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    結(jié)締組織生長(zhǎng)因子基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)與糖尿病視網(wǎng)膜病變關(guān)系的研究

    2020-04-14 01:51:14楊曉輝鄧春穎
    關(guān)鍵詞:胞外基質(zhì)條帶甲基化

    侯 雨,于 揚(yáng),楊曉輝,于 勤,鄧春穎

    糖尿病是以慢性高血糖為特征的一組代謝性疾病。其流行趨勢(shì)異常嚴(yán)峻,全球糖尿病發(fā)病呈整體上升趨勢(shì)。據(jù)統(tǒng)計(jì)[1],截至2013年全球共有3.82億人患有糖尿病,預(yù)計(jì)25年后糖尿病患病人數(shù)將達(dá)到5.92億,發(fā)展中國(guó)家面臨的形勢(shì)更為嚴(yán)峻,全球總患病人數(shù)的80.0%在發(fā)展中國(guó)家。而糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是其嚴(yán)重慢性并發(fā)癥,也是成年人最主要的致盲眼病,有資料[2]顯示中國(guó)大陸糖尿病病人OR患病率為23%。DR發(fā)病機(jī)制未明,其病因可能與炎癥、組織缺血缺氧、氧化應(yīng)激、多元醇途徑亢進(jìn)、細(xì)胞增殖異常以及纖維化有關(guān)[3]。結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor,CTGF)是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞因子,被認(rèn)為是TGF-β1的直接下游效應(yīng)介質(zhì),可誘導(dǎo)下游的Ⅰ型膠原及Ⅲ型膠原的合成,可導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)合成增加,進(jìn)而導(dǎo)致組織纖維化。血清中CTGF水平異常與DR相關(guān)性已經(jīng)得到證實(shí)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)分析DR病人CTGF基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài),探討CTGF基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與DR的聯(lián)系?,F(xiàn)作報(bào)道。

    1 資料與方法

    1.1 一般資料 參照1999年WHO對(duì)糖尿病的診斷與分型,選取2014年6月至2015年5月大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院內(nèi)分泌科住院的糖尿病病人120例,行眼底檢查,糖尿病病人行眼底熒光造影,根據(jù)2002年DR國(guó)際臨床分型統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn),確診其中DR組(DR組)57例,男30例,女27例,年齡(57.26±7.97)歲,病程(8.11±3.79)年;糖尿病不合并視網(wǎng)膜病變組(NDR組)63例,男31例,女32例,年齡(59.25±8.17)歲,病程(7.74±3.27)年;健康對(duì)照組(NC組)為來(lái)院健康體檢者,共計(jì)58名,其中男27名,女31名,年齡(58.74±7.77)歲。排除標(biāo)準(zhǔn):所有研究對(duì)象均排除糖尿病急性并發(fā)癥、1型糖尿病、繼發(fā)性糖尿病及妊娠糖尿病;排除急慢性感染、嚴(yán)重肝臟疾病、腎病綜合征、高血壓腎病、腎小球腎炎等腎臟疾病(糖尿病腎病可入組)、腫瘤以及自身免疫性疾病、其他可引起組織纖維化的疾病;排除其他疾病引起的視網(wǎng)膜病變;NC組排除糖耐量異常與空腹血糖受損。3組一般資料均具有可比性。本研究通過(guò)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

    1.2 方法 采取調(diào)查問(wèn)卷、查閱病例、體格檢查的方式獲取一般臨床資料。研究對(duì)象禁食禁飲8 h后采集標(biāo)本。

    1.2.1 目的基因獲取以及甲基化 采集研究對(duì)象靜脈血2 mL,嚴(yán)格按照試劑盒(Ezup柱式血液基因組DNA抽提試劑盒,上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司生產(chǎn))要求提取DNA 50 μL,取目的基因20 μL,嚴(yán)格按照甲基化試劑盒(EZ DNA Methylation-GoldTM Kit,美國(guó)ZOMY RESEARCH)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行DNA甲基化,獲取甲基化產(chǎn)物10 μL,于-20 ℃冰箱保存。

    1.2.2 MSPCR檢測(cè)目的基因甲基化水平 經(jīng)查Gene Bank數(shù)據(jù)庫(kù)以及檢索相關(guān)文獻(xiàn)[4],確定CTGF甲基化引物(M)以及非甲基化引物(U),由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成CTGF(M)上游引物5′-TCG TTT CGG TCG ATA GTT TC-3′;下游引物5′-CGA AAC CCA TAC TAA CGA CG-3′;CTGF(U)上游引物5′TTG TTT TGG TTG ATA GTT TT-3′下游引物5′-CAA AAC CCA TAC TAA CAA CA-3′ ;其產(chǎn)物長(zhǎng)度均為159 bp,嚴(yán)格按照Taq聚合酶擴(kuò)增試劑盒(上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司生產(chǎn))說(shuō)明書(shū)操作,擴(kuò)增體系為50 μL,其中亞硫酸氫鈉修飾DNA 1 μL,上下游M或者U引物各1 μL,RCR master 22 μL,dH2O 25 μL,甲基化與非甲基化反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性45 s,50 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共38個(gè)循環(huán),最后72 ℃延伸7 min。反應(yīng)結(jié)束后,取產(chǎn)物10 μL用2.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,溴化乙錠染色,電泳結(jié)束后用凝膠成像系統(tǒng)拍照并分析。如果甲基化條帶與非甲基化條帶同時(shí)出現(xiàn),判定為半甲基化;出現(xiàn)甲基化條帶,無(wú)非甲基化條帶出現(xiàn),判定為甲基化;出現(xiàn)非甲基化條帶而無(wú)甲基化條帶出現(xiàn),判定為去甲基化。

    1.2.3 血清中CTGF蛋白檢測(cè) 采集標(biāo)本2 mL,EDTA抗凝,2 500 r/min離心5 min,吸取血清,置于1.5 mL離心管中,濃度測(cè)定采取ELISA法測(cè)定,嚴(yán)格按照試劑盒(上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司生產(chǎn))說(shuō)明書(shū)操作,應(yīng)用酶標(biāo)儀450 nm 測(cè)定吸光度值及讀出對(duì)應(yīng)濃度數(shù),根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值計(jì)算出標(biāo)本濃度。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用t檢驗(yàn)、方差分析和q檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)。

    2 結(jié)果

    2.1 甲基化陽(yáng)性率的判定 MSP凝膠電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。

    2.2 CTGF基因啟動(dòng)子甲基化MSPCR結(jié)果 DR組CTGF基因啟動(dòng)子甲基化陽(yáng)性率為24.45%低于NDR組的42.86%和NC組的78.95%(P<0.05和P<0.01);NDR組甲基化陽(yáng)性率低于NC組的陽(yáng)性率(P<0.01)(見(jiàn)表1)。

    表1 各組CTGF基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)的比較[n;百分率(%)]

    分組n甲基化狀態(tài)χ2PDR組5714(24.45) NDR組NC組635827(42.86)? 45(78.95)??△△33.53<0.01合計(jì)17886(48.31)

    χ2分割:與DR組比較*P<0.05,**P<0.01;與NDR組比較△△P<0.01

    2.3 各組血清中CTGF含量的比較 DR組血清CTGF水平高于NDR組和NC組(P<0.01);NDR組血清CTGF水平高于NC組(P<0.01)(見(jiàn)表2)。

    表2 各組CTGF測(cè)定值的比較

    q檢驗(yàn):與DR組比較**P<0.01;與NDR組比較△△P<0.01

    3 討論

    DR是糖尿病嚴(yán)重并發(fā)癥,目前其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明,已經(jīng)有資料[5]顯示CTGF與DR有關(guān)。CTGF是由BRADHAM等[6]于1991年在人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)的一種分泌性蛋白,廣泛分布于心、腦、肝、腎、肺、玻璃體、動(dòng)脈等多種組織器官中。CTGF作用較為廣泛,可以刺激并且誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化進(jìn)而導(dǎo)致器官或者組織纖維化,同時(shí)也可以刺激毛細(xì)血管形成并且可以促使細(xì)胞外基質(zhì)沉淀的同時(shí)重塑細(xì)胞外基質(zhì)[7-8];另外還可以介導(dǎo)細(xì)胞黏附,刺激細(xì)胞轉(zhuǎn)移等[9]。作為纖維化介質(zhì),CTGF的存在有著重大意義,在正常條件下,CTGF表達(dá)很低,但是在應(yīng)激、創(chuàng)傷、急性炎癥等條件下,CTGF表達(dá)可上調(diào),在損傷修復(fù)以及瘢痕形成中發(fā)揮重大作用,利于創(chuàng)面愈合,利于機(jī)體修復(fù)。而機(jī)體損傷修復(fù)后,CTGF含量可下調(diào)至正常。糖尿病病人因?yàn)槲⒀h(huán)障礙導(dǎo)致組織缺血缺氧,導(dǎo)致血液中血小板及巨噬細(xì)胞活化從而導(dǎo)致TGF-β1大量的釋放,TGF-β1是CTGF的上游因子,其上調(diào)導(dǎo)致了CTGF含量的上調(diào),CTGF不但可以促使視網(wǎng)膜中毛細(xì)血管的生成[10],同時(shí)可以導(dǎo)致視網(wǎng)膜細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生增多以及纖維化[11],由于CTGF含量上調(diào),早期可導(dǎo)致毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞基底膜增厚,微血管瘤形成,進(jìn)而導(dǎo)致毛細(xì)血管閉塞,視網(wǎng)膜細(xì)胞缺血缺氧加重,由于視網(wǎng)膜細(xì)胞缺血缺氧,進(jìn)一步導(dǎo)致新生毛細(xì)血管以及纖維組織的生成,隨著纖維組織的大量生成,逐漸牽拉視網(wǎng)膜,導(dǎo)致視網(wǎng)膜被撕脫,最終致使病人失明。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示血清中CTGF水平,DR組高于NDR組與NC組,提示血清中水平與DR相關(guān),CTGF在DR形成中起一定作用:CTGF可促進(jìn)纖維化和毛細(xì)血管生成,CTGF的過(guò)表達(dá)與分泌可能是DR發(fā)生與發(fā)展的重要機(jī)制。

    已經(jīng)有實(shí)驗(yàn)[12]證實(shí)了高血糖與DR發(fā)生具有密切相關(guān)性,但是英國(guó)前瞻性糖尿病研究以及后續(xù)研究發(fā)現(xiàn),糖尿病病人血糖控制良好之后,其視網(wǎng)膜病變的發(fā)病率仍高于對(duì)照組。其機(jī)制可能與代謝記憶現(xiàn)象有關(guān)。目前對(duì)代謝記憶現(xiàn)象的機(jī)制尚未明確,代謝記憶效應(yīng)可能與表觀遺傳學(xué)有關(guān)。長(zhǎng)期慢性高糖血癥可引起血管病變包括大血管病變以及微血管病變,其共同機(jī)制為高血糖以及終末糖基化產(chǎn)物(AGEs)的增加使活性氧簇(ROS)的水平增加,從而使包括酪氨酸激酶(TK)、蛋白激酶C、絲裂原激活的蛋白激酶(MAPKs)等多條細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被激活。這些通路的激活可以使NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子活化,同時(shí)也使DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)與DNA去甲基化酶(DeMet)的水平紊亂,這些都可以導(dǎo)致異常的甲基化,而 DNA 甲基化可通過(guò)影響染色體結(jié)構(gòu)和功能在基因表達(dá)的調(diào)節(jié)上起重要作用[13-14]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)DR組甲基化陽(yáng)性率明顯低于NDR組與NC組,CTGF甲基化水平與血清CTGF水平呈負(fù)相關(guān);CTGF基因啟動(dòng)子去甲基化導(dǎo)致DR與糖尿病腎病相一致,提示二者可能在分子機(jī)制上有相似性。

    綜上,高血糖導(dǎo)致組織缺血缺氧,進(jìn)而導(dǎo)致血液中血小板及巨噬細(xì)胞活化從而導(dǎo)致TGF-β1大量的釋放,TGF-β1是CTGF的上游因子,其上調(diào)導(dǎo)致了CTGF含量的上調(diào);而長(zhǎng)期高血糖以及AGEs堆積可以導(dǎo)致氧化應(yīng)激,從而激活細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,這些通路的活化不但導(dǎo)致了核轉(zhuǎn)錄因子的激活,也導(dǎo)致甲基化酶水平的紊亂。這些都可以導(dǎo)致CTGF基因啟動(dòng)子甲基化水平減低,高甲基化水平抑制目的基因表達(dá),這種抑制解除之后致使基因表達(dá)增強(qiáng),最終導(dǎo)致血清CTGF含量增多,而CTGF具有刺激毛細(xì)血管增殖、刺激成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化以及促使細(xì)胞外基質(zhì)增生的作用,這些都可以引起組織纖維化,隨著病情的進(jìn)展而導(dǎo)致DR的發(fā)生。從表觀遺傳學(xué)角度,CTGF基因啟動(dòng)子低甲基化導(dǎo)致血清CTGF水平升高,可能是DR發(fā)生發(fā)展的機(jī)制之一。本實(shí)驗(yàn)一定程度上闡述了CTGF基因啟動(dòng)子甲基化與DR的關(guān)系,但因?yàn)镃TGF功能眾多,高血糖導(dǎo)致CTGF基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化的具體機(jī)制有待更進(jìn)一步闡明;由于本實(shí)驗(yàn)由于時(shí)間限制收集標(biāo)本量少,且未將DR組標(biāo)本具體分為背景期組與增殖期組,NC組因志愿者配合問(wèn)題和醫(yī)學(xué)倫理等原因均未能行眼底熒光造影檢查,僅行眼底鏡檢查。在下一步實(shí)驗(yàn)中我們會(huì)盡可能多地招募志愿者,并將DR組分為非增殖期DR組(NPDR組)與增殖期DR組(PDR組),并結(jié)合檢測(cè)房水CTGF水平,重點(diǎn)探討CTGF基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)與增殖期DR的關(guān)系;檢測(cè)TGF-β1、TSP1等相關(guān)因子的水平,探討DR病人CTGF基因啟動(dòng)子低甲基化機(jī)制。

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