盆底器官脫垂疾病mRNA和lncRNA差異表達(dá)譜的綜合分析

張志磊, 趙 冰, 劉 靈，王君敏, 李林玉, 梁 肖, 王瑩瑩, 王肖帆, 喬艷華

1)鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦科 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室 鄭州 450001 3)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院科研部 河南新鄉(xiāng) 453000

盆底器官脫垂(pelvic organ prolapse,POP)是絕經(jīng)后子宮切除的重要原因，中老年女性發(fā)病率較高，給患者的心理和生理帶來了巨大的傷害[1-2]。研究[3]顯示，POP是具有特定遺傳傾向的個體在單個或多個獲得性因素的作用下導(dǎo)致的盆底支持組織退化、損傷而引發(fā)的一種退行性疾病。子宮旁韌帶群中膠原合成與分解的失衡、老化后的補充以及損傷后的修復(fù)障礙會破壞盆腔器官的支持結(jié)構(gòu)[4]。經(jīng)典Wnt信號通路的異?？捎绊懽訉m骶韌帶成纖維細(xì)胞增殖和功能[5]。陰道分娩、年齡、BMI和絕經(jīng)狀態(tài)是普遍認(rèn)同的POP影響因素[6-8]。但POP也可見于一些年輕未育女性，甚至是處女；絕大多數(shù)有過陰道分娩史甚至多產(chǎn)的婦女并不發(fā)生POP。POP的發(fā)病可能與基因水平的改變有關(guān)。本研究通過對POP患者子宮主韌帶中mRNA和lncRNA進(jìn)行高通量基因測序，Gene Ontology(GO)富集、KEGG信號通路分析、蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction，PPI)及mRNA-lncRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析，探索與POP發(fā)生發(fā)展有關(guān)的潛在生物標(biāo)志物和信號通路。

1 對象與方法

1.1研究對象選擇2017年10月至2018年12月在鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院接受陰式子宮切除手術(shù)的POP患者6例和同期因良性病變(子宮腺肌癥或子宮肌瘤)行子宮切除手術(shù)的非POP患者6例(對照組)。兩組患者滿足：年齡50～60歲，入院時已絕經(jīng)，孕產(chǎn)次3～4次，且均為足月產(chǎn)，胎兒非巨大兒、無異常產(chǎn)褥病史，無高血壓和糖尿病史，無性激素類藥物應(yīng)用史，術(shù)中無電刀等能量器械應(yīng)用，且術(shù)后病理證實均不合并惡性病變。POP組患者POP-Q分級均Ⅲ度以上。對照組患者均不合并POP。本研究已獲得患者本人知情同意并經(jīng)鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2標(biāo)本處理術(shù)中在無菌操作下留取患者子宮主韌帶(宮旁1 cm處)新鮮組織，0.5～1.0 cm3切塊，兩組各取3例標(biāo)本立即置液氮中保存以備高通量測序，另3例標(biāo)本放入體積分?jǐn)?shù)10%甲醛中固定以制備HE染色和Masson染色切片,以及進(jìn)行qRT-PCR和Western blot。

1.3RNA的提取、測序、差異基因的篩選及富集分析由上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司完成。使用mirVana miRNA分離試劑盒進(jìn)行RNA提取，在Illumina測序平臺(HiSeqTM2500)上進(jìn)行測序，使用Express軟件進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本定量，采用Fold Change(FC)值來衡量差異基因表達(dá)量的差異倍數(shù)，利用R包在P≤0.05、|log2FC|≥2條件下，篩選差異基因并進(jìn)行GO及KEGG富集分析。

1.4PPI分析STRING(https://string-db.org/cgi)是提供有關(guān)蛋白質(zhì)之間相互作用綜合信息的數(shù)據(jù)庫，基于網(wǎng)站默認(rèn)confidence≥0.4，對滿足|log2FC|≥5、容錯率(FDR)≤0.05的差異表達(dá)基因建立PPI。然后導(dǎo)入Cytoscape軟件可視化蛋白質(zhì)間相互作用。

1.5mRNA-lncRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析對差異表達(dá)mRNA和lncRNA的表達(dá)量進(jìn)行Pearson相關(guān)分析，用R包根據(jù)Pearson相關(guān)系數(shù)>0.8和P<0.05 的閾值產(chǎn)生節(jié)點(node)和關(guān)系線(edge)數(shù)據(jù)，最后采用Cytosacape軟件建立共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6采用qRT-PCR進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平驗證使用Trizol試劑從主韌帶組織中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，使用PCR試劑盒和實時PCR儀器進(jìn)行qRT-PCR分析。反應(yīng)體系:1 μL cDNA、5 μL 2×PCR Master Mix、0.2 μL上游引物、0.2 μL下游引物(引物序列見表1)和3.6 μL無核酸酶水。引物由上海生物醫(yī)學(xué)科技有限公司設(shè)計合成。反應(yīng)條件： 95 ℃預(yù)變性10 min;94 °C變性10 min，58 ℃退火20 s， 72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)。以ACTB基因作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt方法計算基因的相對表達(dá)量。

1.7采用Western blot進(jìn)行蛋白水平驗證使用裂解緩沖液從組織中提取總蛋白，用BCA試劑盒測

定蛋白濃度，然后用SDS-PAGE分離蛋白2 h，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，再用含50 g/L脫脂奶粉的TBST在37 ℃下浸泡封閉2 h。將兔抗人IL-6抗體(按1∶500稀釋)，兔抗人Nurr1抗體(按1∶500稀釋)和兔抗人β-actin抗體(按1∶1 000稀釋)添加到膜上，4 ℃孵育過夜。洗滌3次，加入山羊抗兔IgG二抗(按1∶1 000稀釋)37 ℃搖床孵育2 h，用ECL發(fā)光試劑盒檢測。以β-actin作為內(nèi)參蛋白，采用Image J 1.8.0軟件分析。以目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達(dá)水平。

表1 引物序列

1.8統(tǒng)計學(xué)處理采用Graphpad Prism 7分析數(shù)據(jù)及制作圖表，組間差異基因表達(dá)量的差異倍數(shù)用FC值表示。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1子宮主韌帶組織的形態(tài)學(xué)分析對照組子宮主韌帶組織中平滑肌束及膠原纖維束密集，排列整齊有序，且平滑肌細(xì)胞及成纖維細(xì)胞數(shù)量較多；而POP組子宮主韌帶組織中膠原纖維束和平滑肌束走向紊亂，且較纖細(xì)，多斷裂并伴玻璃樣變性(圖1)。

A和C：對照組；B和D：POP組

2.2差異表達(dá)mRNA和lncRNA的篩選得到差異表達(dá)的mRNA 794個(上調(diào)403個、下調(diào)391個)，lncRNA 1 106個(上調(diào)584個、下調(diào)522個)。差異基因表達(dá)水平聚類分析見圖2。

A：mRNA；B：lncRNA；紅色：表達(dá)量升高；藍(lán)色：表達(dá)量降低

2.3差異表達(dá)mRNA和lncRNA的富集分析

2.3.1 GO富集分析 GO富集分析結(jié)果顯示：差異表達(dá)的mRNA在1 863個GO條目中富集。從富集TOP30條目(圖3)可見，生物過程主要富集于核小體組裝(GO:0006334)和染色質(zhì)組織(GO:0006325)等，分子功能主要富集蛋白質(zhì)異二聚化活性(GO:0046982)和DNA聚合(GO:0003677)等，細(xì)胞成分主要定位于核小體(GO:0000786)和核染色質(zhì)(GO:0000790)等。使用TopGO軟件對富集條目繪制有向無環(huán)圖，結(jié)果顯示這些差異基因的功能通路最終指向核小體及染色質(zhì)的組裝，所涉及的基因有36個是組蛋白相關(guān)基因，其中有16個滿足FC>10，差異最顯著的是HIST1H3J(FC=18.47，P=0.003)。而差異表達(dá)的lncRNA則在881個GO條目中富集，在L-α-氨基酸跨膜轉(zhuǎn)運(GO:1902475)和中性氨基酸跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性(GO:0015175)這兩個條目富集最為顯著。

A：mRNA；B：lncRNA

2.3.2 KEGG富集分析 KEGG富集分析結(jié)果顯示：差異表達(dá)mRNA在77個KEGG通路中富集，在一級通路中主要富集于感染性、免疫性、內(nèi)分泌和代謝疾病通路中。從TOP20富集通路(圖4)可見，系統(tǒng)性紅斑狼瘡(has:05322)、Wnt信號通路(has:04310)和人T淋巴細(xì)胞病毒感染通路(has:05166)富集顯著。其中在Wnt通路中，主要富集于Wnt/β-Catenin通路。差異lncRNA則在51個KEGG通路中富集，主要涉及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、感染性疾病、免疫系統(tǒng)疾病等通路，這一分布和mRNA的富集情況一致。

A：mRNA的TOP20氣泡圖；B：lncRNA的富集通路分類圖

2.4PPI分析繪制的PPI包括152個節(jié)點和2 475個相互作用(圖5)。整個網(wǎng)絡(luò)由3個功能模塊組成：A模塊主要和轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因有關(guān)，B模塊主要和組蛋白基因有關(guān)，C模塊主要和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因有關(guān)。其中有數(shù)十個基因節(jié)點的連接度很高，連接度TOP10的核心基因見表2，連接最廣泛的是IL-6。

A:轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因；B：組蛋白基因；C：細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因；節(jié)點大小和連接度有關(guān)；紅色表示上調(diào)基因，綠色表示下調(diào)基因，黃色描邊標(biāo)記的節(jié)點是TOP10核心差異基因

圖5PPI 分析圖

表2 連接度TOP10核心基因

2.5mRNA-lncRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析從共表達(dá)關(guān)系網(wǎng)絡(luò)(圖6)中發(fā)現(xiàn)lnc-ZNF727-12∶2與PPI網(wǎng)絡(luò)中核心基因IL-6和下調(diào)顯著的NR4A2均有共表達(dá)關(guān)系。

2.6部分差異基因的qRT-PCR和Western blot驗證選取8個差異表達(dá)的mRNA通過qRT-PCR進(jìn)一步驗證，其中上調(diào)和下調(diào)的基因均為4個，所有被選的mRNA均與轉(zhuǎn)錄組測序表達(dá)量具有相同的表達(dá)趨勢。由于IL-6是連接度最高的核心基因，且是下調(diào)幅度最為明顯的基因，而NR4A2是Wnt通路中的核受體基因并同樣差異表達(dá)顯著，且和IL-6均與lnc-ZNF727-12∶2有共表達(dá)關(guān)系，故對IL-6和NR4A2進(jìn)行Western blot驗證，結(jié)果顯示POP患者中這兩個蛋白的表達(dá)水平均較對照組明顯降低，與基因測序結(jié)果一致。

箭頭節(jié)點表示lncRNA，圓形節(jié)點表示mRNA，紅色字體表示表達(dá)上調(diào)，藍(lán)色字體表示表達(dá)下調(diào)，黑色字體表示無統(tǒng)計學(xué)意義

3 討論

子宮主韌帶組織結(jié)構(gòu)和功能的破壞是影響POP發(fā)生發(fā)展的重要因素[9]。本研究通過對子宮主韌帶組織轉(zhuǎn)錄組高通量測序，共篩選出794個差異表達(dá)顯著的mRNA和1 106個lncRNA，通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)它們的功能主要集中于組蛋白和核小體的裝配、細(xì)胞的生成與死亡等方面，并通過Wnt/β-cantenin途徑、細(xì)胞周期途徑、組蛋白及轉(zhuǎn)錄調(diào)控途徑，進(jìn)一步影響韌帶中成纖維細(xì)胞增殖與死亡的平衡以及膠原的代謝。

3.1Wnt/β-cantenin信號通路和細(xì)胞周期通路通過對差異基因的KEGG通路分析，作者發(fā)現(xiàn)有12個差異表達(dá)的基因在Wnt/β-cantenin途徑富集，如FZD5、AXIN2、SOX17、MYC、JUN、FOSL1、CCND1、MMP7等。Wnt/β-Catenin信號通路可傳導(dǎo)生長刺激信號，參與不同的發(fā)育機制，如影響細(xì)胞分化以及決定細(xì)胞的增殖等[10]。研究發(fā)現(xiàn)，膜受體FZD5可抑制下游胞質(zhì)中AXIN2表達(dá)[11]，而SOX17通過與AXIN2結(jié)合形成共調(diào)節(jié)因子[12]，在轉(zhuǎn)錄水平反向抑制Wnt/β-cantenin通路中下游核心差異基因MYC的表達(dá)[13]，進(jìn)而導(dǎo)致核內(nèi)靶基因FOSL1、MMP7等多個重要轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)抑制。MMP家族主要負(fù)責(zé)膠原纖維的代謝[14]，F(xiàn)OSL1可與JUN蛋白二聚化形成轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物AP-1，而AP-1已顯示是多種MMP的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑[14]。上述改變會進(jìn)一步抑制細(xì)胞周期通路中細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白RGCC的表達(dá)。KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)有17個差異表達(dá)的mRNA富集于細(xì)胞周期通路：如CDK1、CDKN1A、PLK1、CDC20、CDC45、TTK、CCNA2、CCNB2等。下調(diào)的RGCC在體內(nèi)會關(guān)聯(lián)并激活細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)，進(jìn)而影響G2/M轉(zhuǎn)變[15]。PLK1是真核細(xì)胞周期中的關(guān)鍵參與者，介導(dǎo)真核生物的磷酸化調(diào)節(jié)，如G2/M轉(zhuǎn)換、有絲分裂和胞質(zhì)分裂等細(xì)胞周期進(jìn)程[16-17]。本研究發(fā)現(xiàn)POP患者子宮主韌帶組織中PLK1明顯上調(diào)，提示G2/M轉(zhuǎn)換異常。另外，表達(dá)顯著下調(diào)的核心基因MYC是細(xì)胞周期特異性關(guān)鍵酶CDK-1的正調(diào)節(jié)劑，影響成纖維細(xì)胞的增殖活性及膠原的生物合成過程。POP患者宮旁韌帶成纖維細(xì)胞中經(jīng)典Wnt/β-Catenin信號傳導(dǎo)通路受到抑制，可進(jìn)一步級聯(lián)影響細(xì)胞周期通路，進(jìn)而降低成纖維細(xì)胞的增殖及合成膠原蛋白的能力[5]。

3.2組蛋白相關(guān)基因?qū)D(zhuǎn)錄調(diào)控的影響組蛋白基因表達(dá)上調(diào)是進(jìn)入細(xì)胞周期階段的標(biāo)志之一[18-19]。本研究中有大量組蛋白家族mRNA表達(dá)明顯上調(diào)。越來越多的實驗[20]證實組蛋白N′端的堿基容易在翻譯后被不同的基團修飾，從而具備調(diào)控基因表達(dá)的功能，H3組蛋白的磷酸化修飾在G2晚期出現(xiàn)，M期開始增加，H2A和H2B組蛋白的泛素化在M期開始減少。本研究分析了目前36個差異表達(dá)的組蛋白相關(guān)基因的改變，亦提示細(xì)胞周期G2/M轉(zhuǎn)化異常。結(jié)合差異基因表達(dá)PPI分析圖，組蛋白相關(guān)基因和細(xì)胞周期調(diào)控基因的異常表達(dá)可能共同引起子宮主韌帶中成纖維細(xì)胞周期阻滯，進(jìn)而影響韌帶損傷后的自我修復(fù)和正常衰老細(xì)胞的補充。綜上，作者推測組蛋白基因的高表達(dá)和細(xì)胞周期紊亂是促成POP發(fā)病的重要原因。

3.3IL-6與PPI和mRNA-lncRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)本研究結(jié)果顯示共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中ZNF727-12∶2與IL-6和NR4A2有共表達(dá)關(guān)系，IL-6位于PPI的核心。IL-6是重要的多功能細(xì)胞因子，廣泛參與炎癥、免疫、細(xì)胞增殖與活化等生理病理過程[21]。結(jié)合KEGG富集分析結(jié)果顯示，在人體器官系統(tǒng)通路類別中差異基因富集度最高的是免疫系統(tǒng)，作者考慮POP患者IL-6轉(zhuǎn)錄水平的抑制可能與局部微環(huán)境的免疫力降低有關(guān)。另外，結(jié)合對差異基因的GO富集分析提示，IL-6也參與膠原合成的調(diào)節(jié)和膠原代謝調(diào)節(jié)，IL-6表達(dá)水平的降低可影響局部組織的膠原合成代謝。NR4A2是核受體家族中重要一員，可被多種細(xì)胞外刺激因素激活而廣泛參與調(diào)控生物的代謝、免疫以及細(xì)胞的生長、分化、凋亡等重要生理病理過程，其功能同時也受到磷酸化、蛋白質(zhì)相互作用等多種途徑的調(diào)控[22]。有研究[23]提示NR4A家族與Wnt/β-Catenin信號通路之間有明確的相互作用，如NR4A2可以抑制β-catenin介導(dǎo)的Axin2的表達(dá)。作者在PPI分析圖中發(fā)現(xiàn)該家族中三種受體均在轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮廣泛作用。綜上，作者推測在某些易感因素的刺激下(如分娩、感染等)，ZNF727-12∶2調(diào)控序列被激活，他們可能參與抑制了包括IL-6與NR4A2等核心基因的表達(dá)，進(jìn)而影響轉(zhuǎn)錄因子和組蛋白的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)以及Wnt/β-catenin信號通路，導(dǎo)致主韌帶中成纖維細(xì)胞的增殖及補充障礙[5]。

總之，POP的發(fā)生發(fā)展與多基因的改變有關(guān)，包括轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子(如IL-6、MYC、ATF3等)、Wnt/β-cantenin通路相關(guān)基因(如FZD5、AXIN2、MMP7等)、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因(如CDK1、CCNB1等)以及組蛋白調(diào)控相關(guān)基因(如CENPA、ASF1B等)，這些基因在PPI中相互作用，尤其是位于網(wǎng)絡(luò)核心的IL-6及與其共表達(dá)的ZNF727-12∶2在整個差異表達(dá)譜中的作用不可忽視。但是，由于術(shù)中電刀、超聲刀等能量器械的廣泛應(yīng)用會對樣本造成破壞，導(dǎo)致臨床中完全符合高通量測序要求的標(biāo)本較少，今后的實驗中我們將加大樣本量進(jìn)一步驗證，也期待后續(xù)研究通過大樣本量的生物信息挖掘得到整合結(jié)論，促進(jìn)在基因?qū)用鎸OP的認(rèn)識。

致謝：真誠感謝上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司工作人員的技術(shù)支持及課題組其他成員的熱心幫助。