固定化蔗糖酶降解大蒜渣多糖的工藝研究

王慧慧 任茂生 李維靜

摘要? ? 優(yōu)化固定化蔗糖酶降解大蒜渣多糖的工藝條件，研究了pH值、溫度和流速對酶活性的影響，并進行了正交試驗。然后研究不同使用次數(shù)后固定化蔗糖酶的活性，測定了酶解前后多糖的相對分子質(zhì)量。結(jié)果表明，固定化提高了蔗糖酶的穩(wěn)定性和利用率，反應(yīng)的最適pH值、溫度和流速分別為5.0、50 ℃和0.5 mL/min。正交試驗結(jié)果表明，在pH值5.0、溫度60 ℃和流速0.5 mL/min的條件下，固定化酶的催化活力最大，降解后的低聚果糖相對分子質(zhì)量約為5 000 Da。

關(guān)鍵詞? ? 固定化;大蒜渣;蔗糖酶;降解

中圖分類號? ? TS219? ? ? ? 文獻標識碼? ? A? ? ? ? 文章編號? ?1007-5739（2019）01-0219-03

Abstract? ? To optimize the technological conditions of the garlic dreg polysaccharide degradation by immobilized sucrase.The effects of pH value，temperature and flow rate on the activities of immobilized sucrase were studied，and the orthogonal experiment was executed.The activities of the immobilized sucrases with the different usage number were compared，and the relative molecular weights of the garlic dreg polysaccharides were measured before and after degradation.The immobilization increased the stability and efficiency of sucrose，and the optimal reaction pH value，temperature and flow rate were 5.0，50 ℃ and 0.5 mL/min，respectively.The orthogonal experiment showed that the activity of immobilized sucrose was the highest at pH 5.0，60 ℃ and 0.5 mL/min.The relative molecular weight of the degraded fructo-oligosaccharide was about 5 000 Da.

Key words? ? immobilization;garlic dreg;sucrase;degradation

大蒜渣是大蒜精油加工過程中形成的主要廢棄物，由于其含有較多的硫化物，具有較濃烈的刺激性臭味，若不及時處理將會造成嚴重的環(huán)境污染[1]。事實上，蒜渣中含有多種活性物質(zhì)，如大蒜素、氨基酸、維生素、蛋白質(zhì)、碳水化合物和微量元素[2]。目前，大蒜渣中多酚[3]、氨基酸[4]和活性肽[5]的提取制備已受到研究者的關(guān)注。同時大蒜渣作為一種功能性飼料，可以促進異育鯽魚的生長，增強動物體內(nèi)消化酶的活性，提高免疫力[6]。大蒜渣的深度開發(fā)不僅可以增加大蒜資源的綜合利用率，而且可以解決其對環(huán)境的污染問題，具有重要的經(jīng)濟和生態(tài)研究意義。

大蒜渣的干物質(zhì)主要由碳水化合物組成，其中含有大量的果聚糖及少量的中性糖。研究發(fā)現(xiàn)，大蒜果聚糖中果糖與葡萄糖的比例約為15∶1，是制備高果糖漿的理想原料[7]。此外，大分子量的果聚糖可被降解成為聚合度（DP）較低的低聚果糖（DP=2～5），其具有改善人體腸道菌群、降血脂、提高人體免疫力和促進礦物元素吸收的功效[8]。多糖的降解方法很多，如酸堿法、超聲波法和酶法等，其中酶法由于反應(yīng)條件溫和、特異性強，被廣泛地應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。果聚糖的降解酶包括蔗糖酶和菊粉酶[9]，其中蔗糖酶（β-D-呋喃果糖苷果糖水解酶，EC3.2.1.26），又稱轉(zhuǎn)化酶，能特異性地催化非還原糖中的α-呋喃果糖苷鍵，將蔗糖轉(zhuǎn)化成糖漿。黃? 菁等[10]比較了2種不同蔗糖酶酶解大蒜渣制備果葡糖漿的工藝條件，研究發(fā)現(xiàn)，12 h后蔗糖酶的水解率可達80%。在工業(yè)生產(chǎn)中，常常利用載體對酶制劑進行固定，固定化不僅可以提高酶制劑的催化活性和穩(wěn)定性，同時可以反復(fù)利用，極大地節(jié)約生產(chǎn)成本。本文以固定化的蔗糖酶為對象，主要對固定化蔗糖酶催化降解大蒜果聚糖的工藝條件進行初步研究，以期為大蒜深加工提供一種可行性思路。

1? ? 材料與方法

1.1? ? 試驗材料

1.1.1? ? 材料和試劑。蔗糖酶購自裕立寶生物公司;葡聚糖凝膠G-200購于源葉生物有限公司;不同分子量的葡聚糖（5.0、25.0、80.0、150.0 kDa）購于Sigma公司;醋酸、無水乙醇、海藻酸鈣、葡萄糖、苯酚、硫酸均為分析純。大蒜籽購于超市。

1.1.2? ? 主要設(shè)備。真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、高速離心機、紫外-可見分光光度計、蠕動泵、部分收集器。

1.2? ? 試驗方法

1.2.1? ? 大蒜渣多糖的制備。市售的大蒜籽剝皮清洗干凈，組織勻漿機粉碎，紗布過濾后得蒜渣，60 ℃鼓風干燥，備用。稱取一定量蒜渣，按料液比1∶20（g/mL）加入正己烷，浸泡脫脂12 h。脫脂后的蒜渣干燥后，按料液比1：50（g/mL）加入去離子水，在80 ℃條件下攪拌提取2 h，重復(fù)1次。紗布（8層）過濾后得提取液，用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至一定體積，5 000 r/min離心10 min，取上清液。向上清液中加入4倍體積的無水乙醇，4 ℃下醇沉過夜。去除上清液，5 000 r/min離心10 min，得沉淀物。用適量去離子水溶解沉淀，Sevag法脫除蛋白3次[11]。適當濃縮，冷凍干燥后得大蒜多糖。

1.2.2? ? 蔗糖酶的固定化。蔗糖酶的固定方法很多，如吸附法、包埋法[15]。在固定過程中，固定介質(zhì)和工藝對酶的活力影響很大。筆者比較了多種固定方法，發(fā)現(xiàn)陳? 雄等的方法可以得到類似于球型的顆粒，且固定化酶的活力回收率較高，達到78.3%，是一種較理想的蔗糖酶固定方法。因此，蔗糖酶的固定方法參照陳? 雄等[12]的方法。取10 g固定化蔗糖酶與1.5%（質(zhì)量體積比）蔗糖溶液按1∶10（質(zhì)量比，pH值5.5）混合，40 ℃下均勻攪拌反應(yīng)10 min，5 000 r/min離心10 min后取上清液，利用DNS法測定還原糖的量[13]。取與固定化蔗糖酶顆粒等量的游離蔗糖酶，與上述相同質(zhì)量的蔗糖溶液混合，40 ℃下均勻攪拌反應(yīng)10 min，DNS法測定還原糖含量。

酶活單位定義：10 g固定化酶1 min催化生成1 μmol還原糖定義為1個酶活單位。固定化蔗糖酶的活力回收率（%）=固定化酶總活力/游離酶總活力×100。

1.2.3? ? 固定化蔗糖酶的穩(wěn)定性。利用pH 5.0的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液配制200 mL 2.0%（質(zhì)量百分比）的大蒜渣多糖溶液，以1.0 mL/min的流速流經(jīng)裝有10 g固定化蔗糖酶的層析柱，12 h后測定底物溶液的還原糖含量，計算酶的活力。用醋酸-醋酸鈉緩沖液沖洗層析柱后，重復(fù)使用固定化蔗糖酶進行多糖降解，測定不同使用批次中固定化蔗糖酶的相對活力。

1.2.4? ? 多糖的相對分子量。采用葡聚糖凝膠G-200凝膠排阻法測定大蒜多糖的相對分子質(zhì)量。層析柱（1.2 cm×70.0 cm）中的凝膠高度為50 cm，多糖樣品的濃度為1.0%，上樣量2.0 mL，用0.05% NaCl水溶液以0.2 mL/min的速率洗脫，部分收集器以每支試管10 min的速率進行收集。采用苯酚-硫酸法測定試管中的總糖含量[14]，繪制色譜圖。

在相同條件下測定不同分子量葡聚糖的出峰時間，對樣品的分子量進行估算。

1.2.5? ? 酶催化條件的優(yōu)化。①pH值。稱取10 g固定化蔗糖酶，置于層析柱（1.5 cm×40 cm）中，備用。利用pH值分別為3.0、4.0、5.0和6.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液配制200 mL 2.0%（質(zhì)量百分比）大蒜渣多糖溶液，充分溶解后置于40 ℃水浴中1 h，用蠕動泵將溶液以1.0 mL/min的速度循環(huán)流經(jīng)層析柱，酶解反應(yīng)12 h。以煮沸后的酶液作對照，利用DNS法測定底物中還原糖的增量，計算出固定化酶的活力。②溫度。配制濃度為2.0%、pH值4.0的多糖溶液，分別置于30、35、40、45、50、55、60 ℃水浴中，以1.0 mL/min的流速循環(huán)流經(jīng)層析柱，酶解反應(yīng)12 h。利用DNS法測定不同溫度反應(yīng)后底物中還原糖的增量，并計算出固定化酶的活力。③流速。配制濃度為2%、pH值4.0的多糖溶液，置于40 ℃水浴中1 h，分別以0.5、1.0、2.0、5.0 mL/min的流速循環(huán)流經(jīng)層析柱，酶解反應(yīng)12 h。利用DNS法測定不同流速下底物中還原糖的增量，計算出固定化酶的活力。④正交試驗。采用L9（34）正交試驗對固定化酶降解大蒜渣果聚糖的工藝條件進行優(yōu)化，正交試驗因素與水平見表1。

2? ? 結(jié)果與分析

2.1? ? 固定化蔗糖酶的穩(wěn)定性

由圖1可見，固定后的蔗糖酶顆?？梢苑磸?fù)使用，且可以保持一定的活力。當使用次數(shù)小于6次，酶的催化活力可達最初活力的50%以上。但當使用次數(shù)高于5次，酶的催化活性急劇下降。這可能是由于長時間儲藏導(dǎo)致酶活性的下降，或者是底物流經(jīng)固定酶時間過長導(dǎo)致酶制劑從載體上脫離流失造成的。

2.2? ? 果聚糖的分子量測定

凝膠排阻法是測定大分子相對分子質(zhì)量的一種常見方法，主要依據(jù)不同物質(zhì)在固定相中流經(jīng)距離的差異進行分子量的測算。小分子物質(zhì)流經(jīng)的距離長，出峰時間越大;反之，大分子的出峰時間較短。

如圖2所示，降解前大蒜多糖的出峰時間約為200 min，根據(jù)標準品的出峰時間測算，其相對分子質(zhì)量約在600 kDa以上;降解后的多糖在750 min處出現(xiàn)了一個新峰，根據(jù)標準品的出峰時間測算出其相對分子質(zhì)量約為5 000 Da。該結(jié)果進一步證明了固定化蔗糖酶對大蒜渣果聚糖的降解作用。

2.3? ? 固定化蔗糖酶的催化反應(yīng)條件

2.3.1? ? pH值。酶促反應(yīng)體系的pH值與酶的催化中心結(jié)構(gòu)有密切的聯(lián)系，合適的pH值可以促進酶與底物的結(jié)合，從而提高酶的活力。研究比較了不同pH值條件下固定化蔗糖酶的催化活力，結(jié)果如圖3所示，當pH值在3～5的范圍內(nèi)，固定化蔗糖酶的催化活性隨著pH值的升高而增大;當pH 值進一步增大時，酶的活力開始急劇下降，說明蔗糖酶在偏酸性條件下具有較高的活性。

2.3.2? ? 溫度。在酶催化過程中，反應(yīng)體系的溫度可以增大底物的熱運動，增加底物與酶催化活性中心的結(jié)合幾率。然而，溫度過高時又會造成酶的失活。由圖4可見，當溫度介于40～55 ℃時，固定化蔗糖酶的活性一直處于一個較高的水平。這可能是由于固定化后酶的結(jié)構(gòu)受到介質(zhì)的空間束縛，當溫度變高時，底物的熱運動增強，而酶的結(jié)構(gòu)變化不大，所以酶活性處于較高水平。

2.3.3? ? 流速。與游離酶相比，固定化酶的運動受到了極大的限制。本試驗采用填充柱反應(yīng)器進行多糖的酶降解反應(yīng)，通過底物的流動增大其與酶的碰撞幾率。研究發(fā)現(xiàn)，流速小于2.0 mL/min時，酶的催化水平較高;但是當流速進一步增大時，固定蔗糖酶的降解活性顯著下降。這一現(xiàn)象可能是由于流速過快導(dǎo)致底物無法與酶催化活性中心穩(wěn)定結(jié)合造成的（圖5）。

2.3.4? ? 正交試驗。利用正交試驗對固定化蔗糖酶催化條件進行了優(yōu)化，極差分析結(jié)果表明，各因素對固定化蔗糖酶活力影響的主次順序為pH值>流速>溫度，最佳的酶解條件為 pH值5.0、溫度60 ℃和流速0.5 mL/min（表2）。

方差分析結(jié)果表明，反應(yīng)體系的pH值是影響固定化蔗糖酶催化活性的主要因素，且對酶活性有顯著性影響。

3? ? 結(jié)論

大蒜渣中含有大量的果聚糖，利用固定化酶對其進行降解，制備成低聚果糖可以提高大蒜加工產(chǎn)品的附加值，同時解決了大蒜渣造成的環(huán)境污染問題。本試驗以固定化蔗糖酶為對象，主要研究了其降解大蒜渣多糖的工藝條件以及固定化酶的穩(wěn)定性。單因素結(jié)果表明，降解的最適pH值為5.0，溫度為50 ℃，流速為0.5 mL/min。正交試驗顯示在pH值5.0、60 ℃和0.5 mL/min條件下，固定化蔗糖酶的活力達到132 U/100 g，其中反應(yīng)體系的pH值對固定化蔗糖酶的活性影響顯著。葡聚糖凝膠排阻試驗結(jié)果表明，固定化的蔗糖酶可將相對分子質(zhì)量較大的大蒜渣多糖降解成相對分子質(zhì)量約5 000 Da的小分子碳水化合物。此外，固定化蔗糖酶可以反復(fù)使用，但是當使用次數(shù)大于5次后，酶的活力開始急劇下降。因此，進一步優(yōu)化固定化方法，提高酶的穩(wěn)定性將是后面亟待解決的問題。

4? ? 參考文獻

[1] 李瑜，宋會歌.蒜渣干燥動力學研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學，2010（2）：285.

[2] 許春萱，魏金風，魏紅光.大蒜精油提取后廢棄蒜渣綜合利用的研究[J].環(huán)境科學與技術(shù)，2001（6）：42-44.

[3] 李浩，賀幫亮，洪松，等.大蒜渣中多酚物質(zhì)的提取研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2014，42（30）：10669-10672.

[4] 劉偉林，許良萍，袁巧萍，等.大蒜渣中混合氨基酸的提取工藝研究[J].現(xiàn)代食品科技，2006，22（2）：181-182.

[5] 丁青芝，阮康，騰騰，等.大蒜渣ACEI活性肽的制備及其穩(wěn)定性研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2012，23（1）：87-90.

[6]呂富，黃金田，丁研，等.大蒜渣對異育銀鯽生長消化酶活性及免疫功能的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2012，40（26）：12928-12930.

[7] 索慧.大蒜果聚糖的一級結(jié)構(gòu)研究[D].廣州：暨南大學，2010：9-10.

[8] 張麗君.低聚果糖檢測分析方法對比及優(yōu)劣性分析[J].食品工業(yè)科技，2015，36（23）：395-399.

[9] 張寧，吳潔瑜，黃菁，等.發(fā)酵菊粉酶酶解大蒜渣的工藝研究[J].食品科技，2012，37（1）：110-114.

[10] 黃菁，張寧，張永韜，等.酶解大蒜渣制備果葡糖漿[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2010，36（12）：89-93.

[11] STAUB A.Removal of protein：Sevag method[J].Methods Carbohydrate Chemisty，1965，5：5-6.

[12] 陳雄，王金華.固定化蔗糖酶的研究[J].中國釀造，2006，25（12）：27.

[13] 廖祥兵，陳曉明，肖偉，等.DNS法定量測定還原糖的波長選擇[J].中國農(nóng)學通報，2017，33（15）：144-149.

[14] DUBOIS M，GILLES K A，HAMILTON J K，et al.Colorimetric method for determination of sugars and related substances[J].Analytical Chemi-stry，1956，28（3）：350-356.

[15] 杜泓璇，楊德芳，羊芹，等.蔗糖酶的固定化及其條件的優(yōu)化[J].西南大學學報，2009，31（4）：89-93.