CD14/TLR1-TLR2/p38 MAPK信號(hào)通路在萊姆病發(fā)病機(jī)制中的作用

陸麗紅,丁 喆,簡(jiǎn)苗苗,計(jì)震華,寶福凱*,柳愛(ài)華*

(昆明醫(yī)科大學(xué)a.第二臨床學(xué)院; b.云南省高校熱帶傳染病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室; c.熱帶醫(yī)學(xué)研究所; d.病原生物學(xué)與免疫學(xué)系;e.生物化學(xué)與分子生物學(xué)系,中國(guó)云南 昆明 650500)

萊姆病(Lyme disease,LD)又稱萊姆包柔體病(Lyme borreliosis),是由蜱傳播的一種自然免疫源性感染性疾病,伯氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferi,Bb)為致病源[1～2]。我國(guó)于 1985年首次在黑龍江省林區(qū)發(fā)現(xiàn)本病病例,現(xiàn)分布范圍已遍及中國(guó)大部分地區(qū),至少累及30 個(gè)省份[3]。萊姆病系全身性感染,可導(dǎo)致多系統(tǒng)多臟器損傷[4],臨床表現(xiàn)較復(fù)雜,一般潛伏期為3～32 d,平均7 d,臨床癥狀分為一、二、三期,一期表現(xiàn)為皮膚慢性游走性紅斑,可伴有乏力、畏寒發(fā)熱、惡心嘔吐和腦膜刺激征等臨床癥狀; 二期時(shí)8%～15%的患者出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀和心臟受累的現(xiàn)象; 三期時(shí)80%的患者出現(xiàn)不同程度的關(guān)節(jié)癥狀[5]。萊姆病的致死率和致殘率逐年上升,但其發(fā)病機(jī)制仍不清晰。近年來(lái),人們?cè)谔剿鰿D14/TLR1-TLR2/p38 MAPK 信號(hào)通路各部分介導(dǎo)伯氏疏螺旋體引發(fā)的炎癥反應(yīng)、內(nèi)化及宿主細(xì)胞凋亡方面取得了很大進(jìn)展,為萊姆病的發(fā)病機(jī)制研究提供了重要啟示。

1 CD14/TLR1-TLR2/p38 MAPK信號(hào)通路概述

伯氏疏螺旋體入侵機(jī)體后,CD14 識(shí)別病原體表面的細(xì)菌脂蛋白(bacterial lipoprotein,BLP),二者形成穩(wěn)定的復(fù)合物[6]。該復(fù)合物與Toll 樣受體2 (Toll-like receptor 2,TLR2)結(jié)合后引起 TLR1 和TLR2 的二聚化,同時(shí)可引起二聚體的構(gòu)像變化,使得TLR1 和TLR2 的TIR 結(jié)構(gòu)域更加靠近[7]。TLR1和TLR2 通過(guò)脂蛋白N-端的半胱氨酸識(shí)別三?；闹鞍譡8]。TLR1-TLR2 的配體激活髓樣初級(jí)反應(yīng)基因88 (myeloid differentiation primary response gene 88,MyD88)依賴通路[9],其中TLR2 通過(guò)BB-loop 和poc 位點(diǎn)募集下游接頭分子MyD88,完成TLR2 的TIR 結(jié)構(gòu)域與MyD88 的TIR 結(jié)構(gòu)域的二聚化[10]。但有研究表明TLR1-TLR2 除激活MyD88外,也激活了TRIF(TIR-domain-containing adaptor inducing interferon-β),激活的 TRIF 可介導(dǎo)TLR1-TLR2 信號(hào)來(lái)合成配體,如 Pam3CSK4[11]。TRIF 和MyD88 相互作用,引起下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),其中Petnicki-Ocwieja 等[11]證明TRIF 誘導(dǎo)促炎因子需要MyD88 的存在,但其相關(guān)機(jī)制尚不明確。在巨噬細(xì)胞中CD14、TLR1-TLR2 和吞噬細(xì)胞受體形成脂筏[12],導(dǎo)致原本結(jié)合在MyD88 調(diào)節(jié)蛋白Toll 互作蛋白(Toll-interacting protein,Tollip)上的MyD88的下游激酶——白介素1 受體相關(guān)激酶(interleukin-1 receptor-associated kinase,IRAK)從結(jié)合體上脫落,同時(shí)完成IRAK 的自動(dòng)磷酸化[13]。MyD88的 C 端 Toll/IL-1 受體(Toll/IL-1 receptor,TIR)結(jié)構(gòu)域與受體結(jié)合,N 端的DD 結(jié)構(gòu)域募集IRAK1 和IRAK4,募集的IRAK4 發(fā)揮激酶作用導(dǎo)致IRAK1磷酸化[14]?；罨蟮腎RAK1 進(jìn)一步募集腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(tumour necrosis factor-receptorassociated factor-6,TRAF6)并使其寡聚化。IRAK1與TRAF6 隨后與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β 活化激酶 1(transforming growth factor beta-activated kinase-1,TAK1)、TAK1 結(jié)合蛋白 1(TAK1-binding protein-1,TAB1)和TAB2 形成一個(gè)復(fù)合體。復(fù)合體包含了泛素結(jié)合酶13(ubiquitin-conjugating enzyme-13,Ub-C13)和泛素結(jié)合酶E2 變體-1A (ubiquitin-conjugating enzyme E2-variant-1A,UEV1A)[15],介導(dǎo)了TRAF6 的泛素化。泛素化的TRAF6 通過(guò)與Toll途徑進(jìn)化保守信號(hào)中介分子(evolutionarily conserved signaling intermediate,ECSIT)相互作用激活TAK1。TAK1 通過(guò)激活絲裂原活化蛋白激酶激酶3 (mitogen-activated protein kinase kinase-3,MKK3)和MKK6 使p38 磷酸化。磷酸化的p38 促進(jìn)吞噬體的形成,激活下游激酶,引起細(xì)胞核因子κB (nu clear factor-κB,NF-κB)的核易位,穩(wěn)定促炎細(xì)胞因子的mRNA,使促炎因子表達(dá)增加[12](圖1)。

2 CD14/TLR1-TLR2/p38 MAPK信號(hào)通路與萊姆病相關(guān)炎癥

由于缺乏脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),細(xì)菌脂蛋白(BLP)被認(rèn)為是介導(dǎo)伯氏疏螺旋體的主要炎癥反應(yīng)介質(zhì)[16]。伯氏疏螺旋體的脂蛋白是一種膜錨定蛋白,由脂蛋白前體經(jīng)脂質(zhì)化修飾而成,并經(jīng)由Lol (localization of lipoproteins)系統(tǒng)從細(xì)胞周質(zhì)運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞外膜上[8]。BLP 被認(rèn)為是炎癥的主要誘導(dǎo)因子,作為TLR2 配體的同時(shí)也是一種病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular pattern,PAMP),并且在極低的濃度下也能被TLR2識(shí)別。CD14 可識(shí)別伯氏疏螺旋體表面的脂蛋白,從而激活CD14/TLR1-TLR2/p38 MAPK 通路,誘導(dǎo)促炎因子分泌,引起機(jī)體的炎癥反應(yīng)。

2.1 CD14與萊姆病相關(guān)炎癥

CD14 的編碼基因位于人的第5 號(hào)染色體長(zhǎng)臂端5q23～q31,約含有1 338 個(gè)核苷酸殘基,編碼含有375 個(gè)氨基酸的糖蛋白,該糖蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為55 kD,主要特征結(jié)構(gòu)為N-末端富含亮氨酸的重復(fù)單位(leucine-rich repeats,LRRs)[17]。CD14 分為 mCD14 和 sCD14,mCD14 主要分布在單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞的表面,sCD14則存在于正常人和動(dòng)物的血漿中,二者的區(qū)別在于 sCD14 較 mCD14 缺少 GPI 螯合物[18]。CD14 作為一種連接受體[19],主要的生物學(xué)功能是識(shí)別、結(jié)合LPS 或LPS/LBP 復(fù)合物,介導(dǎo)LPS 所致的細(xì)胞反應(yīng),其在炎癥反應(yīng)、內(nèi)毒素休克等病理反應(yīng)中起重要作用。在萊姆病中,CD14 介導(dǎo)的MAPK 通路在促炎抗炎微環(huán)境的調(diào)控中扮演了重要角色,參與了螺旋體刺激巨噬細(xì)胞后白介素10 (interleukin-10,IL-10)和腫瘤壞死因子α (tumor necrosis factor-α,TNF-α)的生成[20]。CD14 可在多種損傷相關(guān)分子模式(damage-associated molecular patterns,DAMPs)作用下促進(jìn)炎性細(xì)胞分泌促炎因子。研究報(bào)道,缺少CD14 的細(xì)胞在DAMPs 的作用下表現(xiàn)出低反應(yīng)的特性,下游信號(hào)如p38 MAPK 等均不能被激活,導(dǎo)致病原體入侵機(jī)體時(shí)機(jī)體分泌更多的促炎因子,從而表現(xiàn)出更嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)[12]。此外,在萊姆關(guān)節(jié)炎中,CD14 的缺乏會(huì)導(dǎo)致基質(zhì)金屬蛋白酶9 的活化減少,膠原蛋白降解減少,殺滅螺旋體的中性粒細(xì)胞募集受阻,最終使萊姆關(guān)節(jié)炎加重[21]。由此可見(jiàn),CD14 在機(jī)體炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。

圖1 細(xì)菌脂蛋白介導(dǎo)的CD14/TLR1-TLR2/p38 MAPK 信號(hào)通路Fig.1 CD14/TLR1-TLR2/p38 MAPK signaling pathway mediated by bacterial lipoproteins

2.2 TLR1/TLR2與萊姆病相關(guān)炎癥

TLRs 是表達(dá)于天然免疫細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞等細(xì)胞表面的重要模式識(shí)別受體,通過(guò)自身的LRRs 結(jié)構(gòu)域識(shí)別PAMPs,刺激炎癥因子的生成,參與病原體的殺傷[10]。TLR1 和TLR2 分布于細(xì)胞膜表面,參與識(shí)別病原體表面的脂蛋白、鞭毛和脂肽等成分。和TLRs 家族其他成員相同,TLR1 和TLR2 含有胞內(nèi)保守的TIR 結(jié)構(gòu)域,用于與下游接頭分子的TIR 功能域特異性相互作用。但是,TLR2 的激活常需要TLR1 和TLR6 的參與,且TLR2 需與TLR1 和TLR6 分別結(jié)合形成異二聚體[22]。TLR1 中保留了與TLR2 結(jié)合的二聚體界面和脂肽通道,TLR2 和TLR1 以αE 螺旋的FW殘基為關(guān)鍵位點(diǎn)[10],通過(guò)螺線管結(jié)合形成異質(zhì)二聚體[22]。除 αE 螺旋的 FW 殘基外,BB-loop 和 DD-loop 也是TLR1 和TLR2 異源二聚化的重要功能域[10]。TLR2 之所以能夠識(shí)別細(xì)菌、真菌和原生生物等不同微生物的外膜成分,TLR1 在其中扮演著重要角色。TLR1 具有一個(gè)疏水性通道,對(duì)于TLR1 和TLR2 形成異二聚體識(shí)別三?；闹鞍子兄匾饔谩Ｏ嚓P(guān)結(jié)構(gòu)研究表明,三?；闹念愃朴诟锾m氏陰性桿菌的脂蛋白,且TLR1/TLR2 一般只能夠識(shí)別三?；闹鞍譡7,23]。伯氏疏螺旋體表面的脂蛋白主要由TLR1-TLR2 識(shí)別[24],識(shí)別后可引起下游炎癥信號(hào)的激活,并使機(jī)體產(chǎn)生促炎因子。在樹(shù)突狀細(xì)胞中,TLR1-TLR2 識(shí)別伯氏疏螺旋體后激活MyD88 依賴的NF-κB 信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng),導(dǎo)致樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟和遷移; 樹(shù)突狀細(xì)胞作為一種專職抗原提呈細(xì)胞(APC),將伯氏疏螺旋體提呈給CD4+T 細(xì)胞,促進(jìn)促炎因子生成[25]。相關(guān)研究報(bào)道,在敲除了TLR2 的小鼠萊姆關(guān)節(jié)炎模型中CD4+T 細(xì)胞并未發(fā)生增殖,而CD8+T細(xì)胞發(fā)生了增殖; 同時(shí),CD8+T 細(xì)胞可以刺激滑膜細(xì)胞產(chǎn)生CXCL9,加速炎癥進(jìn)程[24]。另有研究報(bào)道,在敲除IL-10 的小鼠中,TLR2 可以激活CD4+T細(xì)胞和 CD8+T 細(xì)胞,促進(jìn)干擾素-γ (interferon-γ,IFN-γ)的產(chǎn)生,而伯氏疏螺旋體的入侵也可促進(jìn)CD4+T 細(xì)胞和CD8+T 細(xì)胞的增殖,并在感染3周后細(xì)胞數(shù)量達(dá)到峰值。此外,在伯氏疏螺旋體感染后,TLR2的轉(zhuǎn)錄特異性增強(qiáng),表達(dá)量增加,而TLR1、TLR6 等的轉(zhuǎn)錄特異性不變[26]。綜上所述,CD4+T 細(xì)胞和CD8+T 細(xì)胞在萊姆關(guān)節(jié)炎發(fā)生中發(fā)揮重要作用,而TLR2 則作為T 細(xì)胞活化的關(guān)鍵成分參與到炎癥的進(jìn)程中。當(dāng)用特異性中和抗體阻斷TLR1-TLR2 信號(hào)通路時(shí),趨化因子CC 和 CXC 家族的分泌受到抑制,這提示可以通過(guò)阻斷TLR1-TLR2 的激活來(lái)抑制機(jī)體的炎癥反應(yīng)[27]。

2.3 p38 MAPK與萊姆病相關(guān)炎癥

p38 作為MAPKs 家族的三大分支之一,通過(guò)微調(diào)抗炎和促炎信號(hào)影響炎癥的發(fā)生,并且在應(yīng)激、凋亡、細(xì)胞周期和生長(zhǎng)等多種生理和病理過(guò)程中起重要作用[28]。p38 是由360 個(gè)氨基酸組成的,大小為38 kD 的蛋白質(zhì),與JNK 同屬應(yīng)激激活的蛋白激酶。目前存在6 種p38 MAPK 亞型,分別是 p38α1/α2、p38β1/β2、p38γ 和 p38δ,其中 p38α和p38β 幾乎在所有的組織細(xì)胞中表達(dá)[29],但p38γ主要存在于骨骼肌中,p38δ 則多見(jiàn)于睪丸、唾液腺、胰腺、前列腺、小腸、腦垂體等部位,雖然不同亞型其氨基酸的組成個(gè)數(shù)不同,但同源性超過(guò)了50%[30]。p38 MAPK 在萊姆病的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色,通過(guò)抑制p38 MAPK 可以顯著抑制伯氏疏螺旋體與機(jī)體作用時(shí)促炎因子的生成,從而減輕萊姆病的嚴(yán)重程度。MKK3 是p38 MAPK 的上游激活物,當(dāng)它被阻斷時(shí),p38 MAPK 不能被激活,Th1 細(xì)胞反應(yīng)降低,經(jīng)p38 MAPK 誘導(dǎo)產(chǎn)生的IFN-γ 減少,萊姆關(guān)節(jié)炎減輕[31]。然而,當(dāng)在萊姆心臟炎中阻斷MKK3 時(shí),炎癥減輕的效果卻不如萊姆關(guān)節(jié)炎中顯著,這可能與p38 MAPK 的各種亞型在組織中的分布不均勻,且MKK6 也可以激活p38 MAPK 有關(guān)[32]。此外,在神經(jīng)萊姆病中,p38 MAPK 的受阻也可以抑制少突膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞生成促炎因子TNF-α[33]。綜上可知,p38 MAPK在萊姆關(guān)節(jié)炎、萊姆心臟炎以及萊姆神經(jīng)炎中都起著重要作用。

3 CD14/TLR1-TLR2/p38 MAPK信號(hào)通路與伯氏疏螺旋體內(nèi)化和宿主細(xì)胞凋亡

CD14/TLR1-TLR2/p38 MAPK 信號(hào)通路在介導(dǎo)伯氏疏螺旋體引發(fā)的炎癥反應(yīng)方面具有重要作用。同樣,此通路上的重要組成成分在伯氏疏螺旋體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和內(nèi)化過(guò)程中也具有重要作用。

伯氏疏螺旋體進(jìn)入人體后可以引起小膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡,導(dǎo)致炎癥的發(fā)生,而該炎癥的發(fā)生又可引起更多神經(jīng)元死亡,使機(jī)體表現(xiàn)出神經(jīng)系統(tǒng)的病變; 相關(guān)研究認(rèn)為小膠質(zhì)細(xì)胞在炎癥微環(huán)境中對(duì)神經(jīng)元的凋亡發(fā)揮著不可替代的作用,當(dāng)受到伯氏疏螺旋體刺激后,小膠質(zhì)細(xì)胞上的TLR2 表達(dá)上調(diào),可能通過(guò)增加IL-6 的產(chǎn)生來(lái)介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[34～37]。p38 激酶是一種應(yīng)激激活的激酶,參與調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生[38],并可通過(guò)下游的caspase 來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[30]。在關(guān)于伯氏疏螺旋體導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的研究中,相關(guān)報(bào)道指出TLR2 也可通過(guò)MyD88、Fas 相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白(Fas-associated protein with death domain,FADD)/caspase-8 介導(dǎo)與細(xì)胞凋亡相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[39]。

細(xì)胞的內(nèi)化也被認(rèn)為是導(dǎo)致萊姆病的一大重要因素。伯氏疏螺旋體的內(nèi)化經(jīng)由固有免疫系統(tǒng)細(xì)胞的吞噬作用介導(dǎo)[40]。目前認(rèn)為伯氏疏螺旋體可通過(guò)3 種途徑進(jìn)入吞噬細(xì)胞,分別是Fcγ 受體介導(dǎo)的吞噬作用、傳統(tǒng)的吞噬作用和卷曲吞噬作用[41],其中卷曲作用被認(rèn)為是伯氏疏螺旋體內(nèi)化的首選途徑[42]。巨噬細(xì)胞可以伸出一個(gè)長(zhǎng)而富含肌動(dòng)蛋白的絲狀偽足包圍住伯氏疏螺旋體,且卷曲的偽足有多個(gè)彎曲節(jié)點(diǎn),可以靈活地與螺旋體結(jié)合,在此過(guò)程中細(xì)胞肌動(dòng)蛋白骨架發(fā)生重組[43]。當(dāng)病原體與吞噬細(xì)胞表面結(jié)合后,肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白質(zhì)募集到脂筏表面,進(jìn)行受體依賴的細(xì)胞骨架重排,以此作為伯氏疏螺旋體內(nèi)化的前奏[12]。許多受體都被證明參與了伯氏疏螺旋體的內(nèi)化過(guò)程,如Fcγ 受體、甘露糖受體、補(bǔ)體受體 3、整合素 αMβ2等[42]。當(dāng)伯氏疏螺旋體與吞噬細(xì)胞結(jié)合時(shí),與吞噬有關(guān)的基因CD14 表達(dá)上調(diào),隨后CD14 與整合素的C 型凝集素結(jié)構(gòu)域結(jié)合,促進(jìn)補(bǔ)體受體3 與伯氏疏螺旋體的結(jié)合物向細(xì)胞表面移動(dòng),從而啟動(dòng)內(nèi)化信號(hào)[42,44～45]。整合素是配體內(nèi)吞的重要調(diào)節(jié)因子,伯氏疏螺旋體可表達(dá)整合素α3β1,并通過(guò)脂蛋白的內(nèi)吞作用激活TLR1-TLR2,隨后TLR1-TLR2 的配體Pam3CSK4誘導(dǎo)內(nèi)吞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),并通過(guò)網(wǎng)格蛋白完成內(nèi)化。與整合素α3β1 不同,整合素 αvβ3 介導(dǎo) Pam3CSK4與巨噬細(xì)胞結(jié)合,導(dǎo)致三?；鞍着cTLR1-TLR2 在細(xì)胞表面聚集,從而促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)吞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[19]。需要指出的是,伯氏疏螺旋體進(jìn)入宿主細(xì)胞并不完全依賴某一個(gè)受體,有學(xué)者提出在這些受體激活的下游吞噬通路中可能存在著復(fù)雜的交叉作用[42]。

4 結(jié)語(yǔ)與展望

綜上所述,CD14/TLR1-TLR2/p38 MAPK 信號(hào)通路在萊姆病的發(fā)病機(jī)制中可能扮演著重要角色。已有研究顯示,加入外源性cAMP 能顯著增加IL-10 的表達(dá)且能顯著降低促炎、關(guān)節(jié)炎易感性基因的轉(zhuǎn)錄水平[20]。因此,cAMP 調(diào)節(jié)劑相關(guān)的藥物研究或許可以為治療伯氏疏螺旋體引起的炎癥反應(yīng)打開(kāi)新思路。此外,蛋白激酶C (protein kinase C,PKC)的新型抑制劑粗糠柴毒素和白屈菜赤堿可以顯著抑制p38 的磷酸化,同時(shí)可以顯著減輕感染后C3H/HeN 小鼠的踝關(guān)節(jié)炎和腫脹,并且可以阻斷IL-1b 和IL-8 等炎癥介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄[46],提示含有PKC 抑制劑的藥物對(duì)伯氏疏螺旋體引起的感染可能具有臨床應(yīng)用價(jià)值。

目前,CD14/TLR1-TLR2/p38 MAPK 信號(hào)通路與萊姆病相關(guān)螺旋體內(nèi)化、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡的關(guān)系都有研究,但存在對(duì)三者之間的聯(lián)系研究不夠深入的情況。對(duì)三者之間的聯(lián)系進(jìn)行深入研究將讓我們對(duì)萊姆病的發(fā)病機(jī)制有更全面的了解。同時(shí),現(xiàn)有工作注重該信號(hào)通路上某一成分的研究,缺少對(duì)信號(hào)通路的整體研究。完整信號(hào)通路的研究將為探索萊姆病發(fā)病機(jī)制提供新思路,并可為一些靶點(diǎn)藥物的開(kāi)發(fā)提供更好的理論依據(jù)。