編織型絲素纖維人工韌帶及其體外降解性能研究

吳佳蔚，劉明潔，王璐，關(guān)國平

東華大學(xué)紡織學(xué)院，紡織面料技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(上海, 201620)

0 引言

韌帶是一種致密的結(jié)締組織纖維束或膜， 用以連接關(guān)節(jié)處的骨或軟骨， 主要由I型膠原組成， 還有少量的III型膠原[4]。韌帶損傷是一種常見及高發(fā)疾病， 韌帶常由于非生理性的受力活動(dòng)而造成不同程度的斷裂或缺損。當(dāng)韌帶受損較嚴(yán)重， 無法通過自身能力修復(fù)時(shí)， 就需要韌帶移植。常用的韌帶移植物有自體移植物、 同種異體移植物和人工韌帶材料。自體和同種異體移植物雖然取材方便， 尺寸和相容性好， 但存在供體不足， 并發(fā)癥， 疾病傳播風(fēng)險(xiǎn)， 質(zhì)量不穩(wěn)定等諸多不足。

人工韌帶的出現(xiàn)， 為韌帶移植帶來了新選擇。臨床上曾經(jīng)使用較為廣泛的人工韌帶是以聚酯材料為基礎(chǔ)的LARS(Ligament Advanced Reinforcement System)韌帶[12， 1]。然而， 由于聚酯材料的不可降解性及生物學(xué)惰性， LARS人工韌帶并不具備可降解性、 骨傳導(dǎo)性和骨誘導(dǎo)性， 中長期效果并不理想， 臨床應(yīng)用越來越少。因此， 開發(fā)高強(qiáng)度、 可降解、 能幫助人體自身韌帶再生的人工韌帶產(chǎn)品， 目前是該領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。

絲素纖維來源于天然蠶絲， 生物相容性好， 生物可降解， 力學(xué)性能優(yōu)良。絲素纖維編織縫合線應(yīng)用臨床已有近百年的歷史。因此， 絲素纖維是編織人工韌帶最有前景的原材料之一。本研究設(shè)計(jì)并制備了一種編織基絲素纖維人工韌帶材料， 對其在PBS和酶溶液條件下的體外降解性能進(jìn)行了研究， 以期能為最終開發(fā)理想的高強(qiáng)度、 可降解人工韌帶產(chǎn)品提供參考。

1 材料與方法

1.1 絲素纖維人工韌帶制備

在12錠編織機(jī)上， 運(yùn)用逐級編織的方法獲得絲素纖維人工韌帶(圖1)。首先， 用2根股線合股得到1根復(fù)絲， 運(yùn)用復(fù)絲進(jìn)行編織得到一束編織紗。用0.5%的Na2NO3溶液對編織紗脫膠三次， 每次30 min， 脫膠溫度95 ℃[7，21]。隨后， 將脫膠好的編織紗用12錠編織機(jī)繼續(xù)編織， 得到絲素纖維人工韌帶(silk fibroin fiber artificial ligaments, SFALs)材料。

圖1 絲素纖維人工韌帶材料制備流程圖Fig.1 Schematic drawing of the preparation process of the silk fibroin fiber artificial ligaments (SFALs)

1.2 絲素纖維人工韌帶材料的PBS降解

所有SFAL樣品經(jīng)環(huán)氧乙烷滅菌備用。配制pH=7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)為基本降解液， 高壓蒸汽滅菌后備用。其他材料和工具經(jīng)紫外線照射滅菌。所有操作均在超凈工作臺中完成。將4根樣品(每根長5 cm)及40 mL PBS放入50 mL的離心管中， 在37 ℃、 60 rpm的振蕩恒溫箱中孵育。每7天更換一次PBS， 換液時(shí)測定降解后PBS的pH值。分別在降解不同的時(shí)間點(diǎn)后取出樣品， 每次取出4根。用去離子水沖洗3次， 濾紙吸干表面水分后， 放入培養(yǎng)皿中于-20 ℃冰箱保存。待所有試樣取出后， 冷凍干燥后備用。

1.3 絲素纖維人工韌帶材料的酶降解

本研究選擇蛋白酶XIV(Protease type XIV Bacterial From Strepto,Sigma)來降解SFAL[17，3]。酶降解液是指含1 mg/mL蛋白酶XIV的PBS溶液， 過濾滅菌， 即配即用。除酶降解液外， 試樣、 試劑、 材料滅菌及其他處理方法同上。

1.4 表征

1.4.1 掃描電鏡(SEM)

取SFAL樣品中段， 用導(dǎo)電膠固定在電鏡臺上并噴金處理。使用TM 3000型掃描電子顯微鏡觀察。加速電壓為10 kV。

1.4.2 質(zhì)量損失

樣品干燥后置于恒溫恒濕環(huán)境下24 h， 稱量降解前后的樣品質(zhì)量， 計(jì)算質(zhì)量損失率：

其中，w1是指降解后樣品質(zhì)量(mg)，w0是指樣品初始質(zhì)量(mg)。

1.4.3 降解液變化

在PBS和酶降解過程中， 隨時(shí)觀察降解液的變化， 并測降解后溶液的pH值。

1.4.4 力學(xué)性能

對PBS和酶降解后的試樣分別進(jìn)行軸向拉伸性能測試， 每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的樣品重復(fù)測試3次。測試參數(shù)如下： 隔距為20 mm， 拉伸速度為24 mm/min， 預(yù)加張力為0.5 N， 松式夾持。

2 結(jié)果與討論

2.1 SFAL表面形貌

不同降解條件下、 不同降解天數(shù)的SFAL樣品實(shí)物照片和掃描電鏡圖如圖2所示。從圖2可看到兩種樣品表面形貌和結(jié)構(gòu)存在差異。在1 mg/mL蛋白酶溶液中降解21天， SFAL表面開始出現(xiàn)少數(shù)纖維的斷裂。到第42天時(shí)， 斷裂的纖維數(shù)量增加。到第70天時(shí)， 表層大多數(shù)纖維均有斷裂， 且在單根纖維上可見多處酶蝕痕跡。表層結(jié)構(gòu)大體破壞， 但纖維束的整體結(jié)構(gòu)基本保持完整。而經(jīng)PBS降解的SFAL樣品， 直到第70天， 都未見纖維的斷裂及整體結(jié)構(gòu)的破壞。

圖2 SFAL樣品在不同降解條件及降解天數(shù)下的SEM圖片F(xiàn)ig.2 SEM micrographs of SFAL samples under distinct degradation conditions over time

2.2 質(zhì)量損失

SFAL樣品在兩種不同降解條件下的質(zhì)量損失情況如表1所示。可以看到， 蛋白酶XIV降解7天的時(shí)候， SFAL的質(zhì)量沒有出現(xiàn)明顯的變化， 質(zhì)量損失率為1.0 %。在第14天時(shí)， SFAL的質(zhì)量損失率上升到4.4%。隨著降解時(shí)間的增加， 在第70天時(shí)質(zhì)量損失率為18.4%。這是PBS降解70天時(shí)質(zhì)量損失率(1.4%)的13倍。同時(shí)， 使用臺式測厚儀測量初始和降解70天時(shí)SFAL樣品的直徑發(fā)現(xiàn)， 蛋白酶XIV降解的SFAL直徑從(3.133±0.159) mm下降到(2.449±0.173) mm， 下降了約21.8%。

表1 SFAL樣品在不同降解條件下的質(zhì)量損失率(%)Tab.1 Mass loss rate of SFAL samples under different degradation conditions

2.3 降解液變化

新鮮的PBS和降解后的PBS均是無色透明的， 肉眼未見明顯變化。但在PBS降解70天后， PBS中有極微量的顆粒物。結(jié)合SEM結(jié)果分析， 由于SFAL中部的顯微圖片并未觀察到纖維降解跡象， 因此這些碎屑可能來自于纖維端部。新鮮的酶降解液呈淡黃色， 降解后溶液變渾濁。從第7天開始， 降解后酶溶液中便有絮狀物存在， 且自21天開始絮狀物逐漸增多， 如圖3所示。

圖3 新鮮降解液與降解后溶液照片F(xiàn)ig.3 Gross view of the fresh solutions and the degraded solutions

絲素纖維的降解產(chǎn)物主要是肽鏈或氨基酸。有文獻(xiàn)表明， 蛋白酶產(chǎn)生的降解產(chǎn)物中游離氨基酸的比例超過了總降解產(chǎn)物的50%， 主要包括天冬氨酸、 蘇氨酸、 絲氨酸、 甘氨酸、 纈氨酸、 丙氨酸、 半胱氨酸、 異亮氨酸、 酪氨酸和苯丙氨酸， 這些游離氨基酸會使溶液呈弱酸性[11]。本研究中， 降解液的pH變化如圖4所示。降解后PBS的pH值基本保持穩(wěn)定， 在pH7.3上下浮動(dòng)， 這也說明在PBS條件下絲素纖維保持穩(wěn)定、 降解緩慢， 到70天時(shí)仍未出現(xiàn)明顯降解。而在蛋白酶作用下， 21天后溶液pH下降至6.7左右， 隨后pH基本保持在6.6 - 6.8之間， 這可能是由于酶加速降解產(chǎn)生游離氨基酸， 使降解后酶溶液pH略有下降， 呈弱酸性。

圖4 降解液pH值變化Fig.4 pH Changes of the degraded solutions

2.4 力學(xué)性能

PBS條件下的SFAL樣品的最大斷裂強(qiáng)力沒有明顯變化， 基本保持在240 N左右。而酶降解液降解后的SFAL的最大斷裂強(qiáng)力明顯下降， 由第1天的(228±29) N下降到第70天時(shí)的(111±8) N， 下降了約50%(見圖5)， 說明酶降解對絲素纖維力學(xué)性能的影響很大。同時(shí)， 對酶降解曲線做方程擬合可以發(fā)現(xiàn)， 最大斷裂強(qiáng)力隨時(shí)間呈指數(shù)下降(R2=0.89)， 也符合之前學(xué)者的相關(guān)研究結(jié)果[17]。

圖5 不同降解條件下SFAL樣品最大斷裂強(qiáng)力的變化Fig.5 The ultimate tensile force of the SFAL samples under distinct degradation conditions over time

2.5 討論

酶在絲素蛋白纖維的降解中發(fā)揮著重要作用。生物材料的酶降解分為兩步： 第一步是酶通過表面結(jié)合域在底物表面吸附， 第二步是化學(xué)鍵的水解[8-9]。作為天然高分子蛋白， 絲素纖維容易被蛋白水解酶所降解， 常用的酶包括蛋白酶XIV、 α-糜蛋白酶和膠原酶IA等[4]。不同的酶對SF的降解速率影響程度不一樣。Li等研究了多孔再生絲素蛋白膜的酶加速降解行為， 對濃度相同的膠原酶IA、 蛋白酶XIV和α-糜蛋白酶的降解能力進(jìn)行了對比。三種酶降解后的產(chǎn)物平均分子量大小依次為蛋白酶XIV< 膠原酶IA < α-糜蛋白酶。到第15天時(shí)， 蛋白酶XIV作用下70%的SF膜已降解 。Thidarat等報(bào)告了天然和PEG化絲納米粒子在蛋白水解酶(蛋白酶XIV和α-糜蛋白酶)、 木瓜蛋白酶(半胱氨酸蛋白酶)條件下為期20天的降解反應(yīng)。結(jié)果表明， 兩種絲納米粒子表現(xiàn)出相似的降解行為， 降解速率排序如下： 蛋白酶XIV>木瓜蛋白酶>α-糜蛋白酶[3]。Chen等研究了堿性蛋白酶、 α-糜蛋白酶、 胃蛋白酶和胰蛋白酶的對家蠶和柞蠶SF的降解過程。結(jié)果表明， 這四種酶對SF二級結(jié)構(gòu)有相似的水解作用， 而家蠶和柞蠶SF的變化主要表現(xiàn)為β-折疊和α-螺旋結(jié)構(gòu)的減少。

SF材料本身的化學(xué)結(jié)構(gòu)(蠶絲來源、 天然或再生SF、 基團(tuán)組成等)、 微觀結(jié)構(gòu)(微原纖的排列、 表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)等)和宏觀結(jié)構(gòu)(尺寸、 成型方式等)對降解速率也有影響[7-8]。You等對桑蠶絲和非桑蠶絲來源的再生SF支架進(jìn)行了降解行為比較。體內(nèi)試驗(yàn)表明， 在酶作用下， 非桑蠶絲來源的再生SF支架比桑蠶絲來源的再生SF支架降解更慢， 這是由于非桑蠶絲來源的再生SF支架有著更多的(-Ala-)n重復(fù)序列、 致密的晶體結(jié)構(gòu)以及高α-螺旋和β-折疊含量[1]。許多研究也表明， 水不溶性的silk II和水溶性的silk I對SF的降解速率有很大影響[8，4]。隨著β-折疊結(jié)構(gòu)的數(shù)量增加， 降解時(shí)間也隨之延長。以無定形結(jié)構(gòu)為主的再生絲素材料降解較快， 而晶區(qū)較多的天然絲素纖維降解較緩慢。

大多數(shù)蛋白水解酶都能很好地降解低分子量和非致密結(jié)構(gòu)的絲素蛋白， 這說明降解行為與絲生物材料的分子量和結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。聚合物的結(jié)構(gòu)和分子量是影響降解過程的兩個(gè)主要因素。低分子量和非致密結(jié)構(gòu)意味著酶很容易在絲表面結(jié)合， 表現(xiàn)出水解行為[11]。

本研究所選用的材料為天然蠶絲， 將其脫膠處理后得到SF纖維， 經(jīng)編織得到SFAL。綜合試驗(yàn)結(jié)果， PBS直到第70天才出現(xiàn)微量顆粒物， 而其他結(jié)果均未發(fā)生明顯改變。這就說明SFAL在PBS中降解緩慢。而酶降解液在第7天時(shí)便有少量絮狀物出現(xiàn)， 推測是SFAL樣品兩端有少量纖維降解。第14天， 質(zhì)量損失開始變得明顯， 但其他方面沒有明顯變化。SEM照片中未觀察到纖維斷裂， 推測質(zhì)量損失主要來自樣品兩端纖維的降解。第21天時(shí)， 纖維的表面形態(tài)、 質(zhì)量損失、 降解液的pH值和絮狀物的數(shù)量以及力學(xué)性能， 都出現(xiàn)了明顯改變。說明在蛋白酶XIV作用下， SFAL開始主體部分的降解， 纖維表面微觀形貌的破壞與SFAL力學(xué)性能的下降情況相吻合。到第70天時(shí)， SFAL中的纖維多處斷裂， 質(zhì)量損失率高達(dá)18.4%， 直徑下降了21.8%， 最大斷裂強(qiáng)力損失了50%。降解后酶溶液pH下降到7以下， 且可見絮狀物存在， 降解效果明顯。由于斷裂的纖維使SFAL有更多的表面暴露出來， 為蛋白酶提供了更多的作用位點(diǎn)。因此， 降解加快導(dǎo)致力學(xué)性能下降也加快。

在人工韌帶的研究中， 降解性能是非常重要的性能。如何預(yù)測并調(diào)控植入物的降解速率與降解周期， 是研究植入物降解性能的關(guān)鍵。植入物的降解速率應(yīng)與所植入部位組織的再生速率相匹配。隨著組織再生， 植入物逐步降解， 實(shí)現(xiàn)理想修復(fù)的目標(biāo)。SF的降解產(chǎn)物主要為游離氨基酸， 可以被機(jī)體吸收， 這在生物醫(yī)用領(lǐng)域是很有利的。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道， 蠶絲紗線在植入體內(nèi)后約5個(gè)月失去100%的抗拉強(qiáng)度[3]。然而， 降解速率可以通過支架設(shè)計(jì)和表面改性而改變。在體內(nèi)組織再生的過程中， 或材料在體內(nèi)承受負(fù)荷時(shí)， 材料的降解速率可能發(fā)生變化[17]。本研究中， 對酶降解條件下和力學(xué)性能變化曲線進(jìn)行了數(shù)學(xué)擬合。結(jié)果與已有的研究結(jié)果相一致。因此， 本研究結(jié)果可以為預(yù)測SFAL的體內(nèi)降解行為提供參考。

3 結(jié)論

本研究以SFAL為研究對象， 探討了PBS和酶溶液條件下SFAL的降解行為。結(jié)果表明， 70天內(nèi)， PBS未能使SFAL發(fā)生明顯變化。而蛋白酶XIV則明顯加速了SFAL的降解。在蛋白酶XIV的作用下， 隨著時(shí)間的推移SFAL發(fā)生了纖維斷裂、 質(zhì)量損失率增加、 力學(xué)性能下降及降解液的pH變化。本研究初步探索了SFAL的PBS與酶溶液降解行為差異。結(jié)合未來體內(nèi)降解試驗(yàn)結(jié)果， 可進(jìn)一步建立體內(nèi)外降解性能之間的關(guān)系， 可為開發(fā)降解性能和力學(xué)性能可控的SFAL產(chǎn)品提供參考。