浙南地區(qū)樂清市非綜合征型耳聾患者的致聾基因突變研究

萬茹 白文靜 項延包 徐晨陽 李煥錚 徐雪琴 唐少華

耳聾是我國最為常見的出生缺陷遺傳疾病之一，亦是十分常見的一類導致語言交流障礙的感覺器官病變性疾病，其在新生兒群體中的發(fā)病率約為1‰～3‰[1-3]。非綜合征型耳聾患者占總耳聾群體的70%，且是以聽力損傷作為其唯一的臨床表型。我國非綜合征型耳聾患者群體中檢出率最高的致聾基因為GJB2、SLC26A4、GJB3以及線粒體12SrRNA基因，總檢出率可達30%～50%，故上述基因常作為檢測熱點基因來診斷耳聾患者[4-5]。由于該病具有明顯的群體遺傳異質(zhì)性，即不同遺傳背景或區(qū)域群體的耳聾患者可存在不同的致病基因及熱點突變，因而需通過檢測不同區(qū)域的耳聾患者來探索本地區(qū)的遺傳突變圖譜。本研究以浙南地區(qū)樂清市非綜合征型耳聾患者為研究對象，聯(lián)合運用耳聾基因芯片、Sanger測序及多重連接酶反應檢測技術（improved multiple ligase detection reaction，iMLDR）探索浙南地區(qū)耳聾患者致聾基因突變圖譜，為本地區(qū)耳聾家系的遺傳咨詢及產(chǎn)前診斷提供理論基礎。

1 對象和方法

1.1 對象 遵循知情同意原則，收集就診于溫州市中心醫(yī)院遺傳咨詢門診的319例樂清籍（患者分布于樂清市各鄉(xiāng)鎮(zhèn)）耳聾患者的臨床及聽力學資料，年齡1～53歲。所有患者均診斷為非綜合征型感音神經(jīng)性耳聾，且聽力損傷程度為輕度至極重度不等。

1.2 方法

1.2.1DNA提取 采用德國QIAGEN公司QIAamp DNA Mini Kit或長沙三濟公司外周血DNA抽提試劑盒，嚴格按照試劑盒操作說明書抽提患者外周血DNA，并各取2μl DNA樣本用紫外分光光度計進行定量和純度檢測。

1.2.2 耳聾芯片檢測 采用北京博奧生物公司提供的九項遺傳性耳聾基因檢測試劑盒對319例耳聾患者的4個基因9種突變進行檢測，包括GJB2基因c.235delC、c.299-300delAT、c.35delG 和 c.176del16位點，SLC26A4基因c.2168A＞G和c.919-2A＞G位點，GJB3基因c.538C＞T位點，線粒體12SrRNA基因m.1555A＞G和m.1494C＞T位點。

1.2.3 GJB2基因Sanger測序 對基因芯片檢出的23例GJB2基因單雜合突變患者行GJB2基因全編碼區(qū)（外顯子2）及其上游內(nèi)含子100bp序列測定分析[6]，尋找可能存在的其他復合雜合突變位點。

1.2.4 SLC26A4基因檢測 對基因芯片檢出的10例SLC26A4基因雜合突變患者行iMLDR檢測。該技術利用單核苷酸多態(tài)性及基于位點特異性雜交原理，可一次性檢測4個基因共89種突變，包括GJB2基因上c.9G＞A、c.109G＞A、c.134G＞A等 24個位點，SLC26A4基因上c.946G＞T、c.1692dupA、c.1229C＞T等59個位點，線粒體 DNA上的 m.1494C＞T、m.1555A＞G、m.1095T＞C等3個位點，以及GJB3基因上的c.538C＞T、c.547G＞A、c.580G＞A等 3個位點[7]。對該方法檢出的突變位點需經(jīng)過Sanger測序驗證來明確突變。

2 結果

2.1 耳聾芯片檢測結果 319例耳聾患者中，共檢出基因突變患者128例（40.13%）。檢出GJB2基因突變57例（17.87%），包括雙等位基因突變34例和雜合突變23例；其中c.235delC純合突變29例、c.235delC單雜合突變20例、c.235delC/c.176del16復合雜合突變5例、c.299-300delAT單雜合突變3例。檢出SLC26A4基因突變12例（3.76%），其中c.919-2A＞G純合突變2例、c.919-2A＞G雜合突變7例、c.2168A＞G雜合突變1例、c.919-2A＞G雜合突變復合線粒體12SrRNA基因m.1555A＞G突變2例。檢出GJB3基因c.538C＞T雜合突變復合線粒體12SrRNA基因m.1555A＞G突變1例（0.31%）。檢出線粒體 12SrRNA基因突變 61例（19.12%），其中 m.1555A＞G均質(zhì)型突變 60例，m.1494C＞T均質(zhì)型突變1例。

2.2 GJB2基因Sanger測序結果 對基因芯片檢出的23例GJB2基因單雜合突變患者進行Sanger測序，結果顯示20例GJB2基因c.235delC單雜合突變患者中12例存在另一突變位點，包括復合c.109G＞A雜合突變8例、復合c.230G＞A雜合突變1例、復合c.427C＞T雜合突變1例、復合c.508_511dupAACG雜合突變2例；3例GJB2基因c.299-300delAT單雜合突變患者中檢出復合c.109G＞A雜合突變2例。

2.3 SLC26A4基因iMLDR檢測結果 對基因芯片檢出的10例SLC26A4基因雜合突變患者行iMLDR檢測，結果顯示5例存在該基因上的另一等位基因或其他基因上的突變，包括復合c.1229C＞T雜合突變3例、復合c.1692dupA雜合突變1例、復合GJB2基因c.109G＞A純合突變1例。另有3例c.919-2A＞G雜合突變、2例c.919-2A＞G雜合突變復合線粒體12SrRNA基因m.1555A＞G突變患者中均未檢出其他致病突變。

2.4 基因突變患者基因分型及其頻率 綜合基因芯片、Sanger測序和iMLDR檢測，共檢出基因突變患者128例。檢出GJB2基因突變58例（18.18%），其中57例由基因芯片檢出，1例由iMLDR檢出。檢出SLC26A4基因突變12例（3.76%），其中2例純合突變由基因芯片檢出，剩余10例雜合或復合雜合由基因芯片和iMLDR共同檢出。檢出線粒體12SrRNA基因m.1555A＞G突變60例（18.81%），其中1例復合GJB3基因c.538C＞T雜合突變；檢出線粒體12SrRNA基因m.1494C＞T突變1例（0.31%）。58例GJB2基因突變患者中，雙等位基因突變49例，雜合突變9例。49例雙等位基因突變包括c.235delC純合突變29例，c.235delC復合c.109G＞A突變8例，c.235delC復合c.176_191del16突變5例，c.235delC復合c.230G＞A突變1例，c.235delC復合c.427G＞A突變1例，c.235delC復合c.508_511dupAACG突變2例，c.299_300 delAT復合c.109G＞A突變2例，c.109G＞A純合突變復合SLC26A4基因c.919-2A＞G雜合突變1例；9例雜合突變包括c.235delC雜合突變8例和c.299_300delAT雜合突變1例。12例SLC26A4基因突變包括雙等位基因突變6例（c.919-2A＞G純合突變2例，c.919-2A＞G/c.1229C＞T 2例，c.919-2A＞G/c.1692dupA 1例及 c.2168A＞G/c.1229C＞T 1例），c.919-2A＞G雜合突變 3例，c.919-2A＞G雜合突變復合線粒體12SrRNA基因m.1555A＞G突變2例，c.919-2A＞G雜合突變復合GJB2基因c.109G＞A純合突變1例，見表1。

表1 128例基因突變患者基因分型及其頻率

2.5 突變位點頻率 綜合上述檢測，本研究對319例患者共638個等位基因進行檢測，檢出GJB2基因共7種類型107次突變：包括c.235delC突變83次、c.109G＞A突變 12次、c.176del16突變 5次、c.299-300delAT突變3次、c.508_511dupAACG突變 2次、c.230G＞A突變 1次、c.427C＞T突變 1次；檢出SLC26A4基因共4種類型18次突變：包括c.919-2A＞G突變13次、c.1229C＞T突變3次、c.1692dupA突變1次、c.2168A＞G突變1次；檢出GJB3基因c.538C＞T突變1次，見表2。線粒體12SrRNA基因m.1555A＞G突變60次，m.1494C＞T突變1次。

表2 耳聾患者基因突變及其頻率

3 討論

本研究319例浙南地區(qū)樂清籍非綜合征型耳聾患者中共檢測出128例（40.13%）存在熱點致聾基因突變，其中線粒體12SrRNA基因突變檢出率為19.12%，該檢出率高于我國多地區(qū)文獻報道的0.26%～11.68%的耳聾群體攜帶率[8-10]，表明線粒體12SrRNA基因突變是本地區(qū)耳聾患者的最主要致聾原因。GJB2基因突變檢出率為18.18%，是本地區(qū)耳聾患者中檢出最高的核基因突變，該數(shù)據(jù)略低于Dai等[11]報道的全國20.94%的GJB2基因突變檢出率。SLC26A4基因突變檢出率為3.76%，其中純合或復合雜合突變僅占1.88%，低于文獻報道的我國耳聾群體5.11%～13.10%的突變檢出率[12-14]。另僅1例患者存在GJB3基因突變，檢出率為0.31%，表明該基因并非本地區(qū)耳聾患者的主要致聾基因。

基因檢測結果共檢出GJB2基因7種類型107次突變，其中c.235delC突變83次，占總等位基因的14.62%，表明與我國多數(shù)耳聾群體的基因突變圖譜相同，c.235delC突變亦是本地區(qū)GJB2基因最主要的突變類型；其次c.109G＞A突變12次，占1.88%，該突變檢出率低于4.48%～15.05%的文獻報道數(shù)據(jù)[11-12]，可能與c.109G＞A突變位點不在本次耳聾基因芯片檢測范圍內(nèi)有關。本研究對耳聾基因芯片檢出的23例GJB2基因單雜合突變患者進一步行GJB2基因全編碼區(qū)測序，結果發(fā)現(xiàn)10例患者存在c.109G＞A突變（8例c.235delC復合c.109G＞A，2例 c.299-300delAT復合 c.109G＞A），且臨床表型均為聽力損失中度至重度不等，進一步表明c.109G＞A突變應為GJB2基因上的致病突變，提示應將c.109G＞A突變納入我國耳聾患者的常規(guī)熱點突變檢測范圍內(nèi)。另檢出 c.176del16、c.299_300delAT、c.508_511dupAACG、c.230G＞A、c.427C＞T等共5種GJB2基因突變，結果顯示上述突變的等位基因頻率均低于1%，故該5種突變均非本區(qū)域耳聾患者的熱點突變[6]。

本研究共檢出SLC26A4基因突變4種類型18次突變，其中c.919-2A＞G突變13次，占總等位基因的2.04%，是該基因上頻率最高的熱點突變[15-16]?；蛐酒矙z出2例c.919-2A＞G純合突變、9例c.919-2A＞G雜合突變以及1例c.2168A＞G雜合突變，通過iMLDR檢測該10例雜合突變患者，發(fā)現(xiàn)4例存在該基因上的另一等位基因突變以及1例復合存在GJB2基因c.109G＞A純合突變，表明iMLDR是一種有效的耳聾基因分型檢測技術，可用于SLC26A4基因熱點篩查雜合突變患者的另一等位基因上突變的尋找或其他致聾基因上的突變檢測；另有2例c.919-2A＞G雜合突變復合線粒體12SrRNA基因m.1555A＞G突變患者中均未檢出其他致病突變，結合耳毒性藥物應用史及家系遺傳圖譜（均數(shù)代多人發(fā)病且呈現(xiàn)母系遺傳模式），推測線粒體12SrRNA基因m.1555A＞G突變才是該2例患者的真正致聾原因。另有3例c.919-2A＞G雜合突變患者未檢出存在其他突變，推測可能是存在iMLDR檢測范圍外的其他位點發(fā)生突變或是在該基因上游的調(diào)控區(qū)范圍內(nèi)發(fā)生拷貝數(shù)變異導致復合雜合致聾，當然亦有可能該個體恰巧為人群中c.919-2A＞G雜合突變攜帶者，故對該類SLC26A4基因雜合突變的耳聾患者其發(fā)病機制仍有待進一步研究。

線粒體12SrRNA基因m.1555A＞G或m.1494C＞T突變作為藥物性耳聾發(fā)生的主要致聾遺傳機制之一，當發(fā)生m.1555A＞G或m.1494C＞T突變時，線粒體核糖體A位將會在空間上形成新的1494與1555位點的G-C或A-U配對，使得人體線粒體12SrRNA與E.coil 16SrRNA上相應編碼區(qū)域的結構更為相近，可增強氨基糖苷類藥物在12SrRNA A位的結合力，最終導致藥物性耳聾的發(fā)生[17]。本地區(qū)耳聾患者線粒體12SrRNA基因m.1555A＞G或m.1494C＞T突變檢出率為19.12%，該線粒體DNA突變高檢出率可能與本地區(qū)患者耳毒性藥物濫用增強耳聾外顯率有關，另外早期樂清山地較多、地理位置相對封閉，可能較早的一批耳聾移民群體或患者中存在較高比例的線粒體DNA突變，因而通過遺傳漂變及奠基者效應使得后代耳聾群體中藥物性耳聾患者比例較高。上述結果提示臨床耳毒性藥物的慎用應作為樂清地區(qū)耳聾精準防控的主要基礎策略。

GJB3基因c.538C＞T突變最先被認為與遲發(fā)型高頻聽力損失有關，但近來亦有文獻報道質(zhì)疑該位點致病性[18-19]。本研究僅檢出1例男性患者存在GJB3基因c.538C＞T突變，且該患者復合存在線粒體12SrRNA基因m.1555A＞G突變，家系資料及臨床基因檢測結果發(fā)現(xiàn)該先證者父親及兒子均攜帶有GJB3基因c.538C＞T突變（且均未攜帶m.1555A＞G突變），但臨床表型正常，結合耳毒性藥物應用史，推測m.1555A＞G突變?yōu)樵摶颊叩恼嬲旅@原因，而GJB3基因c.538C＞T突變可能在該患者耳聾表型中為非致病因素。

我國地域遼闊，分布不同地域或具有不同遺傳背景的耳聾群體可能具有不同的致聾基因突變圖譜。本研究顯示線粒體12SrRNA為浙南地區(qū)樂清市非綜合征型耳聾患者的首要致聾因素，該基因突變圖譜與我國多地區(qū)報道的以GJB2致聾基因為首要致聾因素的檢出結果不同，表明該區(qū)域耳聾患者具有獨特的致聾基因突變圖譜。但由于本研究先針對熱點突變進行檢測，再進行Sanger測序或iMLDR檢測尋找與已知熱點突變公共存在的復合雜合位點，研究方法上存在一定的局限性，樂清市實際的耳聾基因突變率可能略高于本研究，但本研究仍可以在一定程度上為本地區(qū)耳聾精準防控的政策決定者提供遺傳學理論基礎，提示耳聾基因檢測及慎用耳毒性致聾藥物的宣傳是本地區(qū)耳聾精準防控的主要內(nèi)容。