不同堿度和ɑ-酮戊二酸水平對(duì)松浦鏡鯉腸道形態(tài)及消化酶活性的影響

程龍，彭豐，李晉南，徐奇友，王連生

（1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150070;2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海2 013063）

堿度為重要環(huán)境指標(biāo)，顯著影響魚類的生長(zhǎng)。魚類對(duì)堿度的耐受具有一定范圍，高碳酸鹽堿水環(huán)境對(duì)魚類有毒害作用[1]。Galat 等[2]研究發(fā)現(xiàn)，隨著堿度的增加，鮭鰓上皮細(xì)胞分離或破裂，氯細(xì)胞增生肥大，腎小球突起及腎小球或造血組織中出現(xiàn)無(wú)色透明小液滴等癥狀。王萍等[3]分析了青海湖裸鯉Gymnocypris przewalskii 堿脅迫后腸的排泄物，發(fā)現(xiàn)鹽度、堿度及湖水脅迫等均可引起腸道大量排出HCO3-離子，表明腸道在調(diào)節(jié)裸鯉體內(nèi)滲透壓中具有重要意義。但堿脅迫對(duì)魚類腸道形態(tài)的影響還沒有相關(guān)的研究。堿度過(guò)高顯著影響魚類消化酶的活性，水環(huán)境堿度過(guò)高一般會(huì)降低魚類的消化酶活性和攝食水平、餌料利用率及生長(zhǎng)。袁玉仁[4]研究表明，堿度高于10mmol/L 時(shí)花鱸Lateolabrax japonicus 消化酶活性明顯降低；隨著堿度的升高以及試驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)花鱸消化酶活性的降低程度更為明顯。主要原因是水環(huán)境堿度的提高使消化道pH升高，當(dāng)pH 超過(guò)消化酶最適區(qū)域時(shí)，消化酶的活性下降[5]。

α-酮戊二酸（α-ketoglutarate，AKG）是生物體三羧酸循環(huán)中連接碳代謝和氮代謝的重要中間產(chǎn)物[6]，也是合成谷氨酸、谷氨酰胺和精氨酸等氨基酸的前體。目前，AKG 對(duì)仔豬[7,8]、肉仔雞[9]以及雜交鱘[10]等動(dòng)物生長(zhǎng)、腸道發(fā)育和腸道抗氧化能力等已有大量研究，表明AKG 在促進(jìn)陸生或水產(chǎn)動(dòng)物受損腸道的修復(fù)，保持腸道組織形態(tài)完整性中起重要作用。李晉南等[11]研究表明，AKG 可以明顯提高松浦鏡鯉Cyprinus carpio Songpu 腸道肌層厚度以及皺襞高度，明顯增強(qiáng)腸道消化酶的活性。但在飼料中添加AKG 能否有效降低堿度脅迫對(duì)魚類消化系統(tǒng)的影響還沒有研究。本試驗(yàn)在不同堿度水環(huán)境下，給松浦鏡鯉分別投喂含有1%AKG 和不含AKG的飼料，以探究不同堿度條件下松浦鏡鯉腸道形態(tài)與功能變化，及水體堿度與飼料中AKG 的添加對(duì)松浦鏡鯉腸道形態(tài)與功能的影響，為鹽堿水養(yǎng)殖實(shí)踐中AKG 的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

AKG（純度≥98.0%）購(gòu)自Sigma 公司；松浦鏡鯉幼魚購(gòu)自黑龍江水產(chǎn)研究所呼蘭實(shí)驗(yàn)站。

根據(jù)《鯉魚配合飼料》（SC/T 1026-2002）以及NRC（2011）要求，以進(jìn)口蒸汽魚粉及豆粕為蛋白質(zhì)源，以豆油、魚油、大豆磷脂為脂肪源，配制等氮等能基礎(chǔ)飼料（表1）。用AKG 替代基礎(chǔ)飼料中的葡萄糖，配制成含有1%AKG 和不含AKG 的2 種試驗(yàn)飼料。飼料原料粉碎后過(guò)80 目篩，按表1 配方稱重后將各原料逐級(jí)混合均勻，加入一定量的水，充分混勻后經(jīng)小型制粒機(jī)加工成粒徑為1mm 的顆粒飼料，常溫風(fēng)干后于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及飼養(yǎng)管理

本研究，養(yǎng)殖水體共設(shè)15mmol/L 和30mmol/L 2個(gè)碳酸鹽堿度和1 個(gè)淡水對(duì)照組（0mmol/L），每個(gè)處理組3 個(gè)平行。用NaHCO3（分析純）配置相應(yīng)的堿度，用0.02mol/L 的鹽酸標(biāo)定，甲基橙-苯胺藍(lán)（混合）和酚酞作指示劑[12]，實(shí)測(cè)堿度分別為14.85 mmol/L和29.22mmol/L。

養(yǎng)殖試驗(yàn)前徹底清理魚缸并消毒。實(shí)驗(yàn)魚用4%食鹽水消毒，馴化2 周后，挑取540 尾初始體質(zhì)量為（6.66±0.03）g 規(guī)格相近的鏡鯉幼魚，隨機(jī)分為6 組，每組3 個(gè)平行，每個(gè)平行30 尾魚，養(yǎng)殖8 周。試驗(yàn)期間光照均勻，每天換水20%并定期清洗魚缸，保持水質(zhì)良好，使用經(jīng)曝氣處理的自來(lái)水配制不同堿度的試驗(yàn)用水，水溫（23±0.5）℃，溶氧大于5.0mg/L，氨氮小于1.0 mg/L。試驗(yàn)期間，每天7:30、12:30 和16:30 投喂3 次。

1.2.2 腸道形態(tài)指標(biāo)的測(cè)定

養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，每缸隨機(jī)取出3 尾魚，用100mg/L MS-222 麻醉后，置于冰盤上解剖，取出內(nèi)臟并分離腸道，剔除腸道表面附著的脂肪及肝臟組織，用預(yù)冷的0.86%生理鹽水清洗腸道后用濾紙吸干，截為前腸、中腸、后腸三段（前腸為腸道第一個(gè)回折之前的部分，中腸為第一個(gè)回折到最末一個(gè)回折的部分，后腸為最末回折處至肛門的部分）。取長(zhǎng)度為1cm 左右的腸段固定于Bouin 氏液中，切片。采用Motic 顯微圖像系統(tǒng)（Motic Images Plus 2.0 軟件）測(cè)量每個(gè)切片中6 個(gè)以上完整腸道皺襞高度、絨毛寬度及腸道基膜厚度（μm，成像倍數(shù)為10×100），取其平均值。

1.2.3 腸道消化酶活性的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)按照上述方法截取腸段，準(zhǔn)確稱取腸道組織重量，按質(zhì)量體積比1∶9 與預(yù)冷的0.86%生理鹽水稀釋，采用FJ-200CL 高速勻漿機(jī)冰浴勻漿，按照試劑盒要求的離心速度和時(shí)間進(jìn)行離心，離心后取組織上清液，分裝后于冰箱（-20℃）中保存，用于測(cè)定蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的活性。蛋白酶活性采用福林-酚（Folin-phenol）法測(cè)定；脂肪酶及淀粉酶活性采用南京建成生物工程研究所的試劑盒說(shuō)明書測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，SPSS19.0 軟件分析。以不同堿度水平和AKG 濃度為影響因素，采用雙因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，用Duncan's 檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的顯著性，差異顯著性水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同堿度和AKG 水平對(duì)鏡鯉腸道形態(tài)的影響

由表2 可知，堿度脅迫下，鏡鯉中腸的絨毛長(zhǎng)度均低于淡水組（P＜0.05），隨著堿度上調(diào)，中腸絨毛長(zhǎng)度變短；后腸的絨毛長(zhǎng)度同中腸絨毛長(zhǎng)度呈相同的變化趨勢(shì)，差異不顯著（P＞0.05）。堿度脅迫使中腸絨毛寬度顯著降低（P＜0.05）；堿度和AKG 水平對(duì)前腸、后腸絨毛寬度無(wú)顯著影響（P＞0.05）。堿度和AKG 水平對(duì)前、中、后腸的基層厚度無(wú)顯著影響（P＞0.05）。雙因素方差分析顯示，堿度和AKG 對(duì)腸道形態(tài)的影響均沒有交互作用。

2.2 不同堿度和AKG 水平對(duì)鏡鯉腸道消化酶的影響

由表3 可知，堿度脅迫使鏡鯉前腸淀粉酶活性顯著降低（P＜0.05）；淡水組中，添加AKG 也顯著降低了前腸淀粉酶活性（P＜0.05）；而在15mmol/L 堿度水平下，飼喂添加1%AKG 飼料時(shí)，鏡鯉的前腸淀粉酶活性顯著提高（P＜0.05）；堿度和AKG 水平對(duì)前腸淀粉酶活性有交互作用（P＜0.05）。堿度脅迫下，前腸、中腸的蛋白酶活性顯著降低（P＜0.05）；低堿度條件下（0 mmol/L、15 mmol/L 碳酸鹽堿度），添加AKG提高了前腸和中腸蛋白酶的活性，但差異沒有達(dá)到顯著水平（P＞0.05）；堿度和AKG 水平對(duì)中腸蛋白酶活性有交互作用（P＜0.05）。隨著堿度水平提高，前腸、中腸脂肪酶活性顯著降低（P＜0.05）；淡水組中，添加AKG 顯著降低了中腸脂肪酶活性（P＜0.05），但堿度和AKG 水平對(duì)腸道脂肪酶活性無(wú)交互作用（P＞0.05）。

3 討論

3.1 不同堿度和AKG 水平對(duì)鏡鯉腸道組織形態(tài)的影響

松浦鏡鯉為無(wú)胃魚類，其腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整性對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收更為重要。魚類腸道的許多皺襞是增加腸道表面積的關(guān)鍵因素；絨毛長(zhǎng)度和寬度以及基層厚度等指標(biāo)可直接反應(yīng)皺襞形態(tài)，是反映水生動(dòng)物腸道形態(tài)和吸收能力的重要標(biāo)志[13]。水環(huán)境中的脅迫因子顯著影響魚類的生長(zhǎng)發(fā)育，氨氮和亞硝酸鹽脅迫的研究已較為深入[14,15]。水體中氨氮含量升高可導(dǎo)致鯉腸絨毛上皮充血、融合及固有層細(xì)胞壞死等病癥[16]；pH 和堿度的升高也會(huì)導(dǎo)致鯉毒性，甚至死亡[17,18]。本試驗(yàn)中，堿度升高降低了中腸的絨毛長(zhǎng)度，且堿度越大，中腸絨毛長(zhǎng)度越短；后腸的絨毛長(zhǎng)度同中腸絨毛長(zhǎng)度呈現(xiàn)相同的趨勢(shì)，但差異不顯著，且堿度脅迫還使中腸絨毛寬度增加，其原因有待進(jìn)一步研究。AKG 為谷氨酰胺的前體物質(zhì)，外源添加可以代替部分谷氨酸和谷氨酰胺；AKG 在溶液中具有良好的穩(wěn)定性，能克服谷氨酰胺易降解的缺點(diǎn)[19]，提高腸道對(duì)其的吸收能力。已有研究表明，AKG 的添加對(duì)鏡鯉腸道形態(tài)具有積極作用[11]。本試驗(yàn)中，與對(duì)照組（0mmol/L 堿度，0%AKG）組相比，淡水組添加1%AKG 的鏡鯉中腸絨毛長(zhǎng)度顯著增加，這可能是因?yàn)锳KG 可以為腸道上皮細(xì)胞提供能量[8]，促進(jìn)上皮細(xì)胞增值[20]，促進(jìn)腸道細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育。堿脅迫下，飼喂添加AKG 飼料的鏡鯉前腸絨毛長(zhǎng)度均高于對(duì)照組，而中腸絨毛長(zhǎng)度中并沒有相似的效應(yīng)。雙重比較也表明，堿度和AKG 水平對(duì)腸道組織形態(tài)無(wú)交互作用。

3.2 不同堿度和AKG 水平對(duì)鏡鯉腸道消化酶的影響

腸消化酶活性決定鯉對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收能力，影響鯉的生長(zhǎng)發(fā)育。pH 對(duì)魚類消化酶活力具有一定的影響，一般隨pH 的升高消化酶活力呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)[21,22]。水體堿度和pH 對(duì)魚類損傷具有協(xié)同作用[12,23]。本試驗(yàn)中，堿度環(huán)境顯著抑制了鏡鯉的消化酶活性，這種變化也與堿度環(huán)境的脅迫有關(guān)。王萍等[3]分析堿脅迫下青海湖裸鯉Gymnocypris przewalskii 腸道排泄物，發(fā)現(xiàn)堿脅迫使裸鯉腸道大量排出HCO3-離子。這些離子的存在可直接提高腸道內(nèi)pH，一般pH 過(guò)低或過(guò)高都會(huì)直接改變酶的構(gòu)象，影響酶與底物的結(jié)合和酶活性[24]。位瑩瑩[25]研究發(fā)現(xiàn)：飼料中添加AKG 顯著影響松浦鏡鯉腸道消化酶（如蛋白酶）活性，促進(jìn)了腸道蛋白吸收；陳迪[10]等研究表明，添加AKG 可顯著提高鱘腸道蛋白酶活性。本試驗(yàn)中，低堿度條件下（0 mmol/L、15 mmol/L 碳酸鹽堿度），日糧中添加1%AKG 提高了前腸和中腸蛋白酶活性，但效果不顯著；15 mmol/L 堿度水平下，飼喂添加AKG 飼料使實(shí)驗(yàn)魚的前腸淀粉酶活性顯著上升；堿度和AKG 水平對(duì)前腸淀粉酶以及中腸蛋白酶活性均有交互作用；添加AKG 也有降低試驗(yàn)魚前腸、中腸脂肪酶活性的作用，但堿度和AKG 水平對(duì)腸道脂肪酶活性均無(wú)交互作用。此結(jié)果與魏玉強(qiáng)[26]研究結(jié)果中，添加1.5%AKG 可顯著提高鏡鯉前腸和中腸蛋白酶和脂肪酶活性的部分結(jié)果相同，不完全相同的原因可能與鏡鯉的生長(zhǎng)發(fā)育階段有關(guān)。

綜上所述，水體堿度脅迫可影響松浦鏡鯉中腸絨毛的發(fā)育并降低消化酶活性，且隨著堿度上調(diào)，中腸絨毛長(zhǎng)度及前腸、中腸脂肪酶活性顯著下降。飼料中添加AKG 可顯著提高腸道淀粉酶及蛋白酶活性，對(duì)改善堿度脅迫下松浦鏡鯉消化功能具有一定的作用。