NIRS結(jié)合一致性檢驗(yàn)及相關(guān)系數(shù)法快速鑒別藥用菊花和其他菊花*

★ 劉家水 談永進(jìn)* 毛小明 陳向陽 馬逢時（安慶醫(yī)藥高等專科學(xué)校藥學(xué)系 安徽 安慶 246052）

菊花來源于菊科菊Chrysanthemum morifoliumRamat.的頭狀花序，2015版中國藥典中收載有杭菊、貢菊、亳菊、滁菊、懷菊五種藥用菊花，具有散風(fēng)清熱，平肝明目，清熱解毒之功［1］。目前中藥材市場和花茶市場菊花品種繁多，主要有藥用菊花和大馬牙、金絲皇菊、野菊Ghrysanthemum indicumL.、洋甘菊Matricaria recutitaL.、金盞菊Calendula of ficinalisL.及雪菊Coreopsis tinctoriaNutt.等其他茶飲菊花，質(zhì)量參差不齊。前人有關(guān)菊花品質(zhì)的鑒別研究主要集中在性狀、電子鼻、薄層色譜、遠(yuǎn)紅外等方法及菊花含硫量檢測方面［2-4］，近年來NIRS在中藥品種、真?zhèn)味ㄐ澡b別研究方面，相對傳統(tǒng)方法具有可以車載現(xiàn)場檢測、檢測結(jié)果報告快速、準(zhǔn)確、人為影響因素小等優(yōu)勢，已有學(xué)者進(jìn)行研究報道［5-8］，其中張丹雁等報道了近紅外光譜快速鑒別南板藍(lán)根真?zhèn)蝺?yōu)劣，兩種模型在專屬性考察時難以將南板藍(lán)根和南板藍(lán)地上莖區(qū)分，結(jié)合成分分析建議擴(kuò)大南板藍(lán)藥用部位。本文收集不同產(chǎn)地、不同品種的藥用菊花和其他茶飲菊花作為研究對象，擬采用OPUS近紅外光譜分析軟件定性鑒別模塊中車載近紅外光譜儀普遍應(yīng)用于西藥快速定性鑒別的一致性檢驗(yàn)方法對兩者進(jìn)行鑒別研究，同時采用相關(guān)系數(shù)法進(jìn)一步驗(yàn)證一致性檢驗(yàn)法的內(nèi)部量化關(guān)系和準(zhǔn)確性，探討兩種方法應(yīng)用于不同產(chǎn)地、不同品種和形態(tài)及化學(xué)組分相似的藥用菊花和其他茶飲菊花鑒別的可行性，為進(jìn)一步完善和充實(shí)菊花鑒別方法提供參考，思考NIRS應(yīng)用于化學(xué)成分含量相似的復(fù)雜體系樣品鑒別時的局限性與面臨的困惑。

1 材料

1.1 儀器 傅立葉變換近紅外光譜儀（Matrix-F，德國布魯克公司），光譜軟件（OPUS，德國布魯克公司），手持光纖探頭，銦鎵砷檢測器，超高速多功能粉碎機(jī)（LYSF-500-Y，長沙市卓成醫(yī)療器械有限公司），藥典標(biāo)準(zhǔn)篩（60目）。

1.2 藥品 5種不同產(chǎn)地、不同品種和形態(tài)及化學(xué)組分相似的藥用菊花樣品杭菊、貢菊、亳菊、滁菊、懷菊分別采自浙江桐鄉(xiāng)、安徽歙縣、安徽亳州、安徽滁州、河南焦作等道地產(chǎn)區(qū)，大馬牙采自安徽亳州譙城區(qū)，金絲皇菊采自安徽東至縣，野菊采自安徽貴池區(qū)，洋甘菊、金盞菊、雪菊收集于安徽亳州中藥材市場，以上樣品經(jīng)安慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校談永進(jìn)教授鑒定為菊科杭菊、貢菊、亳菊、滁菊、懷菊、大馬牙（亳菊栽培品種）、金絲皇菊、野菊、洋甘菊、金盞菊及雪菊的頭狀花序。樣品信息見表1。

表1 藥用菊花和其他菊花樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 光譜采集方法 取干燥同條件密閉儲存的藥用菊花和其他菊花樣品，粉粹過60目標(biāo)準(zhǔn)篩，取適量粉末置入光譜采集管中，用光纖探頭勻力壓平粉末，對準(zhǔn)光譜采集管底部掃描，得到樣品的全波長近紅外光譜，重復(fù)掃描3次，分析時用平均光譜。掃描時間32s，分辨率8cm-1，溫度18～25℃，掃描次數(shù)64［7-8］。以上光譜采集方法與文獻(xiàn)報道和目前食品藥品監(jiān)督部門應(yīng)用一致性檢驗(yàn)法測定西藥的光譜采集方法基本一致［7-10］。

2.2 光譜預(yù)處理方法和波長范圍的選擇 近紅外光譜由含氫的一級、二級倍頻和合頻吸收區(qū)域組成，光譜重疊現(xiàn)象嚴(yán)重，區(qū)分度不高，分析前采用合適的化學(xué)計量學(xué)方法進(jìn)行光譜預(yù)處理，以降低或消除來自高頻噪音、基線漂移與光散射等因素產(chǎn)生的光譜誤差［7-8］。本實(shí)驗(yàn)通過光譜分析軟件考察矢量歸一化、導(dǎo)數(shù)化及導(dǎo)數(shù)化+矢量歸一化等光譜預(yù)處理方法，其中矢量歸一化可以消除光程或樣品厚度帶來的影響，導(dǎo)數(shù)化可以消除基線漂移等因素影響，導(dǎo)數(shù)化+矢量歸一化預(yù)處理可降低或消除各類因素對光譜的干擾，進(jìn)一步接近真實(shí)光譜［7-8］。合頻區(qū)波長范圍為4 000～5 000cm-1，一級倍頻區(qū)波長范圍為5 000～9 000cm-1，二級倍頻區(qū)波長范圍為9 000～12 000cm-1，二級倍頻區(qū)噪音大，基線漂移嚴(yán)重，5 168cm-1是水分對光譜影響敏感區(qū)，一般二級倍頻區(qū)和水份敏感區(qū)不作分析區(qū)域［7-8］，本實(shí)驗(yàn)在合頻和一級倍頻信息量豐富區(qū)內(nèi)分析光譜數(shù)據(jù)，光譜波長范圍的選擇采用交互式選擇方式。以上光譜預(yù)處理方法和波長范圍的選擇方法與文獻(xiàn)報道中方法基本一致［7-8］。

2.3 光譜鑒別模型的建立方法 本實(shí)驗(yàn)采用一致性檢驗(yàn)建立不同產(chǎn)地、不同品種和形態(tài)及化學(xué)組分相似的藥用菊花和其他菊花鑒別模型，相關(guān)系數(shù)法進(jìn)一步驗(yàn)證一致性檢驗(yàn)方法的量化關(guān)系和準(zhǔn)確性。一致性檢驗(yàn)是一種快捷的圖譜比較方法，用于比較待測光譜與參考光譜是否具有一致性，是使用正品樣品參考光譜為每個波長點(diǎn)設(shè)定容許范圍，檢驗(yàn)待測樣品光譜的每個吸光度值是否在容許范圍內(nèi)，待測樣品光譜在每個波長點(diǎn)均有一個CI值，各波長點(diǎn)CI值連接成一張完整的CI光譜，待測樣品與參考光譜具有一致性要求CI光譜的每個CI值均不超過CI限度值［7-8］。相關(guān)系數(shù)法是指在特定波長范圍內(nèi)將待測光譜與參考光譜或樣品集平均光譜進(jìn)行比較，計算待測光譜與參考光譜相似度高低［7-8］。

2.4 藥用菊花和其他菊花近紅外光譜圖 不同產(chǎn)地、不同品種和形態(tài)相似的藥用菊花和其他菊花的化學(xué)組分相似，化學(xué)成分含量稍不同，在近紅外光譜中相似的成分組成掩蓋了成分含量的差異，直觀上觀察難以區(qū)別各光譜差異。圖1中藥用菊花和其他菊花的近紅外光譜形態(tài)非常相似，很難從光譜圖直接進(jìn)行判斷，僅雪菊的化學(xué)組分和含量與其他菊花差異較大［11］，可以從譜圖上看出與其他光譜差異稍大，但仍難以數(shù)據(jù)或更直觀的形式顯示。本文采用NIRS結(jié)合一致性檢驗(yàn)和相關(guān)系數(shù)法采用合適化學(xué)計量學(xué)方法提取光譜中特征信息，找出復(fù)雜光譜中所掩蓋的特性信息用于光譜分析。

圖1 藥用菊花和其他菊花的近紅外光譜

2.5 一致性檢驗(yàn)方法的建立與驗(yàn)證

2.5.1 樣品集與檢驗(yàn)集的選擇 依據(jù)樣品鑒定結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)選取152個藥用菊花光譜作為樣品集，63個其他菊花光譜作為檢驗(yàn)集。

2.5.2 一致性檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕?通過對預(yù)處理方法和波長范圍的篩選，優(yōu)選光譜最佳預(yù)處理方法為一階導(dǎo)數(shù)+矢量歸一化法，交互式篩選最佳波長范圍 為 8 956.0～7 216.5cm-1、6 587.8～5 361.3cm-1、4 948.6～4 038.3cm-1，17點(diǎn)平滑建立模型。建模時金絲皇菊2個樣品出現(xiàn)異常值，在CI=3.0限度值以下，不能區(qū)分開，經(jīng)查文獻(xiàn)和與老藥農(nóng)交流顯示金絲皇菊為黃貢菊的選育品種，與貢菊親緣關(guān)系較近，可能金絲皇菊與貢菊的化學(xué)組分和含量極為相似，在建模時應(yīng)剔除［12］。在已建立的模型中，當(dāng)CI限度值為3時，可以看到菊花和其他菊花之間存在明顯差異，圖2中CI=3限度值下為樣品集，CI=3限度值上為檢驗(yàn)集，表明除金絲皇菊外藥用菊花和其他菊花可較好區(qū)分開。其中雪菊CI值在22.3～26.3之間，金盞菊的CI值在9.3～10.3之間，其他檢驗(yàn)集樣品CI值在3.3～7.3之間，而目前西藥一致性檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷腃I限度值一般設(shè)置為5及以上，本實(shí)驗(yàn)中在CI值為5時難以區(qū)分樣品集和檢驗(yàn)集。從圖3CI譜圖可看出樣品集光譜與檢驗(yàn)集光譜的整體的情況，在CI=3限度值下是有重疊部分，CI=3限度值以上只能看到檢驗(yàn)集CI光譜。

圖2 藥用菊花和其他菊花的一致性檢驗(yàn)?zāi)Ｐ团cCI限度值

圖3 藥用菊花和其他菊花的CI譜圖

2.5.3 一致性檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷尿?yàn)證 專屬性驗(yàn)證：本實(shí)驗(yàn)選取5份藥用菊花光譜和除金絲皇菊外5份其他菊花光譜為測試光譜，結(jié)果5份藥用菊花光譜均在CI=3限度值以下，5份其他菊花光譜均在CI=3限度值以上，表明除金絲皇菊外模型專屬性較強(qiáng)。

耐用性驗(yàn)證：本實(shí)驗(yàn)考察了不同光譜采集者、不同光譜采集時間等情況下模型的耐用性，結(jié)果均達(dá)到理想結(jié)果，表明模型耐用性較好。

2.6 相關(guān)系數(shù)方法的建立與驗(yàn)證

2.6.1 樣品集與檢驗(yàn)集的選擇 與一致性檢驗(yàn)建模相比，相關(guān)系數(shù)法不需過多樣品光譜生成閾值，建模時可選擇單一光譜或多張光譜的平均光譜作為參考光譜［7-8］。本實(shí)驗(yàn)中考慮到菊花成分復(fù)雜，單張光譜不能代表所有樣品信息，為增加模型的準(zhǔn)確性和可靠性，選定100張藥用菊花光譜作為樣品集，選定52張藥用菊花和63張其他菊花光譜為檢驗(yàn)集。

2.6.2 相關(guān)系數(shù)模型的建立與驗(yàn)證 通過預(yù)處理方法和波長范圍的篩選，選取最佳光譜預(yù)處理方法為二階導(dǎo)數(shù)化，交互式篩選的波長范圍為6 200～5 500cm-1、5 000～4 700cm-1，17點(diǎn)平滑建立相關(guān)系數(shù)模型，模型閾值設(shè)置為97%、98%和99%，統(tǒng)計檢驗(yàn)集與樣品集超過閾值的樣品數(shù)。結(jié)果見表2～3，表2中閾值97%、98%和99%時，52批藥用菊花與樣品集相似度均通過驗(yàn)證，表3中閾值為0.99時僅2個金絲皇菊樣品出現(xiàn)異常，這與建立一致性檢驗(yàn)?zāi)Ｐ蜁r相同，可能金絲皇菊與貢菊的化學(xué)組分和含量極為相似有關(guān)，表4列舉了5份藥用菊花和6份其他菊花與樣品集的相關(guān)系數(shù)，金絲皇菊與模型相關(guān)系數(shù)為0.9925，超過0.99閾值，建模時需剔除。通過表2～4可知宜將相關(guān)系數(shù)的閾值設(shè)定為0.99，此時可將藥用菊花和其他菊花區(qū)分，提高相關(guān)系數(shù)模型的可行性和準(zhǔn)確性。

表2 52張檢驗(yàn)集藥用菊花光譜與樣品集間的相關(guān)系數(shù)統(tǒng)計結(jié)果

表3 63批檢驗(yàn)集其他菊花與樣品集間的相關(guān)系數(shù)統(tǒng)計結(jié)果

表4 5份藥用菊花和6份其他菊花與樣品集的相關(guān)系數(shù)

2.7 兩種方法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析及各自的優(yōu)缺點(diǎn) 本實(shí)驗(yàn)中采取一致性檢驗(yàn)方法鑒別不同產(chǎn)地、不同品種和形態(tài)及化學(xué)組分相似的藥用菊花和其他菊花，建模時都出現(xiàn)異常值，異常值為金絲皇菊。除金絲皇菊外模型的專屬性和耐用性良好，相關(guān)系數(shù)法進(jìn)一步驗(yàn)證了一致性檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷膶?shí)驗(yàn)結(jié)果，并給出了相關(guān)光譜間的量化值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與一致性檢驗(yàn)方法基本一致，均存在異常值，表明一致性檢驗(yàn)和相關(guān)系數(shù)法鑒別藥用菊花和其他菊花存在繼續(xù)研究和思考的地方。說明目前NIRS和化學(xué)計量學(xué)方法在鑒定化學(xué)組分含量類似情況下還不能做到像液相色譜、生物技術(shù)鑒別結(jié)果那樣準(zhǔn)確一致。但對于組分或含量差異大的樣品，NIRS結(jié)合一致性檢驗(yàn)和相關(guān)系數(shù)法還是表現(xiàn)出快速、準(zhǔn)確的優(yōu)勢。

通過本次實(shí)驗(yàn)，可知一致性檢驗(yàn)方法能夠一次檢驗(yàn)多個待測樣品，鑒別快速，從CI譜圖可直觀看出樣品是否在樣品集內(nèi)。但也存在幾個方面缺點(diǎn)：①建模時需要的樣品集數(shù)量要求要多，一般至少30批以上，尤其是像復(fù)雜體系樣品藥用菊花，存在品種多，栽培類型多，產(chǎn)地多，栽培環(huán)境差異等諸多對化學(xué)成分含量有影響的樣品，建模時樣品集一定要包含所有可能體現(xiàn)樣品信息的樣品，建模前期準(zhǔn)備工作量大；③對于化學(xué)組分和成分含量極為相似的樣品在檢驗(yàn)時容易出現(xiàn)假陽性等，要注意區(qū)分，今后仍要加強(qiáng)光譜采集、光譜信息提取分析等方面研究力度。相關(guān)系數(shù)法能夠較快速、直觀的給出待測光譜與樣品集的相似度數(shù)據(jù)，建模時不需要過多光譜作為樣品集。但也存在以下幾個方面缺點(diǎn)：①相關(guān)系數(shù)法每次只能檢測一個樣品；②樣品集采取的是樣品平均光譜，可能不能全面體現(xiàn)樣品集信息等；③不同波長范圍內(nèi)相似度可能不一樣，在寬譜段條件下計算相關(guān)系數(shù)，會忽略檢驗(yàn)光譜與參考光譜之間的小譜峰差異等。在實(shí)際鑒別工作，NIRS應(yīng)用于復(fù)雜體系鑒別時，不能完全借鑒西藥鑒別經(jīng)驗(yàn)，要結(jié)合實(shí)際，根據(jù)工作需要選擇最佳的鑒別方法。

3 討論

NIRS結(jié)合一致性檢驗(yàn)法和相關(guān)系數(shù)法兩種方法均具有建模簡單、快速等優(yōu)點(diǎn)，目前在國內(nèi)外西藥及中成藥快速分析中得到應(yīng)用［9-10］。一致性檢驗(yàn)法只要樣品集足夠大，一般不會出現(xiàn)假陽性，相關(guān)系數(shù)法對樣品數(shù)量要求不高。目前食品藥品監(jiān)督部門已推廣車載近紅外光譜結(jié)合一致性檢驗(yàn)法和相關(guān)系數(shù)法應(yīng)用，對打擊偽劣藥品具有重要意義，而且建立的模型可以在食藥監(jiān)體系內(nèi)共享，實(shí)現(xiàn)了數(shù)據(jù)間的傳遞、維護(hù)及更新等。該方法之所以能夠推廣應(yīng)用與檢測對象西藥和部分中成藥的化學(xué)組分和成分含量差異大有極大關(guān)系，而對于化學(xué)組分和成分含量差異相似的復(fù)雜體系存在一定的假陽性率，本實(shí)驗(yàn)中金絲皇菊出現(xiàn)了假陽性，建模時應(yīng)剔除。復(fù)雜體系樣品近紅外光譜反映的是成分的綜合信息，如中藥的品種、產(chǎn)地、加工炮制等因素均會影響光譜信息，在樣品處理過程中，要保持樣品的一致性，才能確保模型的準(zhǔn)確性。本實(shí)驗(yàn)中NIRS結(jié)合一致性檢驗(yàn)和相關(guān)系數(shù)法鑒別藥用菊花和其他菊花，具有一定的實(shí)用性和借鑒意義。今后仍需在復(fù)雜體系樣品的樣品處理、光譜采集、光譜信息提取及化學(xué)計量學(xué)等領(lǐng)域深入研究，提高光譜信息提取的精確性，模型的可靠性，以期更準(zhǔn)確鑒別復(fù)雜體系樣品及在相關(guān)藥品生產(chǎn)、在線監(jiān)測等領(lǐng)域的推廣應(yīng)用。