蛋白激酶抑制劑B對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移能力的影響

張丹鳳 李晶 于海波 竇鵬揮 肖曉超 薛晴

(佳木斯大學(xué) 1附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154007；2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；3佳木斯市婦幼保健院；4佳木斯大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院)

卵巢癌為婦科腫瘤首位的三大惡性腫瘤之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年全世界大約新發(fā)病例23.9萬〔1〕，死亡患者超出15萬人次〔2〕，5年生存率只有30%〔3〕。通常其發(fā)生發(fā)展可能與相關(guān)腫瘤蛋白刺激卵巢上皮細(xì)胞增殖、異常分裂及細(xì)胞因子的改變有關(guān)。作為蛋白激酶抑制劑(PKI)家族中新的耐熱蛋白PKIB，與多數(shù)腫瘤關(guān)系緊密，如前列腺癌、乳腺癌、肺癌等，特別是其在乳腺癌細(xì)胞增殖中發(fā)揮效應(yīng)。目前PKIB低表達(dá)對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移影響的研究報(bào)道較少。本研究分析PKIB低表達(dá)對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖、侵襲遷移能力的影響。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞來源 卵巢癌細(xì)胞株A2780細(xì)胞購于美國菌種保藏中心(ATCC)。用MCCOY 5A和 RPIM1640 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，37℃，5% CO2培養(yǎng)，培養(yǎng)基更換時(shí)間依細(xì)胞狀態(tài)來確定(每天或隔天)，實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)期生長較好的細(xì)胞(形態(tài)、形狀、期別等)。

1.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將A2780細(xì)胞懸液種于6孔板中，融合度為70%～90%且需細(xì)胞貼壁。每孔的轉(zhuǎn)染試劑混合液為質(zhì)粒2 μg(siRNA 15 μl)+轉(zhuǎn)染試劑6 μl+無血清無雙抗RPMI1640 200 μl。靜置20 min于冰上。先逐孔丟棄細(xì)胞原培養(yǎng)液，后加入200 μl轉(zhuǎn)染試劑混合液及培養(yǎng)基1.3 ml(含10%血清的RPMI1640)。需輕搖動(dòng)混勻，培養(yǎng)在培養(yǎng)箱中(環(huán)境37℃、含5%CO2)。72 h后取總蛋白備用。

1.3試劑 PKIB抗體購于美國 Abcam(Cambridge，MA，USA)，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒購自DAKO，免疫組化抗原修復(fù)液乙二胺四乙酸(EDTA)購自中杉金橋生物公司，山羊血清封閉液購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，磷酸鹽緩沖液(PBS)、焦碳酸二乙酸(DEPC)試劑購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司，ABI PRISM 7500 Sequence Detection System(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)，高速低溫冷凍離心機(jī)購自Heraeus，光學(xué)顯微鏡購自奧林巴斯公司。

1.4CCK-8 細(xì)胞生長實(shí)驗(yàn) 把轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)消化、離心、重懸、計(jì)數(shù)，在 96 孔板內(nèi)行細(xì)胞接種(1 000個(gè)/孔)，需設(shè) 4 個(gè)復(fù)孔處理每組細(xì)胞后在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育細(xì)胞。10%CCK-8滴加時(shí)間是6 h、第 1、2、3、4、5 天，孵育2 h(避光、37℃)，測 450 nm的吸光度(OD)值(用酶標(biāo)儀操作)。重復(fù)操作3次上述實(shí)驗(yàn)。

1.5細(xì)胞侵襲能力檢測 采用Matrigel小室進(jìn)行，人卵巢癌細(xì)胞接種到上室以1×104/孔的密度，下室接種巨噬細(xì)胞以 1×104/ 孔的密度。培養(yǎng)3 d，取出小室濾膜下表面的細(xì)胞，離心后重懸于100 μl的PBS，甩片。先行細(xì)胞涂片干燥、染色，侵襲細(xì)胞數(shù)量用熒光顯微鏡觀察和計(jì)數(shù)。

1.6細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞遷移能力 細(xì)胞密度要求5×108/L，用6孔板接種，在溫箱孵育過夜(5%CO2)，細(xì)胞匯合度要達(dá)到100%。記號(hào)筆在每個(gè)孔的背面做好劃痕標(biāo)記，便于數(shù)據(jù)獲取時(shí)保持位置一致。垂直于標(biāo)記線快速進(jìn)行劃痕采用無菌槍頭。反復(fù)沖洗細(xì)胞孔以去除懸浮細(xì)胞(用PBS)。在37℃、5%CO2條件下孵育，前提是在培養(yǎng)孔內(nèi)加入不含血清的DMEM培養(yǎng)基。取樣依據(jù)時(shí)間設(shè)計(jì)點(diǎn)，顯微鏡下拍照，先測定劃痕的初始距離(0 h)；按照時(shí)間設(shè)定要求依次測定劃痕距離并拍照儲(chǔ)存后計(jì)算細(xì)胞遷移率，重復(fù)3次上述實(shí)驗(yàn)過程。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS15.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1PKIB對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖的影響 PKIB shRNA組24、48、72 h細(xì)胞增殖能力明顯高于NC組(P<0.05)，見表1。

表1 兩組培養(yǎng)不同時(shí)間后細(xì)胞增殖能力值，n=4)

與NC組比較：1)P<0.05

2.2侵襲能力檢測 PKIB shRNA組侵襲穿膜細(xì)胞數(shù)〔(101+27)個(gè)〕明顯高于NC組〔(47+12)個(gè)〕(P<0.05)。見圖1。

2.3遷移能力測定 PKIB shRNA組遷移能力明顯加強(qiáng)，48 h遷移率為67.9%，而NC組48 h遷移率為43.1%，組間差異顯著(P<0.05)，見圖2。

圖1 兩組A2780細(xì)胞侵襲(×200)

圖2 兩組細(xì)胞遷移(×40)

3 討 論

一般情況下，腫瘤患者有自覺癥狀發(fā)現(xiàn)大多數(shù)已是晚期，治療難度增加，再加之化療產(chǎn)生的耐藥及出現(xiàn)的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)〔4〕，對(duì)患者身心帶來莫大的傷害和壓力〔5～7〕。由于腫瘤的轉(zhuǎn)移增加了患者死亡的概率，而這種轉(zhuǎn)移和侵襲性又受到很多因素、大量基因控制和影響〔8～10〕。鑒于以上原因，目前臨床治療的關(guān)鍵就在于探究卵巢癌的轉(zhuǎn)移和分子機(jī)制，進(jìn)而實(shí)施基因靶向治療〔11〕?，F(xiàn)今RNA干擾技術(shù)是研究的熱點(diǎn)〔12〕，其有益之處在于特異性強(qiáng)、可同時(shí)抑制多個(gè)基因且療效明顯，具有廣闊的應(yīng)用前景和臨床價(jià)值〔13,14〕。

與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的還包括腫瘤微環(huán)境中炎性因子〔15〕。作為由78個(gè)氨基酸殘基組成的PKI家族的成員之一的新型耐熱蛋白PKIB，最早是從兔睪丸中分離得到，有學(xué)者證實(shí)在大鼠和人組織中也存在該蛋白〔16〕。通常，大多數(shù)腫瘤的生物學(xué)行為都與PKIB有關(guān)。本研究結(jié)果顯示：PKIB 低表達(dá)可加強(qiáng)細(xì)胞的增殖，由此證明PKIB 參與卵巢癌細(xì)胞的增殖并且起促進(jìn)作用。通常侵襲和轉(zhuǎn)移也是癌癥患者死亡的一個(gè)主要原因。本實(shí)驗(yàn)表明PKIB表達(dá)對(duì)卵巢腺癌細(xì)胞的侵襲起重要作用。PKIB 低表達(dá)增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞侵襲和遷移能力。PKIB 作為原癌基因參與調(diào)節(jié)卵巢癌細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移，但其作用機(jī)制和相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的確定還需進(jìn)一步研究。