食用蔬菜有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的檢測和控制，對于保證蔬菜品質(zhì)、維護(hù)人類健康、減少土壤污染和保護(hù)環(huán)境非常重要。2011年，黃文水報道了蔬菜中甲基對硫磷農(nóng)藥殘留的多種檢測方法，包括氣相色譜法、高效液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)等在內(nèi)的諸多儀器檢測方法，但這些方法均存在操作步驟繁多、回收率低、對技術(shù)條件要求高、不易廣泛推廣應(yīng)用等缺點(diǎn)[4]。2017年，白云鵬等報道了有機(jī)磷水解酶在一定條件下可直接通過切斷甲基對硫磷中的PO 鍵，從而達(dá)到對甲基對硫磷的高效降解[5]。因此，本試驗(yàn)利用有機(jī)磷水解酶對甲基對硫磷具有高效降解特性，可將甲基對硫磷分解產(chǎn)生等摩爾的黃色對硝基酚，通過測定產(chǎn)物對硝基酚的量即可計算蔬菜中甲基對硫磷農(nóng)藥的殘留量，從而試圖建立一種利用有機(jī)磷水解酶快速檢測水果、蔬菜中甲基對硫磷殘留量的簡單可行方法，以實(shí)現(xiàn)對水果、蔬菜甲基對硫磷的降解和檢測控制。

1?材料與方法

1.1?材料與試劑

有機(jī)磷水解酶（organophosphorus hydrolase，簡稱OPH）（酶活性≥11 μmol/min·mg），購自北京森根瑞亞公司;甲基對硫磷標(biāo)準(zhǔn)品（methyl parathion，簡稱MEP;CAS號：298-00-0：購自天津一方恒益醫(yī)藥技術(shù)有限公司;磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉、三氯乙酸、碳酸鈉、無水乙醇、亞硝酸鈉等，均購自天津市福晨化學(xué)試劑廠;4-硝基苯酚，購自成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司;乙腈、丙酮（色譜純）購自德國Merck公司。

1.2?儀器與設(shè)備

主要的儀器有：Bio-rad酶標(biāo)儀（美國伯樂）、Cp214電子天平[奧豪斯儀器（上海）有限公司制造]、pHS-3C酸度計（上海佑科儀器儀表有限公司）、YMDCY-12S水浴氮吹儀（上海育模儀器有限公司）、HH-W600數(shù)顯恒溫三用水箱（金壇市朗博儀器制造有限公司）;氣相色譜儀（帶氮磷檢測器，備有毛細(xì)管柱，美國Thermo）：TRACE GC ULTRA、RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）、YDp-02型真空泵（上海育模儀器有限公司）、通風(fēng)柜（北京歐世佳實(shí)驗(yàn)室家具有限公司）、QL-861型旋渦混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）、YDp-02型真空泵（上海育模儀器有限公司）、pHS-3DW型分析天平（上海儀電分析儀器有限公司）。

1.3?有機(jī)磷水解酶降解條件的優(yōu)化

1.3.1?對硝基酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取0.083 64 g 對硝基酚標(biāo)準(zhǔn)品，先用少量95%乙醇溶解，然后用水定容至100 mL，濃度為6 mmol/L。按表1分別加入不同量的對硝基酚和50 mmol/L的磷酸鹽緩沖液（pH值為8），由2號管取出500 μL混合液加入3號管混合，然后取出500 μL加入4號管，以此類推配成不同濃度（0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0、160.0 μmol/L）的對硝基酚標(biāo)準(zhǔn)液，然后加入0.5 mL 10%三氯乙酸，再加入0.5 mL 10% Na2CO3顯色，使用酶標(biāo)儀在450 nm處測定吸光度，繪制對硝基酚濃度-吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。

1.3.2?不同濃度的有機(jī)磷水解酶對甲基對硫磷降解效果的影響

用pH值為8的50 mmol/L磷酸鹽緩沖液配制不同濃度（1 ∶500、1 ∶1 000、1 ∶2 000、1 ∶3 000、1 ∶4 000、1 ∶5 000、1 ∶6 000、1 ∶7 000、1 ∶8 000）的有機(jī)磷水解酶，取0.325 mL甲基對硫磷和0.175 mL各個濃度的有機(jī)磷水解酶于離心管中，在溫度為37 ℃條件下反應(yīng)1 min，反應(yīng)結(jié)束后加入0.5 mL 10%三氯乙酸進(jìn)行終止，再加入0.5 mL 10% Na2CO3顯色，使用酶標(biāo)儀在450 nm處測定吸光度，并根據(jù)甲基對硫磷降解產(chǎn)物對硝基酚與甲基對硫磷濃度的線性關(guān)系，計算不同濃度的有機(jī)磷水解酶對甲基對硫磷的降解率，試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。

1.3.3?不同pH值對有機(jī)磷水解酶降解效果的影響

分別用pH值為5、6、7、8、9、10的50 mmol/L磷酸鹽緩沖液配制1 ∶1 000的有機(jī)磷水解酶，取0.325 mL 甲基對硫磷和0.175 mL各個pH值的有機(jī)磷水解酶于離心管中，在溫度為37 ℃條件下反應(yīng)1 min，反應(yīng)結(jié)束后加入0.5 mL 10%三氯乙酸進(jìn)行終止，再加入0.5 mL 10% Na2CO3顯色，使用酶標(biāo)儀在450 nm處測定吸光度，并根據(jù)甲基對硫磷降解產(chǎn)物對硝基酚與甲基對硫磷濃度的線性關(guān)系，計算不同pH值下有機(jī)磷水解酶對甲基對硫磷的降解率，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4?不同反應(yīng)溫度對有機(jī)磷水解酶降解效果的影響

用pH值為8的50 mmol/L磷酸鹽緩沖液配制1 ∶1 000的有機(jī)磷水解酶，取0.325 mL甲基對硫磷和0.175 mL有機(jī)磷水解酶于離心管中，分別在不同溫度（4、27、37、47、57、67、77 ℃）下反應(yīng)1 min，反應(yīng)結(jié)束后加入0.5 mL 10%三氯乙酸進(jìn)行終止，再加入0.5 mL 10% Na2CO3顯色，使用酶標(biāo)儀在450 nm 處測定吸光度，并根據(jù)甲基對硫磷降解產(chǎn)物對硝基酚與甲基對硫磷濃度的線性關(guān)系，計算有機(jī)磷水解酶不同反應(yīng)溫度對甲基對硫磷的降解率，試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。

1.3.5?不同反應(yīng)時間對有機(jī)磷水解酶降解效果的影響

用pH值為8的50 mmol/L磷酸鹽緩沖液配制1 ∶1 000的有機(jī)磷水解酶，取0.325 mL甲基對硫磷和0.175 mL有機(jī)磷水解酶于離心管中，在溫度37 ℃ 條件下反應(yīng)不同時間（0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、10 min），反應(yīng)結(jié)束后加入0.5 mL 10%三氯乙酸進(jìn)行終止，再加入0.5 mL 10% Na2CO3顯色，使用酶標(biāo)儀在450 nm處測定吸光度，并根據(jù)甲基對硫磷降解產(chǎn)物對硝基酚與甲基對硫磷濃度的線性關(guān)系，計算有機(jī)磷水解酶不同反應(yīng)時間對甲基對硫磷的降解率，試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。

1.4?有機(jī)磷水解酶對甲基對硫磷降解功效的氣相色譜法測定

1.4.1?甲基對硫磷濃度-峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用100 mg/L的農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品分別配成2.000 00、1.000 00、0.500 00、0.250 00、0.125 00、0.062 50、0.031 25 μg/mL丙酮溶液，使用氣相色譜測定峰面積，繪制濃度-峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線，試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。

1.4.2?有機(jī)磷水解酶對甲基對硫磷的降解反應(yīng)條件

取10 mL 1、5、10 μg/mL有機(jī)磷農(nóng)藥工作液，分別加入5 mL 1 ∶500的有機(jī)磷水解酶，對照組加入等量的磷酸鹽緩沖液，置于37 ℃生化培養(yǎng)箱中進(jìn)行降解反應(yīng)，反應(yīng)10 min后取出迅速加入30 mL乙腈萃取降解反應(yīng)后殘留的農(nóng)藥底物，顛倒混勻，加入5 g 氯化鈉，劇烈振蕩1 min，4 000 r/s離心5 min，取出10 mL乙腈相，相當(dāng)于樣品量的1/3，移入50 mL 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，先用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮至1 mL，再用氮吹儀在室溫下濃縮至近干，用丙酮定容至1 mL，供氣相色譜測定，然后計算有機(jī)磷水解酶對甲基對硫磷的降解率。

有機(jī)磷水解酶對有機(jī)磷農(nóng)藥降解效率的計算公式：

R=X-X0X×100%。

式中：R表示生物制品的降解效率;X表示反應(yīng)體系中降解反應(yīng)前標(biāo)準(zhǔn)農(nóng)藥的濃度;X0表示反應(yīng)體系中降解反應(yīng)結(jié)束后殘留農(nóng)藥的濃度。

1.4.3?氣相色譜測定條件

氣相色譜儀型號為Thermo TRACE GC ULTRA;色譜柱為石英毛細(xì)管柱，DB-1701，30 m×0.53 mm（內(nèi)徑）×1.0 μm（膜厚）;載氣：氮?dú)猓兌却笥?9.999%）;載氣流速為10 mL/min，尾吹氣流速為30 mL/min;氫氣流速為75 mL/min，空氣流速為100 mL/min;柱溫：初始溫度為150 ℃，保持1 min，以20 ℃/min升至270 ℃，保持15 min;進(jìn)樣口溫度為250 ℃;檢測器溫度為250 ℃;進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣;進(jìn)樣量為1 μL;開閥時間為1.5 min。

1.5?有機(jī)磷水解酶對葉類蔬菜中甲基對硫磷殘留量的快速檢測

1.5.1?不同濃度的甲基對硫磷與有機(jī)磷水解酶降解產(chǎn)物吸光值的線性關(guān)系

用pH值為8的50 mmol/L 磷酸鹽緩沖液配制不同濃度（0.1、1.0、10.0、50.0、100.0、200.0、500.0、1 000.0 μg/mL）的甲基對硫磷加入1 ∶500 的有機(jī)磷水解酶，取0.325 mL 甲基對硫磷和0.175 mL有機(jī)磷水解酶于離心管中，在溫度為37 ℃ 條件下反應(yīng)10 min，反應(yīng)結(jié)束后加入0.5 mL 10%三氯乙酸進(jìn)行終止，再加入0.5 mL 10% Na2CO3顯色，使用酶標(biāo)儀在450 nm處測定吸光度，繪制線性曲線圖，試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。

1.5.2?葉類蔬菜中甲基對硫磷殘留的快速檢測

1.5.2.1?蔬菜樣品的處理

選取新鮮的未接觸任何農(nóng)藥的油菜（來自河北農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)基地），試驗(yàn)組噴灑等量1、5、10 μg/mL甲基對硫磷，靜置1 h，對照組只噴灑相同量的磷酸鹽緩沖液，靜置1 h。采用分點(diǎn)取樣法準(zhǔn)確稱取10 g蔬菜，剪成1 cm見方碎片，放入燒杯中，加入20 mL乙腈浸泡20 min。過濾得到提取液，然后加5 g NaCl振蕩1 min，3 000 r/s 離心10 min，取出 10 mL乙腈相，移入50 mL旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，先用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮至1 mL，再用氮吹儀在室溫下濃縮至近干。

1.5.2.2?樣品測定

向吹至近干的樣品中加入0.3 mL磷酸鹽緩沖液和0.2 mL濃度為1 ∶500的有機(jī)磷水解酶，37 ℃反應(yīng)10 min，然后加入0.2 mL次氯酸鈉和0.3 mL亞硝酸鈉，室溫靜置10 min，3 000 r/s 離心3 min，取出0.5 mL上清液先加入0.5 mL 10%三氯乙酸終止反應(yīng)，再加入0.5 mL 10% Na2CO3顯色，使用酶標(biāo)儀在450 nm處測定吸光度，試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。

2?結(jié)果與分析

2.1?對硝基酚濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

由圖1可知，對硝基酚標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.002 2x-0.003，回歸相關(guān)系數(shù)r2=0.999 7。說明對硝基酚濃度與吸光度呈正相關(guān)，可以通過測定吸光度計算得到對硝基酚的濃度。

2.2?有機(jī)磷水解酶降解條件的優(yōu)化結(jié)果

2.2.1?不同濃度的有機(jī)磷水解酶對甲基對硫磷降解率的影響

由圖2可知，有機(jī)磷水解酶在濃度為1 ∶500、1 ∶1 000、1 ∶2 000時，對甲基對硫磷的降解率均在96%以上，隨著有機(jī)磷水解酶濃度的降低，對甲基對硫磷的降解率也在下降。綜合考慮，選擇有機(jī)磷水解酶濃度為1 ∶1 000進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2.2?不同pH值對有機(jī)磷水解酶對甲基對硫磷的降解率的影響

由圖3可知，隨著pH值的升高，有機(jī)磷水解酶對甲基對硫磷的降解率不斷升高，當(dāng)pH值為8時有機(jī)磷水解酶對甲基對硫磷的降解率達(dá)到最高，為95.55%，隨著pH值的繼續(xù)上升，有機(jī)磷水解酶對甲基對硫磷的降解率逐漸下降。所以，選擇pH值為8進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2.3?不同反應(yīng)溫度對有機(jī)磷水解酶對甲基對硫磷的降解率的影響

由圖4可知，隨著溫度的升高，有機(jī)磷水解酶對甲基對硫磷的降解率不斷升高，當(dāng)溫度達(dá)到47 ℃時，有機(jī)磷水解酶對甲基對硫磷的降解率達(dá)到最高，為94.51%。綜合考慮，選擇降解溫度為37 ℃進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2.4?不同反應(yīng)時間對有機(jī)磷水解酶對甲基對硫磷的降解率的影響

由圖5可知，反應(yīng)時間為0.5，1、1.5、2、3、4、6、8、10 min，有機(jī)磷水解酶降解率均維持在89%以上。綜合考慮，選擇降解時間為10 min 進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.3?有機(jī)磷水解酶降解功效的氣相色譜測定結(jié)果

由圖6可知，出峰時間為10.35 min;由圖7可知，甲基對硫磷濃度與峰面積呈線性關(guān)系，r2=0.998 1。由表2可知，有機(jī)磷水解酶（1 ∶1 000）對1、5、10 μg/mL的甲基對硫磷的降解率均達(dá)到98%以上，農(nóng)藥回收率均在93%～105%之間。

2.4?有機(jī)磷水解酶對葉類蔬菜甲基對硫磷殘留的快速檢測

2.4.1?不同濃度甲基對硫磷與有機(jī)磷水解酶降解產(chǎn)物對硝基酚吸光度的線性關(guān)系

由圖8可知，有機(jī)磷水解酶對不同濃度甲基對硫磷進(jìn)行降解，在1～1 000 μg/mL濃度范圍內(nèi)降解產(chǎn)物對硝基酚450 nm 下的吸光度與甲基對硫磷濃度呈線性關(guān)系，回歸相關(guān)系數(shù)r2=0.999 1。因此，可利用有機(jī)磷水解酶對甲基對硫磷高效快速降解的特點(diǎn)，通過檢測降解產(chǎn)物對硝基酚的含量即可計算出反應(yīng)物甲基對硫磷的量。

2.4.2?有機(jī)磷水解酶對葉類蔬菜農(nóng)藥殘留的檢測結(jié)果

由表3可知，無農(nóng)藥油菜噴灑不同濃度甲基對硫磷后，按“1.5.2.1”節(jié)抽提農(nóng)藥，利用有機(jī)磷水解酶對其進(jìn)行降解，根據(jù)試驗(yàn)測得的D450 nm計算出油菜中農(nóng)藥殘留量分別為0.133、2.133、6.133 μg/g。此方法操作簡便，高效快速，便于掌握，更有利于推廣使用。

3?結(jié)果與討論

通過對有機(jī)磷水解酶降解條件進(jìn)行優(yōu)化，得出有機(jī)磷水解酶最優(yōu)的農(nóng)藥降解條件：酶濃度為1 ∶1 000、pH值為8、降解溫度為37 ℃、降解時間為10 min。通過氣相色譜法測得有機(jī)磷水解酶對1、5、10 μg/mL甲基對硫磷的降解率均達(dá)到98%以上，因此在生產(chǎn)中有機(jī)磷水解酶可作為針對甲基對硫磷的高效快速降解酶進(jìn)行推廣使用。另外，利用有機(jī)磷水解酶對甲基對硫磷具有高效降解特性，建立了一種簡便快速檢測水果、蔬菜中甲基對硫磷殘留量的新方法。

首先建立甲基對硫磷不同濃度和有機(jī)磷水解酶降解產(chǎn)物對硝基酚吸光值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并參照國家標(biāo)準(zhǔn)[6]中葉類蔬菜農(nóng)藥殘留量的測定方法中農(nóng)藥的抽提方法并加以改進(jìn)，建立了相對穩(wěn)定的有機(jī)磷水解酶反應(yīng)體系和殘留農(nóng)藥的抽提方法，并進(jìn)行了多次重復(fù)，結(jié)果穩(wěn)定。此方法操作簡便，高效快速，便于掌握，檢測成本低，因此更有利于在生產(chǎn)中推廣使用，這種快速檢測法的建立，可在監(jiān)督環(huán)節(jié)發(fā)揮重要作用，有利于及時發(fā)現(xiàn)問題、采取措施[7]。

蔬菜是人們餐桌上必不可少的食物，但農(nóng)藥殘留超標(biāo)問題已引起社會各界的廣泛關(guān)注，利用有機(jī)磷水解酶對甲基對硫磷的高效快速降解的特點(diǎn)，通過噴灑有機(jī)磷水解酶解決甲基對硫磷類農(nóng)藥的殘留問題，并通過快速檢測水果、蔬菜中甲基對硫磷的殘留量，控制高殘留農(nóng)藥蔬菜水果流入市場，降低農(nóng)藥中毒發(fā)生率，保障消費(fèi)者的安全[8]。

隨著人們對水果、蔬菜中農(nóng)藥殘留及食品安全性問題的關(guān)注，及各種技術(shù)縱向的發(fā)展與橫向的聯(lián)用，農(nóng)藥殘留快速檢測技術(shù)的研究也將不斷深入發(fā)展[9]，在提出的高效快速檢測方法的基礎(chǔ)上還可以利用有機(jī)磷水解酶進(jìn)一步研制更便捷的農(nóng)藥殘留檢測產(chǎn)品，比如農(nóng)藥測定試劑盒[10]、檢測試紙[11]或便攜式分光光度計檢測槍等，這些產(chǎn)品若研制成功將實(shí)現(xiàn)隨時隨地對水果蔬菜進(jìn)行農(nóng)藥殘留檢測，確保水果蔬菜的安全性，為人類健康保駕護(hù)航。

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