芝麻素對Toll樣受體2在實(shí)驗(yàn)性顱腦損傷中表達(dá)的影響

吳少帥，徐福林，蘇作鵬，杜嘉瑞，沈 剛

創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)是現(xiàn)代社會一種常見身體損傷，多為意外摔倒、車禍傷、高處墜落等導(dǎo)致，傷后病人病情危急，預(yù)后不佳。通過深入研究，近來發(fā)現(xiàn)

TBI后繼發(fā)炎癥性腦損傷是影響病人預(yù)后的重要因素[1-2]。堯小龍等[3]報道TBI后通過Toll樣受體(TLRs)/ κB信號通路激活小膠質(zhì)細(xì)胞釋放炎性因子，啟動炎性反應(yīng)。TLR2在實(shí)驗(yàn)性腦出血模型中被證明是炎癥性腦損傷的重要啟動因子[4]，但在TBI中是否也存在類似機(jī)制鮮有報道。因此，本文通過鼠腦損傷模型研究，闡明TLR2在腦損傷后的表達(dá)及作用，同時評價芝麻素的抗炎效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物和分組 實(shí)驗(yàn)動物由上海交通大學(xué)瑞金醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供。45 只 C57BL/6小鼠，體質(zhì)量25～30 g，按隨機(jī)化原則，分為假手術(shù)組、腦損傷組、腦損傷后芝麻素治療組，每組15只；普通飼養(yǎng)。先通過二甲亞砜溶解芝麻素，在鼠損傷模型建立成功后，向芝麻素組鼠的腹腔中注入芝麻素(30 mg/kg)，每天 1 次，連續(xù)3 d。

1.2 自由落體動物模型建立 采用腹腔注射氯胺酮(100 mg/kg)和甲苯噻嗪(10 mg/kg)麻醉小鼠。麻醉成功后頭部于立體定向儀上固定、備頭皮、消毒。于人字縫與矢狀縫交匯處作一正中切口，切開頭皮、暴露顱骨，剝離骨膜；在左側(cè)冠狀縫和人字縫之間、中線旁開3 mm處顱骨鉆孔，骨窗直徑3 mm，使硬腦膜完整暴露；應(yīng)用BW-ZYQ精細(xì)顱腦撞擊儀(上海軟隆科技公司)設(shè)定打擊參數(shù)(深度：1 mm；砝碼重量：10 g；打擊高度：2 cm)，使用直徑2.5 mm的打擊頭撞擊鼠的腦皮質(zhì)。在致傷后移開鼠并重新縫合頭皮。假手術(shù)組鼠均不行腦皮質(zhì)打擊，但其他步驟與實(shí)驗(yàn)組相同。

1.3 干濕重法檢測鼠腦水含量 腦損傷3 d后，于每組中取 5只小鼠深度麻醉后處死(戊巴比妥麻醉)，完整取出腦組織稱重，記濕重；后置于100 ℃烘烤24 h，稱重記為干重。腦水含量= (濕重-干重) /濕重 ×100%。

1.4 利用Western blotting技術(shù)檢測3組小鼠中TLR2表達(dá) 于外傷后3 d，每組取5只小鼠深度麻醉下斷頭取腦，顯微鏡下取傷灶周邊腦組織，加入RIPA裂解液，超聲粉碎。向加樣槽中加入樣本后電泳、跑膠，在轉(zhuǎn)膜電泳槽中裝入膜，冰浴中恒流轉(zhuǎn)膜 1 h。在5%脫脂牛奶中浸潤膜并封閉 1 h；一抗4 ℃孵育過夜；用TBST清洗10 min×3 次；二抗孵育1 h；用TBST清洗10 min×3次后，ECL 顯色，掃描顯影。目標(biāo)蛋白與內(nèi)參照β-actin的比值為相對表達(dá)量。

1.5 熒光定量PCR檢測炎性因子表達(dá) 每組5只小鼠均于手術(shù)后3 d，深度麻醉下斷頭取腦，取傷灶周邊腦組織，稱取腦組織100 mg。Trizol法提取腦組織細(xì)胞中的RNA，參考M-MLV 操作說明書(Promega 公司)將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。按照SYBR green說明書加樣，各樣本加入cDNA 2 μL，商品化引物2 μL(IL-1β：MQP027422；IL-6:MQP029457；TNF-α:MQP031019，美國Genecopoeia公司)。PCR反應(yīng)條件為預(yù)變性95 ℃×2 min后，變性95 ℃ 40 s，退火52 ℃ 40 s，延伸72 ℃ 1 min，35個循環(huán)后72 ℃延伸10 min。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用方差分析和q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 3組小鼠的損傷側(cè)腦水含量及腦組織TLR2蛋白表達(dá)水平比較 3組小鼠的腦水含量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，腦外傷組腦水含量高于假手術(shù)組和芝麻素治療組(P<0.05)。3組小鼠組織TLR2蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，腦外傷組TLR2蛋白表達(dá)水平顯著高于假手術(shù)組和芝麻素治療組(P<0.01)(見表1)。

分組n腦水含量/%TLR2蛋白量假手術(shù)組571.57±7.94.67±0.42腦外傷組582.16±4.6?6.84±0.98??芝麻素組574.26±5.6#5.41±0.17##F—3.9515.66P—<0.05<0.01MS組內(nèi)—38.3100.389

q檢驗(yàn)：與假手術(shù)組比較*P<0.05，**P<0.01；與腦外傷組比較#P<0.05，##P<0.01

2.2 3組小鼠腦組織中IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA的表達(dá)比較 與假手術(shù)組相比，腦外傷組中 IL-1β、IL-6和 TNF-α mRNA的表達(dá)水平明顯增高(P<0.05～P<0.01)；而芝麻素處理組中腦組織中IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA的表達(dá)水平則顯著低于腦外傷組(P<0.05～P<0.01)(見表2)。

分組nIL-1β mRNAIL-6 mRNATNF-α mRNA假手術(shù)組56.81±0.9210.56±1.865.13±0.44 腦外傷組59.32±1.06??14.38±2.14?8.89±0.57??芝麻素組57.49±0.79#11.47±1.21#6.49±0.36??##F— 9.746.2883.89P—<0.01 <0.01 <0.01 MS組內(nèi)—0.8653.1680.216

q檢驗(yàn)：與假手術(shù)組比較*P<0.05，**P<0.01；與腦外傷組比較#P<0.05，##P<0.01

3 討論

TBI的發(fā)病率、致殘率居高不下，嚴(yán)重影響人們的生命健康。統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，全球TBI的發(fā)生率約為每年349/10萬，ROOZENBEEK等[5]報道在美國TBI后死亡率高達(dá)17/10萬人，在中國TBI死亡率在12.99/10萬人，給社會和家庭帶來沉重負(fù)擔(dān)，因此TBI后病理生理變化和治療仍是目前研究的一大熱點(diǎn)。TBI后早期表現(xiàn)為神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞大量變性、死亡，而早期腦損傷并非影響病人預(yù)后的唯一因素，更多學(xué)者關(guān)注TBI后繼發(fā)性炎癥性腦損傷，發(fā)現(xiàn)TBI后激活的小膠質(zhì)細(xì)胞釋放炎性因子，啟動炎性反應(yīng)及放大反應(yīng)，導(dǎo)致腦組織進(jìn)一步損傷，而TLRS信號通路在其中起著重要作用[1-2]。

TLRS作為主要的固有免疫受體類型，在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答和啟動繼發(fā)性損傷中發(fā)揮關(guān)鍵作用[6]。有學(xué)者報道[7]TLRs通過結(jié)合相應(yīng)的配體，激活NF-κB，使巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞釋放炎性因子與炎性趨化因子。目前文獻(xiàn)報道比較多的是TLR4,作為TLRs家族中的重要成員，在TBI繼發(fā)性損傷中發(fā)揮關(guān)鍵作用[8-9]。有學(xué)者通過實(shí)驗(yàn)性腦出血模型證明TLR2是炎癥性腦損傷的重要啟動因子[2]，但在腦外傷中是否存在類似作用未見報道。

芝麻素具有抗炎癥、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞等重要作用，近來引起較多學(xué)者關(guān)注。AHMAD等[10]通過腦缺血動物實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)芝麻素可以降低炎癥因子的表達(dá)。為了驗(yàn)證芝麻素在腦出血后的保護(hù)作用，蘇作鵬等[11]通過出血性鼠模型研究，發(fā)現(xiàn)芝麻素能夠保護(hù)血-腦屏障的完整性，減輕腦水腫，減輕炎癥反應(yīng)。那么，芝麻素是否在腦外傷后發(fā)揮腦保護(hù)作用值得研究。

本組實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)腦外傷組小鼠損傷側(cè)腦水含量較假手術(shù)組顯著升高，說明腦外傷后血-腦屏障破壞引起的細(xì)胞內(nèi)外水含量增多；與腦外傷組相比，芝麻素治療組的損傷側(cè)腦水含量明顯下降，顯示芝麻素可以減輕腦外傷后的腦水腫程度。與假手術(shù)組相比，腦外傷組中TLR2、IL-1β、IL-6和 TNF-α mRNA的表達(dá)水平明顯增高；而芝麻素治療組的 TLR2、IL-1β、IL-6和 TNF-α mRNA的表達(dá)水平低于腦外傷組。表明芝麻素可以降低腦外傷后炎癥因子的表達(dá)。由此我們得出，TBI后多種刺激信號(如血紅蛋白)激活相應(yīng)的固有免疫受體，特別是小膠質(zhì)細(xì)胞表面TLRs受體，啟動炎癥反應(yīng)，釋放大量炎性因子和炎癥趨化因子，在繼發(fā)性炎癥損傷中發(fā)揮重要作用，而芝麻素能夠減輕腦水腫和抑制炎癥因子的表達(dá)，取到保護(hù)腦損傷作用。

不同的TLR受體不僅可單獨(dú)識別各種內(nèi)源性及外源性配體，介導(dǎo)機(jī)體的免疫應(yīng)答，而且TLR之間也可形成不同的二聚體從而使炎癥反應(yīng)放大。FORSTNER等[2]發(fā)現(xiàn)Hb刺激產(chǎn)生的TLR2/TLR4二聚體在腦出血繼發(fā)性炎癥損傷的上游關(guān)鍵啟動環(huán)節(jié)發(fā)揮著重要的作用，如果干預(yù)該二聚體的行程，可能對腦出血具有明顯的治療效果，同時在理論上不會降低TLR2、TLR4本身的功能,因此，腦外傷后TLR2/TLR4二聚體是否發(fā)揮主導(dǎo)作用值得進(jìn)一步研究。通過本組實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)芝麻素對于TBI后腦損傷具有保護(hù)作用，未來為TBI后的治療提供一種更好選擇。