體色差異豹紋鰓棘鱸的色素及酶含量分析

鄧 成,陳帥龍,葉恒振,齊興柱,駱 劍

(海南大學(xué)南海海洋資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室海南省水產(chǎn)種業(yè)工程研究中心海南省熱帶水生生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中國(guó)海南 海口 570228)

豹紋鰓棘鱸(Plectropomus leopardus),俗稱東星斑,屬于鱸形目、鱸亞目、鮨科、鰓棘鱸屬,為暖水性礁棲魚(yú)類,廣泛分布于太平洋西岸、印度洋等海域。豹紋鰓棘鱸的體色會(huì)隨環(huán)境改變,體色鮮艷、變化豐富,是研究魚(yú)類體色發(fā)育與變異的好材料。豹紋鰓棘鱸常規(guī)體色呈紅色或鮮橘紅色,全身布滿藍(lán)色或藍(lán)白色的圓形或橢圓形斑點(diǎn),而養(yǎng)殖個(gè)體常常呈現(xiàn)黑棕色。體色鮮紅的豹紋鰓棘鱸很受市場(chǎng)歡迎,具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

目前,國(guó)內(nèi)外學(xué)者在魚(yú)類體色相關(guān)的機(jī)制方面已有初步研究[1～4]。魚(yú)類的體色是由真皮層色素細(xì)胞的色素顆粒運(yùn)動(dòng)以及光反射器官的光散射產(chǎn)生的物理顏色,色素顆粒在細(xì)胞內(nèi)延伸和擴(kuò)散,從而改變體表的顏色。色素細(xì)胞及色素顆粒的分布、大小、種類、密度、排列方式的不同,很大程度上直接影響了魚(yú)類體色的呈現(xiàn)結(jié)果[5]。依據(jù)包含的色素顆粒、色素、形態(tài)和運(yùn)動(dòng)型,色素細(xì)胞分為以下 6 種：黑色素細(xì)胞(melanophore)、白色素細(xì)胞(leucophore)、紅色素細(xì)胞(erythrophore)、黃色素細(xì)胞(xanthophore)、藍(lán)色素細(xì)胞(cyanophore)和虹彩色素細(xì)胞(iridophore)。黑色素細(xì)胞內(nèi)含黑色素顆粒,分泌黑色素,使體表呈現(xiàn)黑色或者褐色。Fujii[6]的研究表明,體色深淺變化與黑色素顆粒聚集程度有關(guān),顆粒距離越遠(yuǎn),體色越淺。白色素細(xì)胞包含白色顆粒,分泌尿酸和鳥(niǎo)嘌呤,因反光使體表呈現(xiàn)白色。紅色素細(xì)胞和黃色素細(xì)胞包含胡蘿卜素和類胡蘿卜素,色素細(xì)胞形成與脂肪代謝相關(guān),呈現(xiàn)紅色、橙色或者黃色。程煒軒等[7]在黃顙魚(yú)中發(fā)現(xiàn),黑色素缺失會(huì)使魚(yú)體出現(xiàn)黃化現(xiàn)象。藍(lán)色素細(xì)胞呈圓形;虹彩色素細(xì)胞呈棒狀或顆粒狀,包含反射小板,富含鳥(niǎo)嘌呤,細(xì)胞可排列形成光反射層。劉曉東等[8]在七彩神仙魚(yú)中發(fā)現(xiàn)其表皮藍(lán)條紋區(qū)有大量虹彩色素細(xì)胞和黑色素細(xì)胞。黑色素代謝酶(melanin metabolic enzyme,MME)是黑色素代謝的一種關(guān)鍵活性金屬蛋白酶,該酶可將黑色素轉(zhuǎn)化為氨基酸,從而清除機(jī)體表皮的黑色素。

魚(yú)類在適應(yīng)環(huán)境的過(guò)程中,會(huì)產(chǎn)生生理上的體色變化。其中,色素細(xì)胞可通過(guò)運(yùn)動(dòng)改變自身體色[9],同時(shí)也可通過(guò)色素細(xì)胞的增殖或者減少對(duì)體色產(chǎn)生影響。此外,光感受也會(huì)導(dǎo)致體色變化,例如光照周期、光照強(qiáng)度等會(huì)影響內(nèi)分泌系統(tǒng)對(duì)酶活及色素細(xì)胞生成代謝的調(diào)控[10]。

本文首先對(duì)體色具有顯著差異的豹紋鰓棘鱸個(gè)體的表觀體色特征進(jìn)行分類分析,然后檢測(cè)體色差異樣本的主要色素含量,同時(shí)判斷體色差異是否與色素代謝酶的含量存在聯(lián)系,以揭示豹紋鰓棘鱸體色變異的形態(tài)學(xué)和色素生理學(xué)規(guī)律,為探討礁棲石斑魚(yú)體色變異機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)所用豹紋鰓棘鱸采集于海南省瓊海市鴻茂水產(chǎn)有限公司基地,從養(yǎng)殖群體中篩選體色差異較大的紅色和黑色個(gè)體各30 尾,每尾體長(zhǎng)為 35±5 cm,體重為 520±20 g。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)分為8 組：1)紅色個(gè)體背部組(RB); 2) 黑色個(gè)體背部組(BB); 3) 紅色個(gè)體腹部組(RF); 4) 黑色個(gè)體腹部組(BF);5) 紅色個(gè)體尾部組(RW); 6) 黑色個(gè)體尾部組(BW);7)紅色個(gè)體血液組(RX); 8) 黑色個(gè)體血液組(BX)。

1.3 體色觀察

將采集到的樣本放置于攝影燈箱內(nèi),使用索尼數(shù)碼相機(jī)(DSC-WX500)拍照保存。采用Motic SMZ-168 體視系統(tǒng)記錄皮膚色斑分布。

1.4 色素提取和酶含量分析

在實(shí)驗(yàn)樣本中挑選出典型的紅色或黑色個(gè)體各4 尾,采用手術(shù)刀及鑷子將全部實(shí)驗(yàn)用魚(yú)的背部、腹部、尾部皮膚組織(1 cm × 1 cm)取下,并快速放置于-80 ℃的冰箱內(nèi)冷凍保存?zhèn)溆?。采?0 mL注射器抽取樣本血液于1.5 mL 離心管中,靜置過(guò)夜后提取血漿保存于4 ℃冰箱備用。

對(duì)于豹紋鰓棘鱸組織樣品的色素提取和黑色素酶含量的檢測(cè),本文主要參考魚(yú)黑色素(Fish)酶聯(lián)免疫分析試劑盒、魚(yú)黑色素代謝酶(MME)酶聯(lián)免疫分析試劑盒、魚(yú)胡蘿卜素(carotene)酶聯(lián)免疫分析試劑盒、魚(yú)類胡蘿卜素(carotenoids)酶聯(lián)免疫分析試劑盒中的操作步驟進(jìn)行。所用試劑盒均購(gòu)置于上海江萊生物科技有限公司。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 18.0 分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差,±s)進(jìn)行單因素方差分析,利用Duncan法進(jìn)行多重比較,顯著性水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 豹紋鰓棘鱸的表觀體色差異

本文選取了體色為紅、黑的典型差異個(gè)體,在兩種體色的豹紋鰓棘鱸表皮中均觀察到黑色素細(xì)胞、紅色素細(xì)胞。其中,黑色個(gè)體體表分布大量黑色素細(xì)胞(圖1F～H),紅色個(gè)體體表主要分布紅色素細(xì)胞(圖1C～E)。此外,我們?cè)诒y鰓棘鱸表皮觀察中發(fā)現(xiàn)其背部和尾部的顏色較深,而腹部的顏色較淺(圖 1A,1B)。

2.2 豹紋鰓棘鱸不同組織的黑色素含量

根據(jù)試劑盒操作說(shuō)明對(duì)豹紋鰓棘鱸紅、黑個(gè)體進(jìn)行不同部位皮膚和血漿黑色素含量的測(cè)定,結(jié)果如圖 2 所示。BB 組、BF 組、BW 組和 BX 組的黑色素含量分別為 10.46 μg/g、7.55 μg/g、9.83 μg/g、11.25 μg/g; RB 組、RF 組、RW 組和 RX 組的黑色素含量分別為 6.91 μg/g、4.56 μg/g、5.97 μg/g、7.17 μg/g。

對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn),黑色個(gè)體中,背部和尾部皮膚的黑色素含量無(wú)顯著性差異(P＞0.05),但均顯著高于腹部皮膚中的黑色素含量(P＜0.05);紅色個(gè)體中,背部黑色素含量顯著高于腹部皮膚中的黑色素含量(P＜0.05),而背部和尾部中的黑色素含量無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。此外,黑色個(gè)體在背部、腹部中的黑色素含量均顯著高于紅色個(gè)體;黑色個(gè)體血漿中的黑色素含量與紅色個(gè)體血漿中的黑色素含量存在顯著性差異。

2.3 豹紋鰓棘鱸不同組織中黑色素酶的含量

豹紋鰓棘鱸紅、黑個(gè)體皮膚和血漿中黑色素酶的含量測(cè)定結(jié)果如圖 3 所示。BB 組、BF 組、BW組、BX 組的黑色素酶含量分別為0.21 ng/g、0.19 ng/g、0.22 ng/g、0.13 ng/g;RB 組、RF 組、RW 組、RX 組的黑色素酶含量分別為0.32 ng/g、0.39 ng/g、0.30 ng/g、0.47 ng/g。在黑色個(gè)體,背部、腹部和尾部皮膚中的黑色素酶含量無(wú)顯著性差異。就腹部皮膚而言,黑色素酶在紅色個(gè)體中的含量顯著高于黑色個(gè)體,但紅色個(gè)體在背部和尾部皮膚中的黑色素酶含量無(wú)顯著性差異。此外,黑色素酶含量在黑色個(gè)體血漿與紅色個(gè)體血漿間存在顯著性差異。

2.4 豹紋鰓棘鱸不同組織中類胡蘿卜素的含量

BB 組、BF 組、BW 組和 BX 組的類胡蘿卜素含量分別為 92.15 mg/g、62.64 mg/g、90.55 mg/g、173.64 mg/g; RB 組、RF 組、RW 組和 RX 組的類胡蘿卜素含量分別為 140.66 mg/g、88.76 mg/g、147.73 mg/g、208.15 mg/g。紅色個(gè)體中,背部和尾部皮膚的類胡蘿卜素含量無(wú)顯著性差異,但均顯著高于腹部皮膚中的類胡蘿卜素含量; 黑色個(gè)體中,背部和尾部皮膚的類胡蘿卜素含量無(wú)顯著性差異,但也均顯著高于腹部皮膚中的類胡蘿卜素含量。紅色個(gè)體在不同組織中的類胡蘿卜素含量均顯著高于黑色個(gè)體(圖4)。

圖1 豹紋鰓棘鱸體色變異與表皮顯微觀察結(jié)果(A) 紅色個(gè)體; (B) 黑色個(gè)體; (C) 紅色個(gè)體背部表皮; (D) 紅色個(gè)體腹部表皮; (E) 紅色個(gè)體尾部表皮; (F) 黑色個(gè)體背部表皮; (G) 黑色個(gè)體腹部表皮; (H) 黑色個(gè)體尾部表皮。Fig.1 Microscopic observation of body color variation and epidermis of P.leopardus(A) The red individual; (B) The black individual; (C) Back epidermis of the red; (D) Abdominal epidermis of the red; (E) Tail epidermis of the red; (F) Back epidermis of the black; (G) Abdominal epidermis of the black; (H) Tail epidermis of the black.

圖2 豹紋鰓棘鱸紅、黑個(gè)體皮膚和血液中黑色素含量的比較圖中a～e 不同字母表示組間存在顯著性差異。BB：黑色個(gè)體背部皮膚;RB：紅色個(gè)體背部皮膚; BF：黑色個(gè)體腹部皮膚;RF：紅色個(gè)體腹部皮膚;BW：黑色個(gè)體尾部皮膚; RW：紅色個(gè)體尾部皮膚;BX：黑色個(gè)體血液;RX：紅色個(gè)體血液。Fig.2 Comparison of skin and blood melanin contents in red and black individuals of P.leopardusDifferent letters a ～e mean significant differences between groups.BB：Back skin of the blacks; RB：Back skin of the reds; BF：Abdominal skin of the blacks; RF：Abdominal skin of the reds; BW：Tail skin of the blacks; RW：Tail skin of the reds; BX：Blood of the blacks; RX：Blood of the reds.

圖3 豹紋鰓棘鱸紅、黑個(gè)體皮膚和血液中黑色素酶含量的比較BB：黑色個(gè)體背部皮膚; RB：紅色個(gè)體背部皮膚; BF：黑色個(gè)體腹部皮膚; RF：紅色個(gè)體腹部皮膚; BW：黑色個(gè)體尾部皮膚; RW：紅色個(gè)體尾部皮膚; BX：黑色個(gè)體血液; RX：紅色個(gè)體血液。Fig.3 Comparison of skin and blood melaninase con原tents in red and black individuals of P.leopardusBB：Back skin of the blacks; RB：Back skin of the reds; BF：Abdominal skin of the blacks; RF：Abdominal skin of the reds; BW：Tail skin of the blacks; RW：Tail skin of the reds;BX：Blood of the blacks; RX：Blood of the reds.

圖4 豹紋鰓棘鱸紅、黑個(gè)體不同組織類胡蘿卜素含量的比較BB：黑色個(gè)體背部皮膚; RB：紅色個(gè)體背部皮膚; BF：黑色個(gè)體腹部皮膚; RF：紅色個(gè)體腹部皮膚; BW：黑色個(gè)體尾部皮膚; RW：紅色個(gè)體尾部皮膚; BX：黑色個(gè)體血液; RX：紅色個(gè)體血液。Fig.4 Comparison of the carotenoid content in different tissues of red and black individuals of P.leopardusBB：Back skin of the blacks; RB：Back skin of the reds; BF：Abdominal skin of the blacks; RF：Abdominal skin of the reds; BW：Tail skin of the blacks; RW：Tail skin of the reds;BX：Blood of the blacks; RX：Blood of the reds.

2.5 豹紋鰓棘鱸不同組織中胡蘿卜素的含量

豹紋鰓棘鱸紅、黑個(gè)體均進(jìn)行了皮膚和血漿胡蘿卜素的含量測(cè)定,結(jié)果如圖5 所示。BB 組、BF 組、BW 組、BX 組的胡蘿卜素含量分別為50.94 mg/g、33.09 mg/g、54.11 mg/g、103.30 mg/g;RB 組、RF 組、RW 組、RX 組的胡蘿卜素含量分別為 80.91 mg/g、45.84 mg/g、85.62 mg/g、111.04 mg/g。

紅色個(gè)體中,背部和尾部皮膚的胡蘿卜素含量無(wú)顯著性差異,但均顯著高于腹部皮膚中的胡蘿卜素含量; 黑色個(gè)體中,背部和尾部皮膚的胡蘿卜素含量無(wú)顯著性差異,但也均顯著高于腹部皮膚中的胡蘿卜素含量。紅色個(gè)體在不同組織中的胡蘿卜素含量均顯著高于黑色個(gè)體。

3 討論

3.1 皮膚和血液中胡蘿卜素和類胡蘿卜素含量與體色的關(guān)系

魚(yú)類體色組成的基本色素包括黑色素、類胡蘿卜素群、紅色素、黃色素等。由于魚(yú)體不能自身合成胡蘿卜素和類胡蘿卜素,需要通過(guò)攝食來(lái)獲取,因此其著色程度受類胡蘿卜素?cái)z入量的影響。朱藝峰等[11]報(bào)道通過(guò)飼料中添加類胡蘿卜素,可增加養(yǎng)殖魚(yú)類的肌肉著色度。在花瑪麗魚(yú)的研究中,飼料中類胡蘿卜素含量的差異,可導(dǎo)致個(gè)體呈現(xiàn)出不同的體色,其中在飼料中添加400 mg/kg類胡蘿卜素對(duì)其體色的影響最為明顯[12]。周邦維等[13]在有關(guān)豹紋鰓棘鱸生長(zhǎng)發(fā)育所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的研究中發(fā)現(xiàn),胡蘿卜素的含量在很大程度上影響了豹紋鰓棘鱸皮膚中色素的含量。

圖5 豹紋鰓棘鱸紅、黑個(gè)體皮膚及血液中胡蘿卜素含量的比較BB：黑色個(gè)體背部皮膚; RB：紅色個(gè)體背部皮膚; BF：黑色個(gè)體腹部皮膚; RF：紅色個(gè)體腹部皮膚; BW：黑色個(gè)體尾部皮膚; RW：紅色個(gè)體尾部皮膚; BX：黑色個(gè)體血液; RX：紅色個(gè)體血液。Fig.5 Comparison of the carotene content in different body parts of red and black individuals of P.leopardusBB：Back skin of the blacks; RB：Back skin of the reds; BF：Abdominal skin of the blacks; RF：Abdominal skin of the reds; BW：Tail skin of the blacks; RW：Tail skin of the reds;BX：Blood of the blacks; RX：Blood of the reds.

黃色、橙色和紅色錦鯉所含的主要色素組分可能分別是α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素和蝦青素[14]。有研究表明,不同種群的紅身藍(lán)首魚(yú)的著色變化取決于類胡蘿卜素的含量與種類。在金色和灰色變種個(gè)體的皮膚中,類胡蘿卜素含量具有顯著性差異; 而在灰色向金色轉(zhuǎn)變的樣本中,與黑色素細(xì)胞的凋亡和類胡蘿卜素的積累相關(guān)的基因呈現(xiàn)出顯著的表達(dá)差異[15～17]。

本研究觀察結(jié)果表明,豹紋鰓棘鱸各個(gè)部位皮膚的呈色存在差異,在紅色和黑色個(gè)體中,背部和尾部的顏色均較深而腹部較淺,背部與尾部是紅色素細(xì)胞與黑色素細(xì)胞分布集中的區(qū)域,而這些細(xì)胞在腹部的分布則比較稀疏。各部位色素含量的檢測(cè)結(jié)果也顯示,豹紋鰓棘鱸背部和尾部的色素含量較高,其中紅色個(gè)體各部位的胡蘿卜素與類胡蘿卜素含量均顯著高于黑色個(gè)體相應(yīng)的部位; 腹部色素含量較低,紅、黑個(gè)體腹部皮膚的胡蘿卜素和類胡蘿卜素含量在所有部位中最低,這與表觀體色規(guī)律保持一致,說(shuō)明胡蘿卜素與類胡蘿卜素對(duì)豹紋鰓棘鱸體色影響顯著,兩種色素含量越高,體色越鮮艷。盡管黑色個(gè)體的胡蘿卜素與類胡蘿卜素含量較紅色個(gè)體而言整體偏低,但是在血漿中仍然有較高的含量,這說(shuō)明皮膚對(duì)色素的吸收或代謝的差異,也是導(dǎo)致豹紋鰓棘鱸體色差異的重要原因。

3.2 黑色素、黑色素酶與豹紋鰓棘鱸體色的關(guān)系

黑色素細(xì)胞是皮膚中的一種特殊細(xì)胞,能夠產(chǎn)生黑色素并且傳遞給周?chē)慕琴|(zhì)細(xì)胞,從而使皮膚呈現(xiàn)黑色和褐色。大菱鲆的白化與黑色素的含量有關(guān),研究顯示體色正常的個(gè)體與體色白化的個(gè)體在黑色素含量上有著顯著的差異[18]?？兹隔~(yú)中黑色素的形成由一對(duì)等位基因控制,顯性基因個(gè)體的黑色素細(xì)胞可分泌豐富的黑色素,而隱性基因個(gè)體的黑色素細(xì)胞分泌黑色素較少[19]。在紅鯽魚(yú)中,黑色素細(xì)胞出現(xiàn)在胚胎和幼魚(yú)的階段,隨著黑色素細(xì)胞的消失,紅色鯽魚(yú)的體色在形成過(guò)程中由深灰色變?yōu)榧t橙色[20]。本研究結(jié)果顯示,在豹紋鰓棘鱸個(gè)體中,各個(gè)部位的黑色素含量均表現(xiàn)為黑色個(gè)體顯著高于紅色個(gè)體,這也與顯微鏡的觀察結(jié)果相吻合。此外,豹紋鰓棘鱸腹部較淺,這也與其黑色素含量較低相關(guān)。

同時(shí),本研究的檢測(cè)數(shù)據(jù)顯示,豹紋鰓棘鱸紅、黑個(gè)體之間的色素差異也表現(xiàn)在血漿色素含量上,黑色個(gè)體與紅色個(gè)體血漿中的黑色素含量分別為 11.25 μg/g 和 7.17 μg/g,存在顯著性差異,這種差異可能與黑色素合成相關(guān)。酪氨酸蛋白酶的活性被廣泛證明與黑色素生成呈正相關(guān)。相關(guān)研究報(bào)道,刺鼠信號(hào)蛋白會(huì)抑制酪氨酸蛋白酶的活性,進(jìn)而減少黑色素的產(chǎn)量[21]; 熊果素和Vc 能抑制斑馬魚(yú)中酪氨酸酶的活性,進(jìn)而抑制黑色素顆粒的生成量[22]。此外,飼料添加物、外部環(huán)境等也會(huì)影響黑色素的合成[13,23～24]。豹紋鰓棘鱸在野生環(huán)境下多呈紅色,而網(wǎng)箱養(yǎng)殖群體多顯色較深,這可能與其外部環(huán)境及餌料的改變相關(guān)。

黑色素酶主要在氨基酸氧化酶的作用下經(jīng)脫氨基反應(yīng)清除機(jī)體表皮沉淀的黑色素。本文的結(jié)果顯示,豹紋鰓棘鱸紅色個(gè)體中的黑色素代謝酶含量顯著高于黑色個(gè)體,高水平的黑色素酶含量可能伴隨較高的黑色素分解,從而導(dǎo)致紅色色素更容易顯現(xiàn)出來(lái)。魚(yú)類通過(guò)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)色素細(xì)胞器的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制,通過(guò)酶代謝及激素作用的方式介導(dǎo)體色機(jī)制的改變[1]。豹紋鰓棘鱸紅色個(gè)體血液中的黑色素酶含量為0.47 ng/g,而黑色個(gè)體血液中的含量?jī)H為0.13 ng/g,二者間不僅存在顯著性差異,且與黑色素含量呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。豹紋鰓棘鱸皮膚的黑色素含量顯著影響了其呈色,而黑色素的含量不僅與黑色素的合成量相關(guān),也與黑色素酶的活性相關(guān),后者決定了黑色素的清除效率。

綜上所述,豹紋鰓棘鱸皮膚黑色的呈現(xiàn)與黑色素和黑色素酶的含量相關(guān); 而紅色的呈現(xiàn)與胡蘿卜素、類胡蘿卜素等的含量相關(guān); 其不同部位的皮膚的色素沉積和代謝存在顯著差異。豹紋鰓棘鱸紅、黑體色的差異可能主要通過(guò)色素細(xì)胞分布、色素的沉積機(jī)制、黑色素代謝機(jī)制共同調(diào)控。