細(xì)胞生物起搏器的研究新進(jìn)展

常青，于曉龍，高靜媛，劉香素，梁芳倩

作者單位：1 063000 唐山,河北省唐山市華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院老年病科

目前，植入電子起搏器是治療緩慢心律失常以及病態(tài)竇房結(jié)綜合征的主要方法，雖然在技術(shù)上相當(dāng)嫻熟，但它依然存在諸多并發(fā)癥，如感染、金屬過(guò)敏、電極脫位、電子干擾和對(duì)神經(jīng)激素缺乏反應(yīng)性等。這些缺點(diǎn)使得人們迫切需要尋找更接近心臟生理功能的生物起搏器，來(lái)進(jìn)一步提高患者的生活質(zhì)量[1]。

心臟生物起搏是利用細(xì)胞分子生物學(xué)及其相關(guān)技術(shù)，對(duì)受損的自律性節(jié)律點(diǎn)或發(fā)生傳導(dǎo)障礙的特殊傳導(dǎo)系統(tǒng)的組織進(jìn)行修復(fù)或替代，使心臟的起搏和傳導(dǎo)功能得以恢復(fù)。從心臟的生理功能和人體適應(yīng)性的角度來(lái)看，生物起搏治療是更為理想的治療方式，并且在大型動(dòng)物研究中進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)也均證明生物起搏是重建竇房結(jié)細(xì)胞起搏功能的有效方式[2]。目前生物起搏治療方法主要包括基因生物起搏及細(xì)胞生物起搏。但單純的基因生物起搏存在轉(zhuǎn)染靶向及轉(zhuǎn)染效率的不確定性，使人們逐漸選擇了細(xì)胞生物起搏治療。在本研究中，我們結(jié)合近年來(lái)國(guó)內(nèi)外最新文獻(xiàn)報(bào)道，對(duì)細(xì)胞生物起搏療法的研究現(xiàn)狀及存在問(wèn)題進(jìn)行綜述。

1 心臟起搏細(xì)胞的分子機(jī)制

1.1 心臟起搏細(xì)胞電生理機(jī)制心臟的特殊傳導(dǎo)系統(tǒng)具有自律性，但特殊傳導(dǎo)系統(tǒng)不同部位的心肌細(xì)胞的自律性存在差別。竇房結(jié)細(xì)胞（SAN）的自動(dòng)節(jié)律性興奮的頻率最高，是正常起搏點(diǎn)，主導(dǎo)整個(gè)心臟興奮和搏動(dòng)。其自律性主要是通過(guò)以下機(jī)制形成：竇房結(jié)細(xì)胞是鈣鐘（細(xì)胞內(nèi)肌槳網(wǎng)，Ca2+clock）和膜鐘（竇房結(jié)細(xì)胞膜多種離子流）相互作用，兩者聯(lián)合調(diào)整竇房結(jié)細(xì)胞的自律性[3]。竇房結(jié)細(xì)胞的肌漿網(wǎng)通過(guò)膜上蘭尼堿受體（RyR）釋放鈣離子，激活鈉鈣交換，Ca2+鐘引發(fā)膜鐘從而爆發(fā)動(dòng)作電位。膜離子通道的循環(huán)激活和失活、肌漿網(wǎng)節(jié)律性自發(fā)釋放鈣離子共同調(diào)節(jié)竇房結(jié)細(xì)胞，維持竇房結(jié)細(xì)胞穩(wěn)定的自律性和起搏性。

1.2 心臟起搏細(xì)胞HCN通道1976年，Noma和Irisawa在兔竇房結(jié)細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)了一種超極化激活內(nèi)向電流，稱為“起搏電流（If）”[4]。研究表明，起搏電流是竇房結(jié)細(xì)胞舒張期自動(dòng)去極化的主要決定因素，并在心率控制及神經(jīng)遞質(zhì)對(duì)心率的調(diào)節(jié)中起重要作用。而超極化激活的環(huán)核苷酸門控陽(yáng)離子通道（HCN）基因家族則是起搏電流形成的分子機(jī)制。HCN基因家族有4個(gè)成員，分別是HCN 1～4。每一種亞型都含有6個(gè)跨膜區(qū)域和1個(gè)環(huán)核苷酸結(jié)合區(qū)域（CNBD）化激活的陽(yáng)離子通道—環(huán)核苷酸門控通道（HCN）從而參與去極化的形成。HCN通道具有4種功能[5]：①控制起搏活動(dòng)；②調(diào)控細(xì)胞靜息電位；③調(diào)控細(xì)胞膜電阻和樹(shù)突整合；④調(diào)控突觸傳遞。

HCN基因家族中只有HCN1、HCN2、HCN4在心臟表達(dá)，主要以HCN2和HCN4為主。HCN2在不同動(dòng)物上表達(dá)部位有差異：在小鼠HCN2主要分布在竇房結(jié)組織，在大鼠心房肌組織和浦肯野纖維上表達(dá)較多，在兔主要分布在心室肌組織，在人類心室肌表達(dá)較多，并可誘發(fā)內(nèi)向離子流。研究表明[6]，將HCN2基因直接注射到狗心臟不同部位，在迷走刺激下均觀察到源于注射部位且頻率較快的起搏節(jié)律，約130～160 次/min。同樣，HCN4在不同動(dòng)物上表達(dá)部位也有差異：HCN4在兔、小鼠和人的竇房結(jié)組織中高表達(dá)，在大鼠的心室肌中高表達(dá)，在犬的浦肯野纖維和竇房結(jié)組織高表達(dá)。已有研究表明[7]，HCN4基因突變會(huì)導(dǎo)致竇房結(jié)功能障礙。

2 細(xì)胞作為載體構(gòu)建生物起搏

目前來(lái)說(shuō)，細(xì)胞型生物起搏器的種子細(xì)胞來(lái)源主要有3種方法： ①干細(xì)胞誘導(dǎo)；②基因轉(zhuǎn)染；③細(xì)胞融合。

2.1 干細(xì)胞誘導(dǎo)起搏種子細(xì)胞的選擇大致為竇房結(jié)原代細(xì)胞[8]、脂肪干細(xì)胞[9]、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞[10]、胚胎干細(xì)胞[11]、心肌干細(xì)胞[12]等。主要以骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞為主。

間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCS）是再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中具有廣闊前景的多能干細(xì)胞。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）來(lái)源于中胚層，具有較強(qiáng)的自我更新能力和多向分化潛能，即“干細(xì)胞可塑性”，可誘導(dǎo)分化為起搏細(xì)胞、心肌細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和脂肪細(xì)胞等[13]。目前，主要的誘導(dǎo)方式有兩種，分別是化學(xué)誘導(dǎo)和微環(huán)境誘導(dǎo)?；瘜W(xué)誘導(dǎo)主要以5-氮胞苷為主，研究表明[14]，5-氮胞苷誘導(dǎo)的BMSCs能夠分化為表達(dá)HCN2通道蛋白以及If電流的類起搏細(xì)胞。但此類誘導(dǎo)劑具有細(xì)胞毒性并可致突變，因此，化學(xué)誘導(dǎo)值得商榷。微環(huán)境誘導(dǎo)在一定程度上符合機(jī)體生長(zhǎng)環(huán)境，并具備誘導(dǎo)所需的因子和活性集團(tuán)，無(wú)細(xì)胞毒性和致突變性。此類誘導(dǎo)方式可分為直接誘導(dǎo)和間接誘導(dǎo)。直接誘導(dǎo)是將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和竇房結(jié)細(xì)胞（心肌細(xì)胞）或組織共培養(yǎng)，利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的多向分化能力，彼此的機(jī)械剪切力和所分泌的活性集團(tuán)，誘導(dǎo)使其成為具有起搏功能的細(xì)胞[15]。研究表明[16]，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可與心肌細(xì)胞相互作用，并表達(dá)連接蛋白40和43（connexin 40 and connexin43），形成縫隙連接和開(kāi)放HCN通道，產(chǎn)生起搏功能且其穩(wěn)定性能保持很久。間接誘導(dǎo)是將竇房結(jié)細(xì)胞或者心肌細(xì)胞反復(fù)凍融制備裂解液，使其釋放出所含細(xì)胞活性因子，從而去誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。研究表明[17]，用鼠竇房結(jié)裂解液去誘導(dǎo)自身骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，誘導(dǎo)后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能表達(dá)HCN2，并產(chǎn)生超極化激活的起搏電流，其誘導(dǎo)分化率隨竇房結(jié)細(xì)胞裂解液濃度升高而升高。Zhang等[18]在豬的完全性房室傳導(dǎo)阻滯模型中，將豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植到自體心臟后產(chǎn)生If電流并表達(dá)HCN4，可明顯提高心率。因此，對(duì)于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，不論直接誘導(dǎo)還是間接誘導(dǎo)及自身移植都在一定程度上具有有效性。此外，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能從自體骨髓中獲取，容易分離純化及擴(kuò)增培養(yǎng)，其與胚胎干細(xì)胞相比優(yōu)勢(shì)明顯，不存在免疫排斥及倫理等問(wèn)題，且易于整合外源基因，故應(yīng)用BMSCs分化為特殊心肌細(xì)胞治療緩慢型心律失常具備一定的潛力，其已成為病態(tài)竇房結(jié)綜合征生物起搏治療中比較理想的載體細(xì)胞。

胚胎干細(xì)胞是常見(jiàn)的多能性干細(xì)胞（PSCs）之一。研究表明[19]，選用胚胎心臟祖細(xì)胞為種子細(xì)胞，用內(nèi)皮素-1可誘導(dǎo)為起搏細(xì)胞，再以膠原海綿和matrigel基質(zhì)膠為支架材料，已成功構(gòu)建成體外搏動(dòng)的細(xì)胞支架復(fù)合體，移植入大鼠左心室室壁后，心電圖可以觀察到單個(gè)、成對(duì)室早及室性心律。但是，胚胎心臟祖細(xì)胞應(yīng)用到臨床可能會(huì)面臨倫理學(xué)和免疫排斥反應(yīng)等問(wèn)題，從而限制了其臨床應(yīng)用。

2.2 基因轉(zhuǎn)染運(yùn)用生物、基因工程技術(shù)導(dǎo)入起搏基因或起搏相關(guān)基因可提高干細(xì)胞自律性。主要的基因轉(zhuǎn)染載體有腺病毒、慢病毒、脂質(zhì)體以及電打孔等多種方法，其中最常用的腺病毒轉(zhuǎn)染[20]。通過(guò)基因轉(zhuǎn)染形成的干細(xì)胞源性起搏細(xì)胞類似于內(nèi)源性竇房結(jié)細(xì)胞，存在起搏基因表達(dá)和電流特征。研究表明[21]，將人HCN1基因通過(guò)慢病毒載體轉(zhuǎn)染到骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，用全細(xì)胞膜片鉗分析記錄轉(zhuǎn)染HCN1的MSCs中的起搏電流（If），可檢測(cè)到4 μm氯化銫抑制的高電壓和時(shí)間依賴的內(nèi)向超極化電流，表明HCN1基因可在MSCs中表達(dá)，其起搏頻率達(dá)129±11 次/min（n=5）。Li等[22]在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，將鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞通過(guò)腺病毒轉(zhuǎn)染Tbx18轉(zhuǎn)錄因子，可誘導(dǎo)成起搏細(xì)胞。矮小同源框基因家族的成員Shox2和Tbx3這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子在胚胎時(shí)期對(duì)竇房結(jié)起搏功能起到重要作用。在基因篩選過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，鼠類胚胎早期階段，Shox2的表達(dá)會(huì)加強(qiáng)胚胎干細(xì)胞向起搏細(xì)胞的分化，其可能機(jī)制是Shox2上調(diào)起搏基因HCN4使其自律性加強(qiáng)[23]。當(dāng)Shox2被敲除后，心臟收縮頻率會(huì)減慢，但此階段轉(zhuǎn)染Shox2時(shí)會(huì)增加心臟竇房結(jié)細(xì)胞比例[24]。Shox2缺陷的小鼠胚胎會(huì)表現(xiàn)出包括竇房結(jié)區(qū)在內(nèi)的靜脈竇心肌發(fā)育不全和缺乏心臟起搏相關(guān)基因Tbx3和HCN4的表達(dá)。Tbx3基因在竇房結(jié)發(fā)育過(guò)程中控制竇房結(jié)基因的編程并維持起搏，缺失后會(huì)導(dǎo)致在小鼠胚胎竇房結(jié)內(nèi)出現(xiàn)心房基因的表達(dá)，失去部分竇房結(jié)特異性起搏位點(diǎn)。研究表明[25]，當(dāng)轉(zhuǎn)染HCN4到多能干細(xì)胞（PSC）源性的心肌細(xì)胞，它會(huì)產(chǎn)生一個(gè)豐富的If電流和一個(gè)弱的內(nèi)向整流性鉀電流（IK1），顯示更頻繁的自發(fā)性搏動(dòng)和較強(qiáng)的起搏能力，部分移植能夠恢復(fù)心率。雖然胚胎心臟祖細(xì)胞免疫原性很小，易產(chǎn)生免疫耐受，但仍難避免免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生，如果應(yīng)用到臨床也可能會(huì)面臨倫理學(xué)和免疫排斥反應(yīng)等問(wèn)題。

2.3 細(xì)胞融合細(xì)胞融合是指在外力（誘導(dǎo)劑或促融劑）作用下，將兩個(gè)或兩個(gè)以上的異源（種、屬間）細(xì)胞或原生質(zhì)體相互接觸，從而發(fā)生膜融合、胞質(zhì)融合和核融合并形成雜種細(xì)胞的現(xiàn)象[26]。目前，常用的細(xì)胞融合方法有：仙臺(tái)病毒（seV）誘導(dǎo)法、水皰性口炎病毒（VSV）誘導(dǎo)法、聚乙二醇（PEG）誘導(dǎo)法、電融合誘導(dǎo)法、激光融合法等。在細(xì)胞生物起搏方面，最常用的是聚乙二醇（PEG）誘導(dǎo)法，即將表達(dá)特殊離子通道的細(xì)胞融合到竇房結(jié)細(xì)胞或心肌細(xì)胞，再移植到體內(nèi)并產(chǎn)生起搏電位。有研究表明[27]，利用聚乙二醇作為誘導(dǎo)劑，將表達(dá)HCN1的同系成纖維細(xì)胞與新鮮分離的豚鼠心肌細(xì)胞融合，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，融合后的細(xì)胞表現(xiàn)出自主性動(dòng)作電位，頻率隨β腎上腺素能刺激而增加，即通過(guò)細(xì)胞融合后形成的異核體細(xì)胞在體內(nèi)注射部位能夠產(chǎn)生起搏活性。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是，不僅可以收獲和使用自體細(xì)胞，而且是非病毒，非干細(xì)胞的方法，可避免病毒載體及其并發(fā)癥；缺點(diǎn)是通過(guò)細(xì)胞融合技術(shù)構(gòu)建的細(xì)胞生物，并沒(méi)有在體內(nèi)表現(xiàn)出一致且穩(wěn)定的起搏頻率。

3 生物起搏器的移植方式

在干細(xì)胞移植方式上，干細(xì)胞移植途徑、干細(xì)胞靶向歸巢數(shù)量、移植的時(shí)機(jī)、位置及移植后在組織中停留的時(shí)間等都是值得考慮的問(wèn)題。目前主要由三種移植方式，分別是心肌內(nèi)注射、冠脈內(nèi)注射以及靜脈內(nèi)注射移植，主要以前兩種較為常見(jiàn)。不論何種移植方式，都應(yīng)力求簡(jiǎn)便、安全、高效、并發(fā)癥少等。研究表明[28]，與靜脈移植組相比，心肌內(nèi)直接注射移植能夠明顯改善心臟的收縮功能、抑制心室結(jié)構(gòu)的擴(kuò)張重構(gòu)，并在早期實(shí)驗(yàn)中可表現(xiàn)出較好的安全性和可行性。若在以后的研究中采用導(dǎo)管微創(chuàng)植入，不僅可以消除機(jī)械起搏器帶來(lái)的并發(fā)癥，而且可重復(fù)操作性強(qiáng)，感染風(fēng)險(xiǎn)小，這將為再生醫(yī)學(xué)的細(xì)胞替代療法提供新的途徑。

4 生物起搏器的存在問(wèn)題

隨著分子和細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)快速發(fā)展，構(gòu)建細(xì)胞型生物起搏器是治療病態(tài)竇房結(jié)綜合征理想的方法。在臨床應(yīng)用之前，存在以下幾個(gè)問(wèn)題：①移植后細(xì)胞在體內(nèi)保留的時(shí)間是所有細(xì)胞治療的最重要的問(wèn)題，目前還不清楚移植的竇房結(jié)細(xì)胞在心臟存活時(shí)間。當(dāng)通過(guò)腺病毒轉(zhuǎn)染Tbx18 基因到豬體內(nèi)，觀察到生物起搏細(xì)胞的活性峰值在第8 天，然后逐漸減慢，并且可出現(xiàn)晝夜心率不同，這可能與體內(nèi)生理活動(dòng)有關(guān)，其持續(xù)時(shí)間之短和不穩(wěn)定性難以應(yīng)用于臨床；②移植細(xì)胞可誘導(dǎo)快速性心律失常。將人BMSCs和新生鼠心肌細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)形成的細(xì)胞集落傳導(dǎo)速度降低，分析原因可能是心肌細(xì)胞和無(wú)興奮性的BMSCs形成縫隙連接導(dǎo)致心律紊亂，也可能與移植后致心臟交感神經(jīng)重構(gòu)引發(fā)心律失常；③用于治療病竇綜合征、心衰以及心律失常所用的負(fù)性變時(shí)藥物能夠抑制生物起搏器的起搏能力；④干細(xì)胞誘導(dǎo)、病毒轉(zhuǎn)染和細(xì)胞融合技術(shù)都可能存在基因突變和并發(fā)腫瘤疾病的隱患。

5 結(jié)論

通過(guò)干細(xì)胞誘導(dǎo)和基因轉(zhuǎn)染方式構(gòu)建的細(xì)胞型生物起搏器，為緩慢型心律失?；颊叩闹斡鷰?lái)了希望。間充質(zhì)干細(xì)胞具有多向分化潛能，能從自體獲取，易分離純化及擴(kuò)增培養(yǎng)，不存在免疫排斥及倫理等問(wèn)題，且易于整合外源基因，是生物起搏治療中比較理想的載體細(xì)胞。而轉(zhuǎn)染HCN2或HCN4基因可使干細(xì)胞表達(dá)起搏電流，然后移植表達(dá)有起搏電流的干細(xì)胞可以用于治療緩慢型心律失常。但是，細(xì)胞生物起搏真正應(yīng)用于臨床尚有很多路要走。生物起搏的靶基因的選擇、安全有效和可控的體內(nèi)基因運(yùn)載體系以及干細(xì)胞的安全性等諸多問(wèn)題尚未完全解決。但生物起搏器代替電子起搏器仍是未來(lái)發(fā)展的方向，相信不遠(yuǎn)的將來(lái)，通過(guò)人們不斷的實(shí)驗(yàn)探究，生物起搏器可以安全有效的用于緩慢型心律失?；颊叩闹委熤小?/p>