16種微生物蛋白酶的生物信息學(xué)分析

富玉竹 李欣 李曄 王斯德 金麗華 于然

摘要：蛋白酶（protease）是以降解蛋白質(zhì)為主的糖苷酶，具有豐富的多樣性，在生物有機體中發(fā)揮著重要而又廣泛的作用，具有廣泛的研究和應(yīng)用價值。本研究采用ProtParam、ProtScale、SignalP 4.1 server和NPSA serve等生物信息學(xué)軟件，對天藍色鏈霉菌、普通擬桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌等16種微生物蛋白酶的理化性質(zhì)、蛋白結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)發(fā)生樹和功能域等進行了分析。結(jié)果表明：通過分析16種微生物蛋白酶的穩(wěn)定性發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌、唾液鏈球菌、短小芽孢桿菌、綠膿桿菌為不穩(wěn)定蛋白;二級結(jié)構(gòu)由α螺旋、β轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲和延伸鏈等結(jié)構(gòu)元件組成;除了節(jié)桿菌屬、無乳鏈霉菌、普通擬桿菌、腸桿菌屬具有信號肽，其余蛋白酶氨基酸序列不具有信號肽的特點。可以推測出蛋白酶為非分泌性蛋白;只有綠膿桿菌和豬鏈球菌有跨膜結(jié)構(gòu)，剩下其余幾種微生物均沒有跨膜結(jié)構(gòu)。具有2個蛋白功能域，分別為Peptidase S8 familyi、Fn3_5like domain。

關(guān)鍵詞：微生物;蛋白酶;序列分析;生物信息學(xué);理化性質(zhì);蛋白結(jié)構(gòu);信號肽

中圖分類號： S188+.3文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）04-0065-08

收稿日期：2018-12-14

基金項目：北京市自然科學(xué)基金（編號：2182019）;北京市教育委員會項目（編號：1-PXM2018-014306-000057/7）;國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金（編號：51708005）;北京電子科技職業(yè)學(xué)院重點課題（編號：2019-KXZ）;北京市優(yōu)秀人才資助（拔尖自然科學(xué)）（編號：2020Z002-002-KWT）。

作者簡介：富玉竹（2000—），女，北京人，研究方向為酶與基因重組，E-mail：1002967685@qq.com;共同第一作者：李欣（1998—），女，北京人，研究方向為生物技術(shù)，E-mail：1217436404@qq.com。

通信作者：李?曄，博士，副教授，研究方向為蛋白重組表達和分子診斷。E-mail：liyeyashi@163.com。

蛋白酶是催化水解蛋白質(zhì)肽鍵的一類酶的總稱[1]，在生物有機體中發(fā)揮著重要而又廣泛的作用，具有廣泛的研究和應(yīng)用價值。按其水解多肽的方式，可以將其分為內(nèi)肽酶和外肽酶2類。內(nèi)肽酶將蛋白質(zhì)分子內(nèi)部切斷，形成分子質(zhì)量較小的肽。外肽酶從蛋白質(zhì)分子的游離氨基或羧基的末端逐個將肽鍵水解而游離出氨基酸，前者為氨肽酶，后者為羧肽酶[2-4]。蛋白酶在食品產(chǎn)業(yè)中運用十分廣泛，如在白酒發(fā)酵中可添加適量蛋白酶對白酒香氣進行改良[5-7]，或在對肉類進行加工中添加，改進肉的嫩度，提升口感[8-10]，或使用蛋白酶對小麥提取有益物質(zhì)[11-13]，或?qū)ξr進行改良[14-15]，等等。市面上食品用蛋白酶大部分來源于植物中蛋白酶的分離提取，如木瓜蛋白酶，但是提取率較低[16-18]，若采用基因工程手段，對其進行分析優(yōu)化，使其在細菌中重組表達，則有望大幅度提高產(chǎn)量，進一步推廣工業(yè)化應(yīng)用[19]。

本研究采用生物信息學(xué)的分析方法，結(jié)合ProtParam、ProtScale、TargetP 1.1 Server等生物信息學(xué)軟件，對天藍色鏈霉菌、節(jié)桿菌屬、普通擬桿菌、金黃色葡萄球菌、腸桿菌屬、霍氏腸桿菌、大腸桿菌、粗球孢子菌、無乳鏈霉菌、枯草桿菌、嗜堿芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、短小芽胞桿菌、來源于海洋細菌、唾液鏈球菌、綠膿桿菌等共計16種微生物蛋白酶氨基酸序列的理化性質(zhì)、序列分子進化、親/疏水性、磷酸化位點、二級結(jié)構(gòu)、功能域、亞細胞定位、信號肽等進行分析和預(yù)測，為下一步進行基因工程菌構(gòu)建、表達、重組蛋白酶奠定基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1?數(shù)據(jù)來源

試驗中氨基酸序列均來自于美國國家生物信息中心（NCBI）中已登錄的序列，分別為天藍色鏈球菌、節(jié)桿菌屬、普通擬桿菌、金黃色葡萄球菌、腸桿菌屬、霍氏腸桿菌、大腸桿菌、粗球孢子菌、無乳鏈霉菌、枯草桿菌、嗜堿芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、來源于海洋細菌、唾液鏈球菌、綠膿桿菌，共16種微生物（表1）。

1.2?研究方法

運用ProtParam分析微生物蛋白酶序列理化性質(zhì);運用MEGA 5軟件中的鄰接（neighbor-joining，簡稱NJ）法建分子進化樹;運用ProtScale進行親/疏水性的分析和預(yù)測;運用TargetP 1.1 Server進行亞細胞定位分析和預(yù)測;運用在線工具SignalP 4.1 server進行信號肽分析和預(yù)測;運用NPSA server進行微生物蛋白酶氨基酸序列二級結(jié)構(gòu)分析和預(yù)測;運用NetPhosK 2.0 Server進行磷酸化位點分析和預(yù)測;運用TMHMM 2.0 Server進行跨膜結(jié)構(gòu)域的分析和預(yù)測;運用NCBI上的保守域數(shù)據(jù)庫（CDD）進行功能結(jié)構(gòu)域分析和預(yù)測（表2）。

2?結(jié)果與分析

2.1?微生物蛋白酶氨基酸理化性質(zhì)特性

經(jīng)過ProtParam工具分析16種微生物蛋白酶氨基酸序列，結(jié)果見表3。先討論各蛋白酶的氨基酸數(shù)目，除天藍色鏈霉菌、節(jié)桿菌屬、普通擬桿菌、腸桿菌屬、無乳鏈霉菌、來源于海洋細菌外，其他的微生物蛋白酶氨基酸殘基數(shù)量在325～654個之間。以分子量來說，無乳鏈霉菌最大，粗球孢子菌最小。所選細菌蛋白酶理論等電點（pI）均在4.78～6.61之間，霍氏腸桿菌最大，金黃色普通球菌菌最小。所選細菌蛋白酶脂肪指數(shù)基本集中在80左右。通

過分析16種微生物蛋白酶的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)除金黃色葡萄球菌、唾液鏈球菌、短小芽孢桿菌、綠膿桿菌為不穩(wěn)定蛋白外，其他均為穩(wěn)定蛋白。在天藍色鏈霉菌中，最豐富的氨基酸是Ala、Gly和Arg，可能與維持蛋白酶空間結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性有關(guān)[20]。

2.2?微生物蛋白酶氨基酸分子進化樹分析

對16種微生物蛋白酶氨基酸序列，運用MEGA5軟件中的NJ法進行分子系統(tǒng)進化分析，得到微生物蛋白酶氨基酸序列的分子進化樹（圖1），可以較為精確地確定其微生物的進化地位[21-22]。綠膿桿菌、唾液鏈球菌、霍氏腸桿菌、嗜堿芽孢桿菌、無乳鏈霉菌、金黃色葡萄球菌、來源于海洋細菌、短小芽胞桿菌、地衣芽孢桿菌、枯草桿菌聚在同一支，而粗球孢子菌，天藍色鏈霉菌、大腸桿菌、節(jié)桿菌屬。腸桿菌屬、普通擬桿菌聚在另一分支上，表明微生物蛋白酶有較高的保守性，可以作為微生物遺傳分子進化的重要理論依據(jù)。

2.3?微生物蛋白酶氨基酸序列的疏水性/親水性

疏水性指的是1個分子（疏水物）與水互相排斥的物理性質(zhì)。蛋白質(zhì)由20種氨基酸組成，它們的親/疏水性的相互作用是維持蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)最重要的作用力之一。經(jīng)ProtScale對16條微生物蛋白酶氨基酸序列疏水性/親水性進行預(yù)測，正值表示疏水，值越大表示疏水性越強;負值表示親水，值越大表示親水性越強;而數(shù)值在-0.5～0.5之間的主要表現(xiàn)為兩性氨基酸[23-25]。以枯草桿菌為例的結(jié)果如圖2所示，多肽鏈中第336位甘氨酸有最低分值-2.10，親水性最強;第115位天冬氨酸有最高分值2.522，疏水性最強。其他位的氨基酸疏/親水性均勻分布，且親水性氨基酸數(shù)量較多。因此在整個蛋白酶肽鏈上表現(xiàn)為一定的親水性，但親水性較弱。

2.4?微生物蛋白酶亞細胞定位分析

亞細胞定位是指某種蛋白或表達產(chǎn)物在細胞內(nèi)的具體存在部位[26]。對16條微生物蛋白酶氨基酸序列采用TargetP 1.1 Server在線生物學(xué)工具進行了亞細胞定位。結(jié)果表明，除來源于海洋細菌可信度為5沒有明確定位以外，其余的可信度均為3或3之下。由此推斷，在天藍色鏈霉菌、節(jié)桿菌屬、普通擬桿菌等微生物中，微生物蛋白酶的定位有所不同。

2.5?微生物蛋白酶氨基酸序列磷酸化位點分析

磷酸化是蛋白質(zhì)重要的翻譯后修飾之一，磷酸化反應(yīng)泛指把磷酸基團在酶催化作用下轉(zhuǎn)移到其他化合物的過程，是生物體內(nèi)一種普通的調(diào)節(jié)方式，在細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程中起重要作用[27-29]。本研究以16條微生物蛋白酶氨基酸序列為對象，通過NetPhosK 2.0 Server對其蛋白酶氨基酸序列進行預(yù)測，預(yù)測其絲氨酸（Ser）、蘇氨酸（Thr）、酪氨酸（Tyr）磷酸化位點位置及數(shù)量。以枯草桿菌為例，研究結(jié)果（圖3）顯示，磷酸化位點有34個，蘇氨酸的位點最多。其中，酪氨酸磷酸化位點有Y81、Y99、Y221、Y325、Y339、Y413，共計6個;絲氨酸磷酸化位點有 S9、S56、S138、S140、S163、S180、S191、S205、S242、S271、S280、S415，共計12個;蘇氨酸磷酸化位點有T19、T62、T84、T121、T135、T162、T201、T223、T277、T314、T316、T322、T337、T352、T380、T385，共計16個。對16種微生物蛋白酶氨基酸序列進行分析，除腸桿菌屬、節(jié)桿菌屬、普通擬桿菌、無乳鏈霉菌、來源于海洋細菌外，其他磷酸化位點數(shù)量都在100個以下。其中，絲氨酸磷酸化位點較多的是無乳鏈霉菌、來源于海洋細菌、節(jié)桿菌屬，蘇氨酸磷酸化位點較多的是無乳鏈霉菌、來源于海洋細菌、節(jié)桿菌屬，酪氨酸磷酸化位點較多的是來源于海洋細菌、無乳鏈霉菌、普通擬桿菌（表4）。

2.6?微生物蛋白酶的二級結(jié)構(gòu)分析

蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)是指蛋白質(zhì)多肽鏈本身的折疊和盤繞的方式，其基本單位主要有α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲4種類型。二級結(jié)構(gòu)是通過骨架上的羰基和酰胺基團之間形成的氫鍵維持的，氫鍵是穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu)的主要作用力[30-31]。微生物蛋白酶均由α螺旋、β轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲和延伸鏈等結(jié)構(gòu)元件組成，以16條微生物蛋白酶氨基酸序列為研究對象進行蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析預(yù)測。以枯草桿菌為例，通過NPSA server程序?qū)ζ涞鞍酌赴被嵝蛄羞M行二級結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明，其中α螺旋（35.55%）所占比例最高，其次為無規(guī)則卷曲（27.73%）或延伸鏈（24.40%） β轉(zhuǎn)角（12.32%）所占比例最小（表5）。

2.7?微生物蛋白酶信號肽分析

信號肽位于分泌蛋白的 N 端，一般由 15～30 個氨基酸組成，并大致分為3個區(qū)段：一個帶正電的 N 末端; 一個中間疏水序列，它是信號肽的主要功能區(qū); 一個較長的帶負電荷的 C 末端，是信號序列切割位點。對信號肽分析，是進行體外重組表達的一項重要工作。外源蛋白在宿主菌，如大腸桿菌中的表達形式多為細胞內(nèi)不溶性表達（包涵體），少數(shù)為細胞外分泌表達。利用信號肽來引導(dǎo)外源蛋白定位分泌到細胞特定區(qū)間，提高可溶性，可避免因包涵體復(fù)性帶來的困難[32]。利用工具Signal 4.1 server對16條微生物蛋白酶氨基酸序列進行信號肽分析，其中無乳鏈霉菌蛋白酶的信號肽分析結(jié)果見圖4。

由圖4可見，原始剪切位點C最大值在第31個氨基酸，分值為0.768;綜合剪切位點Y最大值在第31個氨基酸，分值是0.698;信號肽S最大值在第14個氨基酸，分值為0.838;平均信號肽S值在第1～30個氨基酸之間，平均值是0.652。因此，推斷蛋白酶有信號肽存在的可能性，可能是分泌性蛋白。對16種微生物蛋白酶進行信號肽的相應(yīng)分析，除了節(jié)桿菌屬具有信號肽，位點在20與21之間;無乳鏈霉菌具有信號肽，位點在30與31之間;普通擬桿菌具有信號肽，位點在20與21之間;腸桿菌屬具有信號肽，位點在20與21之間，其他蛋白酶氨基酸序列不具有信號肽的特點。

2.8?微生物蛋白酶跨膜結(jié)構(gòu)域的分析

跨膜結(jié)構(gòu)域是膜內(nèi)蛋白質(zhì)與膜脂相結(jié)合的主要部位，一般由 20個左右的疏水氨基酸殘基組成，形成α螺旋，固著于細胞膜上起錨定作用，對正確認識和理解蛋白質(zhì)的功能、結(jié)構(gòu)、分類 、方位及蛋白質(zhì)在細胞中的部位和作用均有著重要的指示意義。以無乳鏈霉菌為研究對象，用在線生物學(xué)工具TMHMM 2.0 Server進行預(yù)測分析，結(jié)果見圖5：無乳鏈霉菌有1個跨膜區(qū)，為1次跨膜的膜蛋白。

2.9?微生物蛋白酶功能域分析

蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域是指在超二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上組裝而成的，多肽鏈折疊成近乎球狀的組裝體，這種相對獨立的三維實體叫結(jié)構(gòu)域。由一個或幾個完整獨立的結(jié)構(gòu)域組成。利用生物學(xué)工具CDD分析無乳鏈霉菌蛋白酶氨基酸序列功能結(jié)構(gòu)域，結(jié)果（圖6）表明，無乳鏈霉菌蛋白酶具有3個功能域：N端164～650的肽段與Peptidase S8 family有較高的同源性，N端402～545的肽段與PA_C5a有較高的同源性，N端664～774的肽段與Fn3_5 -like domain有較高的同源性。

3?討論與結(jié)論

采用生物信息學(xué)的分析方法?以枯草桿菌為重點，對天藍色鏈霉菌、節(jié)桿菌屬、普通擬桿菌等16種微生物蛋白酶氨酸序列的理化特性、親/疏水性、信號肽、二級結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)發(fā)育進化、功能結(jié)構(gòu)域、磷酸化位點等進行了預(yù)測和推斷。

蛋白酶氨基酸序列理化性質(zhì)分析顯示，天藍色鏈霉菌、節(jié)桿菌屬、普通擬桿菌等微生物理論等電點pI大小不等，脂肪指數(shù)基本上在80左右，除金黃色葡萄球菌、唾液鏈球菌、短小芽孢桿菌、綠膿桿菌為不穩(wěn)定蛋白外，其余的均為穩(wěn)定蛋白。在天藍色鏈霉菌中，最豐富的氨基酸是Ala、Gly和Arg。

系統(tǒng)進化分為2支，綠膿桿菌、唾液鏈球菌、霍氏腸桿菌、嗜堿芽孢桿菌、無乳鏈霉菌、金黃色葡萄球菌、來源于海洋細菌、短小芽胞桿菌、地衣芽孢桿菌、枯草桿菌聚在同一分支，而粗球孢子菌、天藍色鏈霉菌、大腸桿菌、節(jié)桿菌屬、腸桿菌屬、普通擬桿菌聚在另一分支上。

在整個微生物蛋白酶多肽中，疏/親水性氨基酸均勻分布在其中，且親水性氨基酸數(shù)量略多，因此在整個蛋白酶肽鏈上表現(xiàn)為一定的親水性，但親水性較弱。除源于海洋細菌可信度為5沒有明確定位外，其余的可信度均為3或3之下，由此推斷，在天藍色鏈霉菌、節(jié)桿菌屬、普通擬桿菌等微生物中，蛋白酶的定位有所不同?？莶輻U菌的磷酸化位點有34個，蘇氨酸的位點最多。

在微生物蛋白酶氨基酸序列中，α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈、無規(guī)則卷曲等二級結(jié)構(gòu)元件的數(shù)量、比例差異不大，在整個肽鏈中無規(guī)則卷曲占據(jù)主導(dǎo)地位。在微生物蛋白酶功能域分析中，通過對16種微生物蛋白酶氨基酸序列分析，最多只有3個功能域。蛋白酶在不同生物種類中的大小數(shù)量是不同的，在大多數(shù)微生物中是由325～654個氨基酸組成的。

目前，蛋白酶在許多方面都有相關(guān)研究，如干酪生產(chǎn)、肉類嫩化和植物蛋白改性等?，F(xiàn)今市面上銷售的蛋白酶大部分來源于對動物及植物組織的提取，雖然可基本滿足市面上對其需求，但依然存在產(chǎn)率低、成本高等問題。近年來，隨著基因工程手段的發(fā)展，在分析清楚蛋白酶的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的前提下可以通過分子生物學(xué)手段對其進行異源重組表達，為探究其性質(zhì)及在生物學(xué)過程中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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