外源性睪酮通過誘導(dǎo)自噬致大鼠腎臟損傷

李旭 聶黎虹 秦凱悅 朱亞洲 張航 李佳鑫 趙瑞寧

(寧夏醫(yī)科大學(xué) 1研究生學(xué)院，寧夏 銀川 750004；2總醫(yī)院泌尿外科；3基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；4 2017級(jí)本科生)

腎臟是主要的排泄器官，在維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。睪酮(TP)是機(jī)體中最重要的雄激素，其與腎上腺素受體(AR)結(jié)合，在男性的生長、發(fā)育、生殖及維持正常生理穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用。AR廣泛分布于腎小球和腎小管，TP與其結(jié)合后可影響腎臟的結(jié)構(gòu)和功能〔1〕。由于雄激素特殊的作用，部分人群選擇外源性給予雄激素以達(dá)到男性避孕或提高性欲、運(yùn)動(dòng)成績的目的〔2，3〕。研究表明，長期大劑量使用TP可引起腎小球?yàn)V過率顯著降低，導(dǎo)致腎臟泌尿功能異?！?〕。 但目前對(duì)于外源性TP導(dǎo)致腎臟損傷的機(jī)制鮮有報(bào)道。自噬是真核生物細(xì)胞調(diào)節(jié)生長、死亡、能量代謝的重要機(jī)制，其廣泛參與各器官、系統(tǒng)生理及病理生理過程的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎病、急性腎損傷等腎臟疾病會(huì)通過間接誘導(dǎo)細(xì)胞自噬而導(dǎo)致腎臟發(fā)生損傷〔5〕。新近研究證明，TP可調(diào)控細(xì)胞自噬水平〔6〕。但關(guān)于外源性TP通過調(diào)控細(xì)胞自噬參與腎臟損傷發(fā)生的過程未見報(bào)道。本研究旨在探討外源性TP是否通過調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬參與腎臟損傷的發(fā)生。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物 選用SPF級(jí)SD雄性大鼠48只，體重(340±10)g，由寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(許可證號(hào)：SCXK(寧)2015-0001)。本研究經(jīng)寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2主要試劑 TP(北京Solarbio公司，中國)；氯喹(CQ，sigma公司，美國)；甘草甜素(Gly，東京化成工業(yè)株式會(huì)社，日本)；全蛋白提取試劑盒、聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒、ECL檢測(cè)試劑盒(江蘇凱基生物，中國)；鼠抗β-actin(北京中杉金橋公司，中國)；兔抗HMGB1(Abcam公司，英國)；兔抗LC3B(sigma公司，美國)；兔抗p62、兔抗Beclin1(proteintech公司，美國)；兔抗高遷移率族蛋白B1(HMGB1，Abcam公司，英國)；辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液(HRP)標(biāo)記的二抗；蘇木素-伊紅(HE)、染料(北京中杉金橋公司，中國)。

1.1.3主要儀器 電子天平，顯微鏡(日本 Olympus公司)，高速低溫離心機(jī)(美國 Thermo公司)，切片機(jī)(德國SLEE公司，型號(hào)CUT5062)，全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美囯Thermo公司)。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組與模型建立 將SD雄性大鼠(48只)隨機(jī)分為6組(每組8只)：control組、TP組、TP+CQ組、TP+Gly組、CQ組、Gly組。TP組大鼠皮下注射TP〔3 mg/(kg·d)〕；TP+CQ組大鼠皮下注射 TP〔3 mg/(kg·d)〕加腹腔注射CQ〔50 mg/(kg·d)〕；TP+Gly組大鼠皮下注射TP〔3 mg/(kg·d)〕加腹腔注射Gly〔10 mg/(kg·d)〕；CQ組大鼠僅腹腔注射CQ〔50 mg/(kg·d)〕；Gly組大鼠僅腹腔注射Gly〔10 mg/(kg·d)〕；control組大鼠腹腔注射生理鹽水〔2.5 ml/(kg·d)〕。各組大鼠的處理時(shí)間均為21 d。

1.2.2標(biāo)本收集與處理 各組大鼠稱重麻醉(10%水合氯醛，0.3 ml/100 g)后，取仰臥位，腹部正中切口，分離并摘取雙側(cè)腎臟。一側(cè)腎臟稱重后置于4%多聚甲醛中固定；另一側(cè)腎臟凍存于-80℃冰箱。大鼠腎臟指數(shù)=腎臟濕重(g)/體重(kg)。

1.2.3HE染色觀察腎臟組織形態(tài)學(xué)改變 取大鼠一側(cè)形態(tài)結(jié)構(gòu)完整腎臟用冷生理鹽水反復(fù)沖洗后，置于4%多聚甲醛中固定，24 h后將其進(jìn)行修剪后置于包埋盒中脫水過夜；次日進(jìn)行浸蠟、包埋，冷凝后進(jìn)行組織切片、烤片；將切片進(jìn)行脫蠟水化并染色，流水沖洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片；在光學(xué)顯微鏡下觀察腎臟組織病理學(xué)變化。

1.2.4組織免疫組化觀察自噬指標(biāo)表達(dá)情況 病理切片二甲苯脫蠟，由高到低的梯度乙醇水化，枸櫞酸鹽緩沖液抗原修復(fù)，過氧化氫孵育，山羊血清封閉，各組分別加特異性一抗：抗LC3B-Ⅱ、抗Beclin1、抗P62及抗HMGB1(1∶200稀釋)4℃過夜，山羊抗兔二抗免疫球蛋白(Ig)G 37℃水浴鍋孵育30 min，HRP 37℃水浴鍋孵育30 min，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復(fù)染，由低到高梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封固。

1.2.5Western印跡法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平 取各組大鼠一側(cè)腎臟，全蛋白提取試劑盒提取蛋白，BCA法定量，然后將樣品按照50 μg/每孔的上樣量加入既定泳道進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳80 min，并通過濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上。用5%脫脂乳封閉60 min后，將印跡與特異性一抗：抗LC3B-Ⅱ、抗Beclin1、抗P62及抗HMGB1，4℃孵育過夜。磷酸鹽吐溫緩沖液(TBST)洗滌膜三次后，將印跡與相應(yīng)的二抗孵育60 min，PBST洗膜三次并用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光顯色，用凝膠成像儀拍攝。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS22.0軟件行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠體重、腎臟濕重及腎臟指數(shù)的比較 各組大鼠體重、腎臟濕重、腎臟指數(shù)之間均無明顯變化(P>0.05)，見表1。

2.2各組大鼠腎臟組織形態(tài)學(xué)分析 control組腎小球大小、形態(tài)基本一致；腎小囊間隙均勻；腎小管上皮細(xì)胞形態(tài)完整且排列整齊，刷狀緣和基底縱紋規(guī)整，管腔規(guī)則。TP組腎小球毛細(xì)血管襻分葉明顯，襻內(nèi)細(xì)胞數(shù)增多；腎小囊間隙變窄；腎小管上皮細(xì)胞變矮、排列松散且不規(guī)整，基底縱紋模糊不清，刷狀緣不規(guī)整，大部分官腔閉塞。TP+CQ組和TP+Gly組可見少量且輕微的腎小球毛細(xì)血管襻分葉狀改變，腎小囊間隙均勻，與TP組比較，腎小管上皮細(xì)胞、刷狀緣及基底縱紋完整度及排列狀況均明顯改善。CQ組和Gly組腎臟病理學(xué)情況與control組類似，見圖1。

表1 各組大鼠體重、腎臟濕重和腎臟指數(shù)比較

圖1 各組大鼠腎臟組織HE染色結(jié)果

2.3各組大鼠腎臟組織蛋白免疫組化染色及表達(dá)結(jié)果 在control組，LC3B-Ⅱ主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞，Beclin1、P62和HMGB1表達(dá)于腎小球、腎小管上皮細(xì)胞。LC3B-Ⅱ、Beclin1和P62為胞質(zhì)、包膜陽性，HMGB1為胞核陽性。見圖2。與control組比較，TP組大鼠腎臟組織LC3B-Ⅱ、Beclin1、HMGB1蛋白表達(dá)水平均明顯上調(diào)(P<0.05)，P62蛋白表達(dá)水平無明顯變化(P>0.05)。與TP組比較，TP+CQ和TP+Gly組腎臟組織蛋白LC3B-Ⅱ、Beclin1及HMGB1蛋白表達(dá)水平均明顯下調(diào)(P<0.05)，P62蛋白表達(dá)變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；TP+CQ和TP+Gly組比較各蛋白表達(dá)變化均無差異(P>0.05)。CQ和Gly組與control組比較，各蛋白表達(dá)變化也無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，見圖3，表2。

圖2 各組大鼠腎臟組織免疫組化染色結(jié)果(×400)

圖3 各組大鼠腎臟組織LC3B-Ⅱ、Beclin1、P62、HMGB1蛋白的表達(dá)結(jié)果

表2 各組大鼠腎臟組織LC3B-Ⅱ、Beclin1、HMGB1、P62蛋白表達(dá)水平的比較

與control組比較: 1)P<0.05，2)P<0.001;與TP組比較:3)P<0.05，4)P<0.001

3 討 論

臨床上雄激素也可用于治療再生障礙性貧血等疾病〔7〕。這些對(duì)外源性雄激素的給予可能導(dǎo)致腎臟發(fā)生慢性損傷，進(jìn)而影響其正常生理功能。長期應(yīng)用TP可明顯降低腎臟的濾過功能〔4〕；TP也可以增加高血壓大鼠腎臟動(dòng)脈損傷〔8〕。但目前雄激素致腎臟損傷的機(jī)制尚未明確。這些現(xiàn)象提示雄激素可能通過調(diào)控細(xì)胞自噬參與腎臟慢性損傷的病理過程。

本研究提示外源性TP可致大鼠腎臟損傷。同時(shí)觀察到，TP組大鼠腎臟組織LC3B-Ⅱ、Beclin1表達(dá)水平上調(diào)。Beclin1是首個(gè)被鑒定介導(dǎo)哺乳動(dòng)物自噬的蛋白，在自噬體形成過程中是不可或缺的條件〔9〕；LC3B-Ⅱ是自噬啟動(dòng)的特異性標(biāo)記蛋白；兩者表達(dá)水平增加，提示TP可能通過誘發(fā)細(xì)胞自噬導(dǎo)致腎臟損傷。隨后，聯(lián)合給予自噬抑制劑，腎臟組織Beclin1、LC3B-Ⅱ蛋白表達(dá)下調(diào)，腎臟病理損傷部分好轉(zhuǎn)，進(jìn)一步驗(yàn)證上調(diào)細(xì)胞自噬水平是TP致腎臟損傷的機(jī)制。實(shí)驗(yàn)還觀察到，TP組HMGB1表達(dá)水平升高。HMGB1是重要的自噬調(diào)控因子〔10，11〕，不同細(xì)胞空間定位的HMGB1均可通過相應(yīng)機(jī)制調(diào)控自噬的發(fā)生。猜想表達(dá)增多的HMGB1可能參與TP致腎臟損傷過程中自噬水平的上調(diào)。本研究結(jié)果表明在TP致腎臟損傷過程中HMGB1可能通過上調(diào)自噬水平參與其中。

綜上，外源性TP可能通過上調(diào)細(xì)胞自噬水平致大鼠腎臟損傷病理過程的發(fā)生，HMGB1可能調(diào)節(jié)了此過程中自噬水平的改變。但在腎臟損傷的病理過程中，睪酮通過何種方式調(diào)控自噬，TP和HMGB1在調(diào)控自噬過程中是否具有協(xié)同作用等問題均需進(jìn)一步明確。