DJ-1的高表達(dá)通過cyclin D1/p53-MDM2-AKT途徑促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲

南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院胃腸外科，江西 南昌 330006

結(jié)直腸癌是胃腸道常見的惡性腫瘤之一，也是全世界范圍內(nèi)癌癥相關(guān)死亡的第4大主要原因［1］。目前，手術(shù)和輔助治療是治療結(jié)直腸癌的主要方法。盡管在治療順利的情況下，結(jié)直腸癌的預(yù)后并不樂觀，其5年總體生存率不足50%［2］。侵襲轉(zhuǎn)移是其高死亡率和不良預(yù)后的主要原因之一，約90%的結(jié)直腸癌相關(guān)死亡是由于轉(zhuǎn)移性疾病而發(fā)生的［3］。前期研究已經(jīng)進(jìn)行了大量結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展的分子生物學(xué)研究，并且發(fā)現(xiàn)了許多與轉(zhuǎn)移有關(guān)的癌基因和抑癌因子（p53、KRAS及Snail）［4-6］。然而，結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展的生物學(xué)機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

DJ-1基因是起初由日本學(xué)者Nagakubo等［7］在小鼠的NIH3T3細(xì)胞研究中發(fā)現(xiàn)并命名的一種新絲裂原依賴性癌基因，該基因位于人類1號染色體短臂36位點（1p36.12-1p36.33），其編碼產(chǎn)物DJ-1蛋白是一種高度保守的蛋白、以同源二聚體的形式廣泛表達(dá)于機(jī)體各組織細(xì)胞，并參與細(xì)胞內(nèi)多種生理、病理活動，如轉(zhuǎn)錄調(diào)控［8］、抗氧化應(yīng)激［9］、抗細(xì)胞凋亡［9］、分子伴侶及促細(xì)胞生長增殖等［10-11］。早期對DJ-1的研究主要集中在帕金森綜合征方面，表明DJ-1基因突變與人類常染色體隱性早發(fā)型帕金森病息息相關(guān)。然而，自從DJ-1被發(fā)現(xiàn)能協(xié)同c-MYC或H-Ras等癌基因促進(jìn)正常永生化成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化后，DJ-1與腫瘤的關(guān)系引起了學(xué)者的廣泛關(guān)注。研究表明，DJ-1在胃癌［12］、肝癌［13］、胰腺癌［14］和食管癌［15］等多種消化系統(tǒng)惡性腫瘤中呈現(xiàn)異常高表達(dá)，并與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)。但是，目前關(guān)于DJ-1在結(jié)直腸癌中的臨床價值、功能及其分子機(jī)制的研究仍然很少。因此，探索DJ-1在是否參與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展對于結(jié)直腸癌的防治具有重要的科學(xué)意義與臨床價值。本研究的完成將為結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的防治提供新思路和有效的干預(yù)環(huán)節(jié)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 標(biāo)本

34例結(jié)直腸癌組織、配對的癌旁組織樣本來自南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院病理科的組織樣本庫（2016年7月—2018年12月），其中男性24例，女性10例。癌旁組織距離癌灶邊緣＞5 cm，且均來自同一結(jié)直腸癌患者。

1.1.2 細(xì)胞系

人結(jié)直腸癌SW480、HCT116細(xì)胞系購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）。

1.1.3 主要試劑

DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基和胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自美國Gibco公司，RNA提取試劑TRIzol等購自美國Invitrogen公司，實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）試劑、試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司，蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）所用試劑及IP裂解液、BCA試劑盒、BeyoClick? EdU-555細(xì)胞增殖檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。OE-DJ-1過表達(dá)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系SW480、HCT116由上海聚焦生物科技有限公司構(gòu)建，shDJ-1干擾片段由吉瑪基因股份有限公司（中國）構(gòu)建完成。DJ-1、p53、Bax、Bcl-2、GAPDH、β-tubulin一抗購自美國CST、Abcam公司；cyclin D1、MDM2、p-MDM2、AKT與p-AKT一抗購自美國Proteintech、CST公司，HRP標(biāo)記山羊抗兔、抗鼠二抗均購自美國Abcam公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)檢測

組織樣本芯片經(jīng)枸櫞酸鈉修復(fù)液（pH為6.0）進(jìn)行抗原修復(fù)（高壓修復(fù)，5 min），抗DJ-1抗體（濃度1∶800）4 ℃溫育過夜，二抗室溫溫育30 min，DAB顯色液反應(yīng)2 min。自來水沖洗，蘇木精復(fù)染0.1%HCL分化，二甲苯透明，中性樹膠封固切片顯微鏡觀察。

1.2.2 RTFQ-PCR檢測

采用TRIzol試劑從34對結(jié)直腸癌組織樣品中提取總RNA，依據(jù)RTFQ-PCR試劑、試劑盒說明書通過RTFQ-PCR合成cDNA，分別用DJ-1和GAPDH進(jìn)行RTFQ-PCR檢測（表1）。RTFQ-PCR擴(kuò)增條件如下：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性5 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)。

表1 基因引物序列Tab.1 Gene primer sequence

1.2.3 EDU檢測細(xì)胞增殖能力

分別將Mock組及OE-DJ-1組SW480、HCT116細(xì)胞接種于6孔板培養(yǎng)皿中，細(xì)胞培養(yǎng)至細(xì)胞密度為75%～85%，每孔加入37 ℃預(yù)熱的100 μL 10 μmol/L EdU工作液溫育2 h，EdU標(biāo)記完成后4%多聚甲醛室溫固定15 min，50 μL 2 mg/mL甘氨酸溶液脫色5 min，0.3%Triton X-100的PBS溫育10 min，分步Apollo、Hoechst染色反應(yīng)液染色，激光掃描共聚焦顯微鏡觀察并拍照記錄（Hoechst 33342為藍(lán)光）。

1.2.4 平板克隆實驗

取對數(shù)生長期的各組細(xì)胞，消化重懸后將細(xì)胞懸液作梯度倍數(shù)稀釋，以每孔50、100、200個細(xì)胞的梯度密度分別接種于6孔板中，置37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10～14 d。經(jīng)常觀察，當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時，終止培養(yǎng)。棄去上清液，用PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定細(xì)胞5 mL固定15 min。然后去固定液，加適量GIMSA應(yīng)用染色液染10～30 min，在顯微鏡計數(shù)大于10個細(xì)胞的克隆數(shù)，最后計算克隆形成率。

1.2.5 劃痕實驗

先用無菌記號筆于6孔板背面劃3條平行直線后備用。將SW480、HCT116細(xì)胞接種于準(zhǔn)備好的6孔板中，密度約為5×105個/mL。第2天用10 μL的吸嘴垂直于6孔板背面的橫線劃痕，并用PBS洗去被劃下的細(xì)胞，記錄0、24和48 h各組細(xì)胞劃痕寬度，計算細(xì)胞的劃痕面積、傷口愈合百分比。

1.2.6 Transwell侵襲、遷移實驗

先將Matrigel基質(zhì)膠對transwell小室進(jìn)行預(yù)包被處理，即將Matrigel基質(zhì)膠置于4 ℃預(yù)冷后，加入適量Matrigel基質(zhì)膠覆蓋transwell小室底部，將transwell小室放于培養(yǎng)箱中待Matrigel基質(zhì)膠凝固后取出備用。將消化、重懸后的SW480、HCT116細(xì)胞（Mock/OE-DJ-1組、Vector/shDJ-1組）以2×105個/mL的密度每孔100 μL接種于無血清小室上層，下室中加入含20%FBS培養(yǎng)基。溫育24 h，用無菌棉簽擦去表面未遷移細(xì)胞，結(jié)晶紫（0.1%）對遷移細(xì)胞染色，顯微鏡下觀察計數(shù)（遷移實驗不加Matrigel基質(zhì)膠）。

1.2.7 Western blot實驗

培養(yǎng)、處理各組細(xì)胞后，用Western blot及IP裂解液提取細(xì)胞總蛋白（1∶99加入PMSF），并用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度后調(diào)平。每組分別取30 μg蛋白用12%丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行電泳分離，采用260 mA電流濕轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)膜后的PVDF膜（0.45 μm）用5%的脫脂奶粉室溫封閉2 h，2 h后加入適宜濃度的一抗（DJ-1為1∶1 000，p53為1∶1 000，Bax為1∶500等）于4 ℃溫育過夜。第2天取出PVDF膜，TBST洗去膜上未結(jié)合一抗（每次10 min，洗3次），加入二抗37 ℃溫育1 h后，TBST洗去膜上未結(jié)合二抗（每次10 min，洗3次），滴加ECL化學(xué)發(fā)光顯色液進(jìn)行曝光顯影。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

所有實驗結(jié)果均用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 19.0進(jìn)行分析，采用t檢驗、Pearsonχ2檢驗分析DJ-1表達(dá)與臨床病理學(xué)特征之間的相關(guān)性，實驗結(jié)果以表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。所有實驗至少重復(fù)2次。

2 結(jié)果

2.1 DJ-1在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)

Western blot檢測結(jié)果顯示，在結(jié)直腸癌組織中DJ-1蛋白水平顯著高于癌旁組織（表2，圖1，P＜0.001）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，DJ-1高表達(dá)與結(jié)直腸癌TNM分期、部位、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分化程度均顯著相關(guān)（P＜0.01），提示DJ-1高表達(dá)可能影響結(jié)直腸癌患者的預(yù)后（表3）。

表2 DJ-1在結(jié)直腸癌組織與癌旁組織的表達(dá)水平Tab.2 DJ-1 expression in colorectal cancer and paracancerous tissues

圖1 DJ-1在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)Fig.1 DJ-1 is upregulated in colorectal cancer tissues

表3 DJ-1表達(dá)與結(jié)直腸癌組織臨床病理學(xué)特征的相關(guān)性Tab.3 The correlation of DJ-1 expression and clinical pathological characteristics of colorectal cancer

2.2 DJ-1過表達(dá)（overexpression-DJ-1，OEDJ-1）可促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）

各組細(xì)胞培養(yǎng)14 d，結(jié)果顯示，DJ-1可促使結(jié)直腸癌細(xì)胞發(fā)生EMT，進(jìn)而促進(jìn)轉(zhuǎn)移，其具體分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究（圖2）。

2.3 DJ-1在體外促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖

圖2 細(xì)胞EMT研究Fig.2 EMT of the cells

平板克隆形成實驗，相比于vector組，SW480、HCT116細(xì)胞轉(zhuǎn)染shRNA后（shDJ-1-1#和shDJ-1-2#），單個細(xì)胞形成集落的能力顯著減弱（圖3A，P＜0.01）。同樣，EdU增殖實驗結(jié)果表明，實驗組SW480和HCT116細(xì)胞EdU陽性率分別為44.9%和47.6%，明顯高于陰性對照組的19.3%和24.1%，提示DJ-1過表達(dá)可顯著促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖（圖3B、C，P＜0.05）。

2.4 DJ-1影響細(xì)胞周期

SW480、HCT116經(jīng)shDJ-1有效干擾片段轉(zhuǎn)染成功后，實驗組（shDJ-1）相比對照組（Vector），細(xì)胞多數(shù)停留在G1期，S期細(xì)胞減少，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖4）。

2.5 DJ-1可促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲、遷移

劃痕實驗中，相比于對照組（mock），實驗組（OE-DJ-1）顯著增強(qiáng)了結(jié)直腸癌細(xì)胞的愈合能力（P＜0.05，圖5A、B）。在transwell侵襲遷移實驗中，干擾片段（shDJ-1-1#；shDJ-1-2#）有效轉(zhuǎn)染后，實驗組細(xì)胞侵襲、遷移數(shù)顯著減少（P＜0.001，圖5C、D）。

2.6 DJ-1在結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移中的分子機(jī)制研究

Western blot、RTFQ-PCR實驗結(jié)果顯示，DJ-1可通過cyclin D1/p53-MDM2-AKT信號通路調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移（圖6）。

圖3 DJ-1在體外促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖Fig.3 DJ-1 promotes proliferation and invasion of colorectal cancer cells in vitro

圖4 流式細(xì)胞周期實驗檢測shDJ-1干擾片段對結(jié)直腸癌細(xì)胞周期的影響Fig.4 Flow cytometry was used to detect the effect of shDJ-1 interference fragment on colorectal cancer cell cycle

圖5 DJ-1可促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲、遷移Fig.5 DJ-1 promoted invasion and migration of colorectal cancer cells

圖6 DJ-1通過cyclin D1/p53-MDM2-AKT信號通路調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移Fig.6 DJ-1 regulates proliferation,invasion and metastasis of colorectal cancer cells via cyclin D1/p53-MDM2-AKT signaling pathway

3 討 論

結(jié)直腸癌是一種常見的癌癥，也是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一。近年來，盡管結(jié)直腸癌的綜合治療措施不斷發(fā)展完善，但是其總體預(yù)后不容樂觀，5年生存率仍不足50%［1］。主要原因是晚期腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的發(fā)生，一旦發(fā)生預(yù)后極差。因此，深入探索結(jié)直腸癌侵襲、轉(zhuǎn)移發(fā)生的分子機(jī)制，確立結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移防治靶點，尋求新的干預(yù)策略對臨床上防治結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移、提高晚期結(jié)直腸癌患者的臨床療效具有特殊的重要性和迫切性。

本研究發(fā)現(xiàn)，DJ-1在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)（蛋白水平及mRNA表達(dá)），且其表達(dá)與結(jié)直腸癌TNM分期、部位、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分化程度相關(guān)，提示DJ-1有望作為判斷結(jié)直腸癌預(yù)后的分子標(biāo)志物。深入研究發(fā)現(xiàn)，DJ-1體外實驗可增強(qiáng)結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。這些結(jié)果表明，DJ-1有助于結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展，但其具體的分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步的深入研究。

腫瘤細(xì)胞惡性增殖、遷移和侵入基底膜進(jìn)入周圍組織、血液和淋巴管的能力是癌癥的基本標(biāo)志之一，也是局部腫瘤進(jìn)展、轉(zhuǎn)移擴(kuò)散的先決條件［16］。為了深入研究DJ-1與結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移之間的關(guān)系及其分子機(jī)制，本研究通過Western blot預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)DJ-1可負(fù)性調(diào)控p53。p53作為一種經(jīng)典抑癌基因，在所有惡性腫瘤中，50%以上會出現(xiàn)p53突變［17］。由p53編碼的蛋白質(zhì)是一種轉(zhuǎn)錄因子，其控制著細(xì)胞周期的啟動，進(jìn)而通過復(fù)雜分子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡［18-19］。隨著近10年研究的深入，p53作為抑癌基因的功能逐漸被揭示出來。p53介導(dǎo)的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在調(diào)節(jié)細(xì)胞正常生命活動中起重要作用，它與細(xì)胞內(nèi)其他信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路間的聯(lián)系十分復(fù)雜，已知p53參與調(diào)控的基因逾160種［20］。本研究發(fā)現(xiàn)，DJ-1與p53基因存在相互作用關(guān)系，進(jìn)一步深入研究發(fā)現(xiàn)，p53作為上游分子并不能調(diào)控DJ-1的表達(dá)，但是我們發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480、HCT116中DJ-1可調(diào)控p53的表達(dá)，在OE-DJ-1、shDJ-1中均得到了驗證，其分子調(diào)控機(jī)制可能是通過DJ-1-p53-MDM2-AKT信號通路調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲遷移。本研究發(fā)現(xiàn)，p53并不直接調(diào)控MDM2、AKT的表達(dá)，而是影響p-MDM2、p-AKT的磷酸化，其具體的分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)，DJ-1調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖可能與cyclin D1相互作用有關(guān)。Cyclin D1，即G1/S-特異性cyclin D1，由人類CCND1基因編碼，其主要功能是促進(jìn)細(xì)胞增殖［21］。目前，cyclin D1基因已被公認(rèn)為是一種原癌基因，其過度表達(dá)可致細(xì)胞增殖失控而惡性化。本研究發(fā)現(xiàn)，DJ-1可影響cyclin D1蛋白的表達(dá)，且其調(diào)控關(guān)系為正向調(diào)控，DJ-1通過正向調(diào)控cyclin D1，影響凋亡蛋白Bax、Bcl-2的表達(dá)，從而促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的惡性增殖。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，DJ-1在結(jié)直腸癌中高表達(dá)，且與臨床病理學(xué)特征息息相關(guān)。因此，DJ-1有望作為分子標(biāo)志物用于判斷結(jié)直腸癌預(yù)后。針對DJ-1-cyclin D1/p53-MDM2-AKT信號途徑的靶向作用將為結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的防治提供新思路。