菊粉對(duì)高脂高糖飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠的減肥作用與其調(diào)節(jié)腸道菌群的關(guān)系分析

王晨，朝浩鵬，謝宇端

隨著生活習(xí)慣和飲食結(jié)構(gòu)的變化，全球范圍內(nèi)肥胖的發(fā)生率逐年遞增，且兒童青少年人群中肥胖率也愈來(lái)愈高，主要是機(jī)體過(guò)量攝取能量引起的［1-2］。據(jù)報(bào)道，肥胖是糖尿病、冠心病等多種疾病的高危風(fēng)險(xiǎn)因素［3-5］，因而，肥胖及相關(guān)疾病受到廣泛關(guān)注。菊粉是一種鏈狀果聚糖，廣泛分布于菊芋、韭菜、洋蔥等植物中，可作為功能性食品基料［6］；菊粉一般聚合度在2～60之間，研究發(fā)現(xiàn)，不同聚合度的菊粉可對(duì)腸道菌群產(chǎn)生不同的益生效果［7］；另外，Weitkunat K等［8］報(bào)道高脂飼料中添加菊粉，可緩解肥胖。本研究于2017年2月至2019年4月，比較不同聚合度菊粉對(duì)高脂高糖飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠的減肥作用及腸道菌群的調(diào)節(jié)作用，旨在為菊粉相關(guān)保健品的開(kāi)發(fā)提供科學(xué)的指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 8周齡C57BL/6J小鼠購(gòu)自上海冠導(dǎo)生物工程有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號(hào)：SCXK（滬）2019-0005，小鼠體質(zhì)量范圍為26～32 g，均為雄性，飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房中適應(yīng)1周，自由攝食進(jìn)水，相關(guān)操作均符合動(dòng)物醫(yī)學(xué)倫理相關(guān)規(guī)定。

1.2 主要試劑與儀器 標(biāo)準(zhǔn)菊粉、短鏈菊粉購(gòu)自山西寶瑞生物科技有限公司，普通飼料、高糖高脂飼料購(gòu)自北京博泰宏達(dá)生物技術(shù)有限公司，高通量測(cè)序由上海瑞鹿生物技術(shù)有限公司檢測(cè)，蛋白一抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。血液生化儀購(gòu)自南京普朗醫(yī)用設(shè)備有限公司，全自動(dòng)凝膠成像儀購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司。

1.3 分組與干預(yù) 將32只C57BL/6J小鼠以隨機(jī)數(shù)字表法分為四組，每組8只，分別為對(duì)照組、模型組、標(biāo)準(zhǔn)菊粉組和短鏈菊粉組；對(duì)照組喂食普通飼料，模型組喂食高脂高糖飼料，標(biāo)準(zhǔn)菊粉組和短鏈菊粉組小鼠分別喂食添加有5%標(biāo)準(zhǔn)菊粉、5%短鏈菊粉的高脂高糖飼料，共喂食8周，每周記錄小鼠體質(zhì)量。

1.4 HE染色 干預(yù)結(jié)束后，每組隨機(jī)選3只取肝組織作病理切片，操作如下：腹腔注射5%水合氯醛麻醉小鼠，開(kāi)胸暴露心臟，防凝血處理后，注入生理鹽水沖洗血管，再注入4%多聚甲醛灌注固定，當(dāng)小鼠肝臟發(fā)白、鼓起提示灌注完成；1 h后取肝臟組織再次置于4%多聚甲醛中固定，經(jīng)脫水透明后浸蠟包埋，切片至4～6μm，進(jìn)行常規(guī)蘇木素-伊紅染色，封片后顯微鏡下觀察小鼠肝臟組織病理變化。

1.5 血清血脂的檢測(cè) 干預(yù)結(jié)束后，剩余小鼠剪尾取血，2 000 rpm/min離心10 min，分離上層血清，采用血液生化儀檢測(cè)小鼠血清中總膽固醇（Total cholesterol，TC）、三酰甘油（Triglycerides，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（High density lipoprotein cholesterol，HDL-C）及低密度脂蛋白膽固醇（Low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）的含量。

1.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè) 干預(yù)結(jié)束后，取血后采用頸部脫臼法處死小鼠，迅速解剖取出肝臟組織；加入RIPA裂解液勻漿，提取肝臟蛋白；檢測(cè)蛋白濃度后，取等量蛋白進(jìn)行凝膠電泳，分離目的蛋白；采用“三明治”法，將蛋白條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；取出PVDF膜浸于5%脫脂奶粉液，室溫下封閉2 h；取出PVDF膜置于相應(yīng)蛋白一抗，4℃孵育過(guò)夜；取出PVDF膜置于相應(yīng)二抗，37℃孵育1 h；滴加ECL發(fā)光液，應(yīng)用全自動(dòng)凝膠成像儀進(jìn)行化學(xué)發(fā)光。以βactin為內(nèi)參，計(jì)算固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c（Sterol regulatory element binding protein，SREBP-1c）、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-γ（Peroxidosome proliferator-activated receptor-γ，PPAR-γ）的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 高通量測(cè)序 干預(yù)結(jié)束后，收集小鼠新鮮糞便約150mg，參照QIAamp DNA stool mini kit試劑盒說(shuō)明書(shū)，提取小鼠糞便中菌群總DNA；選擇16SrRNA的V3和V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到的產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化，定量后構(gòu)建Illumina MiSeq文庫(kù)，上機(jī)測(cè)序；最后進(jìn)行生物信息學(xué)分析，根據(jù)OTUs（Operational taxonomic units）分析小鼠糞便中菌群的多樣性和不同微生物的豐度。本研究將重點(diǎn)關(guān)注肥胖相關(guān)菌群的變化，如：門(mén)水平［擬桿菌門(mén)、厚壁菌門(mén)］，科水平［乳酸桿菌、瘤胃菌］，嗜粘蛋白-艾克曼菌等。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采取統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS21.0分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料均服從正態(tài)分布，以±s表示，比較選擇單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)，以P＜0.05表示組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 菊粉對(duì)肥胖小鼠體質(zhì)量的影響 如圖1，小鼠體質(zhì)量在26～30 g之間波動(dòng)。與對(duì)照組相比，其他組別小鼠體質(zhì)量均增加；與模型組相比，標(biāo)準(zhǔn)菊粉組和短鏈菊粉組小鼠體質(zhì)量均有所下降，且短鏈菊粉組體質(zhì)量下降程度更高。

圖1 菊粉對(duì)肥胖小鼠體質(zhì)量的影響

2.2 菊粉對(duì)肥胖小鼠肝組織病理變化的影響 如圖2，對(duì)照組小鼠肝組織細(xì)胞排列整齊、規(guī)律，細(xì)胞間隙均勻，細(xì)胞核大而圓；模型組出現(xiàn)大量空泡樣病變，細(xì)胞核受擠壓縮??；標(biāo)準(zhǔn)菊粉組和短鏈菊粉組空泡樣程度較模型組明顯減輕，且短鏈菊粉組改善作用更好。

圖2 菊粉對(duì)肥胖小鼠肝組織病理變化的影響（HE染色×200）：A為對(duì)照組；B為模型組標(biāo)，C為準(zhǔn)菊粉,D為短鏈菊粉組

2.3 菊粉對(duì)肥胖小鼠血清血脂指標(biāo)的影響 與對(duì)照組相比，模型組小鼠血清TC、TG及LDL-C水平顯著上升，HDL-C水平顯著下降（P＜0.05）；與模型組相比，標(biāo)準(zhǔn)菊粉組和短鏈菊粉組TC、TG及LDL-C水平顯著下降，HDL-C水平顯著上升（P＜0.05），短鏈菊粉組改善效果更好，見(jiàn)表1。

表1菊粉對(duì)肥胖小鼠血清血脂指標(biāo)的影響/（μmpl/L，±s）

表1菊粉對(duì)肥胖小鼠血清血脂指標(biāo)的影響/（μmpl/L，±s）

注：與對(duì)照組相比，a P＜0.05；與模型組相比，b P＜0.05

對(duì)照組模型組標(biāo)準(zhǔn)菊粉組短鏈菊粉組F值P值1.32±0.16 2.28±0.32a 1.96±0.27b 1.75±0.23b 20.420 0.000 8 8 8 8 2.41±0.25 4.19±0.53a 3.73±0.48b 3.26±0.43b 24.360 0.000 0.35±0.08 1.75±0.22a 1.36±0.17b 0.83±0.14b 115.906 0.000 6.85±0.78 4.74±0.55a 5.94±0.61b 6.08±0.67b 14.055 0.000

2.4 菊粉對(duì)肥胖小鼠肝組織脂代謝基因的影響如圖3、表2，與對(duì)照組相比，模型組小鼠肝組織中SREBP-1c的表達(dá)顯著上調(diào)，PPAR-γ的表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05）；與模型組相比，標(biāo)準(zhǔn)菊粉組和短鏈菊粉組SREBP-1c的表達(dá)顯著下調(diào)，PPAR-γ的表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05），且短鏈菊粉組作用效果更明顯。

圖3 各組小鼠肝組織脂代謝基因的表達(dá)：1為對(duì)照組，2為模型組，3為標(biāo)準(zhǔn)菊粉組，4為短鏈菊粉組

表2 菊粉對(duì)肥胖小鼠肝組織脂代謝基因的影響/±s

表2 菊粉對(duì)肥胖小鼠肝組織脂代謝基因的影響/±s

注：與對(duì)照組相比，a P＜0.05；與模型組相比，b P＜0.05

組別對(duì)照組模型組標(biāo)準(zhǔn)菊粉組短鏈菊粉組F值P值PPAR-γ 1.00±0.06 0.23±0.04a 0.47±0.09b 0.61±0.08b 168.866 0.000鼠數(shù)8 8 8 8 SREBP-1c 1.00±0.08 2.23±0.21a 1.78±0.18b 1.47±0.15b 81.427 0.000

2.5 菊粉對(duì)肥胖小鼠腸道菌群的影響 通過(guò)高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)，擬桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)是小鼠腸道中的兩大主導(dǎo)菌種，與對(duì)照組相比，模型組擬桿菌門(mén)/厚壁菌門(mén)顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，標(biāo)準(zhǔn)菊粉組和短鏈菊粉組擬桿菌門(mén)/厚壁菌門(mén)顯著上升（P＞0.05）?？扑缴希Ｐ徒M乳酸桿菌、瘤胃菌占比較對(duì)照組顯著下降（P＜0.05），而標(biāo)準(zhǔn)菊粉組和短鏈菊粉組乳酸桿菌、瘤胃菌占比較模型組顯著上升（P＜0.05）。與對(duì)照組相比，模型組嗜粘蛋白-艾克曼菌比例明顯下降（P＜0.05），干預(yù)標(biāo)準(zhǔn)菊粉和短鏈菊粉后，嗜粘蛋白-艾克曼菌比例明顯升高（P＜0.05），詳見(jiàn)表3。

表3 菊粉對(duì)肥胖小鼠腸道菌群的影響/±s

表3 菊粉對(duì)肥胖小鼠腸道菌群的影響/±s

注：與對(duì)照組相比，a P＜0.05；與模型組相比，b P＜0.05

對(duì)照組模型組標(biāo)準(zhǔn)菊粉組短鏈菊粉組F值P值0.84±0.12 0.09±0.02a 0.37±0.07b 0.48±0.14b 78.412 0.000 8 8 8 8 2.16±0.52 1.37±0.12a 1.78±0.18b 1.91±0.15b 10.265 0.000 1.28±0.11 0.13±0.03a 0.42±0.07b 0.94±0.09b 327.005 0.000 7.81±0.21 3.34±0.15a 4.23±0.17b 5.19±0.20b 881.631 0.000

3 討論

能量的攝取和消耗處于動(dòng)態(tài)平衡時(shí)有助于機(jī)體維持正常體質(zhì)量，當(dāng)機(jī)體能量攝取量大于消耗量時(shí)，體內(nèi)多余的能量將以脂肪的形式儲(chǔ)藏，過(guò)多的脂肪堆積將引起肥胖［9］。本研究應(yīng)用高糖高脂飼料誘導(dǎo)肥胖小鼠，8周后小鼠體質(zhì)量明顯高于喂食普通飼料小鼠，提示肥胖小鼠模型構(gòu)建成功。而菊粉干預(yù)后小鼠體質(zhì)量明顯減輕，且短鏈菊粉組減重更為明顯，提示菊粉具有減肥作用，與于秋紅等［10］研究結(jié)果相符?？赡苁蔷辗蹮o(wú)法被機(jī)體吸收，進(jìn)入腸道后與脂肪、蛋白質(zhì)等結(jié)合，減少能量物質(zhì)的代謝；另外，菊粉還可增加消化道食糜黏度，阻礙機(jī)體吸收，最終隨糞便排出［11］。

肝臟是哺乳動(dòng)物體內(nèi)重要的代謝器官，在維持糖類、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等代謝平衡有重要作用，因此，肥胖在肝臟組織中會(huì)表現(xiàn)為脂肪樣病變，甚至影響肝臟功能［12］。本研究病理組織切片觀察到肥胖小鼠肝臟組織中有大量空泡樣變，而菊粉可明顯減輕肝臟損傷。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，菊粉可減少肥胖小鼠TC、TG及LDL-C水平，并增加HDL-C水平。SREBP-1c是脂質(zhì)代謝中重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，能夠直接激活脂質(zhì)合成相關(guān)基因，促進(jìn)脂肪酸、TC的合成［13］。PPAR-γ特異性表達(dá)于脂肪組織，參與脂肪細(xì)胞分化和脂代謝的調(diào)節(jié)，促進(jìn)脂質(zhì)的分解，其低表達(dá)與肥胖的發(fā)生密切相關(guān)［14］。本研究發(fā)現(xiàn)菊粉可下調(diào)肥胖小鼠肝組織中SREBP-1c的表達(dá)，并上調(diào)PPAR-γ的表達(dá)。上述結(jié)果均提示，菊粉可減少肝組織脂質(zhì)堆積，緩解血脂代謝異常，從而緩解肥胖，與Yu等［15］研究結(jié)果相似。

大量研究表明，腸道微生物對(duì)于肥胖有重要的調(diào)控作用，腸道菌群可直接參與宿主能量和物質(zhì)代謝［16-17］。據(jù)報(bào)道，肥胖小鼠中擬桿菌豐度會(huì)下降，而厚壁菌比例會(huì)升高［18］，本研究也得出相似結(jié)果，且干預(yù)菊粉后，擬桿菌門(mén)/厚壁菌門(mén)明顯增加，接近于喂食普通飼料小鼠。乳酸桿菌是常見(jiàn)的益生菌之一，本研究顯示，菊粉干預(yù)后，小鼠腸道乳桿菌比例顯著增加。瘤胃菌是丁酸鹽產(chǎn)生菌，而丁酸鹽可維持腸道菌群結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、保護(hù)腸道結(jié)構(gòu)和功能［19］。本研究發(fā)現(xiàn)，菊粉可上調(diào)肥胖小鼠瘤胃菌比例。嗜粘蛋白-艾克曼菌是定植在腸道黏液層中的mucin降解菌，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，嗜粘蛋白-艾克曼菌可減少脂肪的堆積，改善血脂紊亂［20］；本研究結(jié)果顯示，菊粉可上調(diào)肥胖小鼠腸道嗜粘蛋白-艾克曼菌比例。上述結(jié)果表明，菊粉可與小鼠腸道菌群相互作用，增加益生菌比例，從而影響宿主能量和物質(zhì)代謝水平，最終起到減肥的作用。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)，短鏈菊粉作用效果優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)菊粉，可能是聚合度更高，微生物發(fā)酵時(shí)間越長(zhǎng)。

本研究比較了不同聚合度菊粉對(duì)高脂高糖飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠的減肥作用及腸道菌群的調(diào)節(jié)作用，提示菊粉可有效緩解肥胖小鼠血脂紊亂，減少肝臟損傷和脂肪堆積，增加益生菌群占比，緩解小鼠肥胖，且短鏈菊粉效果更好，但其具體作用機(jī)制還需要深入分析與完善。