葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)及其應(yīng)用進(jìn)展

劉佳音 李儒劍 齊雙慧 孫艷君 尹曉佳 米鐵柱 李繼明

摘要?葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)是獨(dú)立于細(xì)胞核遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)之外的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，為植物導(dǎo)入外源基因提供了新的途徑。葉綠體轉(zhuǎn)化具有細(xì)胞核轉(zhuǎn)化所沒(méi)有的優(yōu)點(diǎn)，隨著葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用，其優(yōu)越性也逐漸得到認(rèn)同。從葉綠體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的原理、發(fā)展歷程、特點(diǎn)以及葉綠體轉(zhuǎn)化的方法及其應(yīng)用領(lǐng)域等方面進(jìn)行總結(jié)，并對(duì)其未來(lái)的研究進(jìn)行展望。

關(guān)鍵詞?葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化，基因槍，母系遺傳，定點(diǎn)整合

中圖分類號(hào)?Q943文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼?A

文章編號(hào)?0517-6611（2020）06-0016-04

Abstract??Chloroplast genetic transformation system is independent of nuclear genetic transformation system，which provides a new approach for plants to intergrate exogenous genes.Chloroplast transformation has advantages not found in nuclear transformation.With the development and application of chloroplast genetic transformation technology，its advantages are gradually recognized.The principles，development process，characteristics，methods and application fields of chloroplast transformation system were summarized，and its future research was prospected.

Key words?Chloroplast genetic transformation，Gene gun，Maternal inheritance，Sitespecific expression

自1983年煙草轉(zhuǎn)基因成功以來(lái)[1]，以轉(zhuǎn)基因?yàn)榇淼闹参锘蚬こ淘谵r(nóng)業(yè)、制藥工程等領(lǐng)域掀起了一場(chǎng)變革。然而，隨著研究的不斷深入，研究人員逐漸認(rèn)識(shí)到核轉(zhuǎn)化技術(shù)存在著一系列難以克服的缺點(diǎn)，較大的細(xì)胞核基因組、復(fù)雜的遺傳背景使得外源基因的插入整合位點(diǎn)及拷貝數(shù)難以控制和預(yù)測(cè)，造成轉(zhuǎn)化子中外源基因表達(dá)效率低下且在后代中不能實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定遺傳，同時(shí)容易出現(xiàn)各種位置效應(yīng)以及基因沉默、基因失活現(xiàn)象。再者，外源基因隨花粉飄散而發(fā)生漂移，環(huán)境安全難以保證等[2]。葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)則彌補(bǔ)了核轉(zhuǎn)化的缺陷。葉綠體（chloroplast）屬于質(zhì)體（plastid）的一種，廣泛存在于植物和真核藻類的細(xì)胞中，是細(xì)胞進(jìn)行光合作用的主要場(chǎng)所。葉綠體是半自主細(xì)胞器，其基因組與原核生物類似，每個(gè)細(xì)胞中含有10～100個(gè)不等的、大小在120～160 kb的裸露雙鏈閉合環(huán)狀DNA，一般由一對(duì)反向重復(fù)序列和大單拷貝區(qū)、小單拷貝區(qū)組成，每個(gè)葉綠體中基因組以成千上萬(wàn)個(gè)拷貝的形式存在，內(nèi)部堿基分布不均勻，功能相關(guān)的基因多以“多順?lè)醋印毙问酱嬖赱3]。高等植物葉綠體基因組編碼100個(gè)左右的基因，與大約3 000個(gè)核編碼蛋白一起，構(gòu)成了葉綠體的轉(zhuǎn)錄、翻譯系統(tǒng)，進(jìn)行包括光合作用、氨基酸和脂肪酸生物合成等在內(nèi)的復(fù)雜新陳代謝過(guò)程[4]。早在1988年，Boynton等[5]利用基因槍轟擊法實(shí)現(xiàn)了外源基因?qū)雴渭?xì)胞藻類的葉綠體，此后在種子植物煙草中也實(shí)現(xiàn)了葉綠體穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化[6]。葉綠體轉(zhuǎn)化技術(shù)相對(duì)于核轉(zhuǎn)化技術(shù)而言，目的基因表達(dá)極為高效，而且沒(méi)有位置效應(yīng)，不會(huì)產(chǎn)生基因沉默現(xiàn)象，同時(shí)其多順?lè)醋颖磉_(dá)、母性遺傳和安全性高的特點(diǎn)，使其在基礎(chǔ)研究和應(yīng)用生物技術(shù)領(lǐng)域展現(xiàn)了極高的價(jià)值，除煙草外，番茄[7]、馬鈴薯[8]、大豆[9]、萵苣[10-11]和模式作物擬南芥[12]等植物的葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化也取得了成功。筆者從葉綠體轉(zhuǎn)化技術(shù)系統(tǒng)的原理、特點(diǎn)、發(fā)展歷程及其應(yīng)用領(lǐng)域等方面進(jìn)行總結(jié)。

1?葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的原理和發(fā)展

1.1?葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的原理

葉綠體是綠色植物及真核藻類進(jìn)行光合作用的場(chǎng)所，光合作用合成的有機(jī)物是整個(gè)生物界最基本的能量來(lái)源。葉綠體通過(guò)光合作用實(shí)現(xiàn)氧氣生產(chǎn)、碳固定以及淀粉合成，同時(shí)進(jìn)行氨基酸、脂肪酸合成等重要生物反應(yīng)[13]。高等植物葉綠體基因組大小在120～160 kb，在每個(gè)細(xì)胞中含有1 000～10 000個(gè)拷貝[14]，一般典型的陸生植物的葉綠體基因組含有110～120個(gè)基因[15]。葉綠體是半自主性細(xì)胞器，受細(xì)胞核的控制，同時(shí)也能進(jìn)行自我復(fù)制，大多數(shù)被子植物葉綠體的遺傳為母系遺傳，因此非常適合轉(zhuǎn)化。

葉綠體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)主要采用同源重組機(jī)制和位點(diǎn)特異性整合2種方式進(jìn)行轉(zhuǎn)化[16]。同源重組方式是通過(guò)同源重組，將目的DNA片段特異性插入到葉綠體基因組的某一位點(diǎn)中，該技術(shù)的原理是在載體構(gòu)建過(guò)程中于外源DNA片段兩側(cè)連接一段與受體葉綠體基因組插入位點(diǎn)兩側(cè)片段同源的DNA序列，載體導(dǎo)入葉綠體后，目的DNA兩側(cè)的同源片段與葉綠體基因組發(fā)生同源重組，目標(biāo)片段特異性整合到葉綠體基因組中的設(shè)計(jì)插入位點(diǎn)中。外源基因的位點(diǎn)特異性插入既不會(huì)造成葉綠體基因組序列的丟失和破壞，又不會(huì)影響原有基因的功能，避免了位置效應(yīng)，有利于基因的穩(wěn)定遺傳和表達(dá)。噬菌體phiC31介導(dǎo)的位點(diǎn)特異性整合法主要基于特異性整合酶（INT）能夠介導(dǎo)噬菌體attP與細(xì)菌attB位點(diǎn)之間整合的原理[17]，首先通過(guò)同源重組將細(xì)菌attB位點(diǎn)整合到葉綠體基因組的特定位點(diǎn)中，之后以該轉(zhuǎn)基因株系為下一步遺傳轉(zhuǎn)化的受體，在INT酶的介導(dǎo)下實(shí)現(xiàn)帶有attP位點(diǎn)的質(zhì)粒與葉綠體基因組中attB位點(diǎn)的整合，將目的基因插入到葉綠體基因組中[18]，這種方法提高了外源基因向葉綠體基因組的整合效率。

1.2?葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的發(fā)展

葉綠體轉(zhuǎn)化技術(shù)的研究瓶頸往往在如何將目的基因定向?qū)肴~綠體和如何實(shí)現(xiàn)同質(zhì)化上。葉綠體基因組以多拷貝的形式存在于植物葉綠體中，目前還沒(méi)有辦法實(shí)現(xiàn)通過(guò)一次性操作使所有葉綠體基因組帶有目的基因。在進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化前降低葉綠體基因組的拷貝數(shù)或選擇致死型突變體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化能夠在一定程度上提高葉綠體轉(zhuǎn)化的成功率，但實(shí)現(xiàn)同質(zhì)化最常用的方法為高篩選壓下的多代篩選，因此確定合適的篩選標(biāo)記基因?qū)θ~綠體轉(zhuǎn)化的同質(zhì)化進(jìn)程非常關(guān)鍵。Michel等[19]將aadA基因作為篩選標(biāo)記基因進(jìn)行衣藻葉綠體轉(zhuǎn)化，獲得的衣藻轉(zhuǎn)化子具備壯觀霉素和鏈霉素抗性，Svab等[20]將16SrRNA的突變體基因作為轉(zhuǎn)化煙草葉綠體的篩選標(biāo)記用于葉綠體轉(zhuǎn)化中的抗性篩選，獲得的再生植株表現(xiàn)出對(duì)鏈霉素的抗性，Huang等[21]報(bào)道了基因aphA6為卡那霉素抗性基因。盡管抗生素篩選標(biāo)記基因的應(yīng)用已日趨成熟，但也存在很大的弊端。為了解決這一問(wèn)題，科學(xué)家在葉綠體轉(zhuǎn)化研究中探索了一系列非抗生素抗性基因用作篩選標(biāo)記。Daniell等[22]在葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化中將菠菜中的甜菜堿醛脫氫酶基因作為篩選標(biāo)記基因，細(xì)菌的Bar基因、β-葡萄糖醛酸酶基因（GUS）、氯霉素乙酰基轉(zhuǎn)移酶基因（CAT）和綠色熒光蛋白基因（GFP）作為報(bào)告基因也用于葉綠體的遺傳轉(zhuǎn)化中，其中綠色熒光蛋白基因（GFP）表達(dá)產(chǎn)生的綠色熒光蛋白可以直接在活體中進(jìn)行檢測(cè)。

葉綠體轉(zhuǎn)化應(yīng)用廣泛，科研人員正致力于在模式植物及重要農(nóng)作物中實(shí)現(xiàn)葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化。然而葉綠體轉(zhuǎn)化在植物中的實(shí)現(xiàn)和推廣非常困難，僅有少數(shù)離體培養(yǎng)存活性和再生性較好的植物獲得了轉(zhuǎn)化植株，包括幾種茄科植物、萵苣、楊樹(shù)等[23-24]。對(duì)模式植物擬南芥而言，葉綠體轉(zhuǎn)化后的再生植株常表現(xiàn)雄性不育或雌性不孕，盡管有的研究在一定程度上提高了擬南芥葉綠體轉(zhuǎn)化的效率，但育性問(wèn)題尚未解決[25]。

2?葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的特點(diǎn)

葉綠體轉(zhuǎn)化技術(shù)與核轉(zhuǎn)化技術(shù)相比具有以下多方面的優(yōu)點(diǎn)。

2.1?定點(diǎn)整合、表達(dá)高效

在葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化載體構(gòu)建過(guò)程中，根據(jù)設(shè)計(jì)的同源片段，能夠?qū)崿F(xiàn)外源基因在葉綠體基因組上的定點(diǎn)插入，這避免了核轉(zhuǎn)化中外源基因的隨機(jī)整合造成的位置效應(yīng)、基因沉默以及順式失活等問(wèn)題。此外，由于葉綠體基因組在葉綠體中以較高拷貝數(shù)形式存在，相應(yīng)地，外源基因整合到葉綠體基因組后也會(huì)有大量拷貝，極大提高了外源基因的表達(dá)量。

2.2?多順?lè)醋颖磉_(dá)?葉綠體基因的表達(dá)模式類似原核生物，一個(gè)啟動(dòng)子可以啟動(dòng)多個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄，為多順?lè)醋颖磉_(dá)模式。這種表達(dá)模式為一次性轉(zhuǎn)化多個(gè)基因提供了可能。

2.3?遺傳穩(wěn)定、安全性高?經(jīng)過(guò)葉綠體轉(zhuǎn)化獲得的再生植株，外源基因隨葉綠體基因組進(jìn)行母性遺傳，因此后代性狀不會(huì)發(fā)生分離，使得這種純系能夠一直保持。另外，外源基因不會(huì)存在于花粉中，不存在花粉漂移的現(xiàn)象，避免了轉(zhuǎn)基因?qū)Νh(huán)境帶來(lái)的污染。所以在轉(zhuǎn)基因生物安全的角度上，葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物不存在外源基因隨花粉擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)，是符合安全要求的。

2.4?便于操作，對(duì)細(xì)胞影響小?葉綠體基因組小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，同時(shí)，由于葉綠體雙層脂質(zhì)膜的存在使外源基因表達(dá)的外源蛋白不會(huì)釋放到細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中，避免了外源基因表達(dá)對(duì)細(xì)胞造成的不利影響。

3?葉綠體轉(zhuǎn)化的方法

將外源基因?qū)肴~綠體的常用方法包括基因槍法、聚乙二醇（PEG）介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法、花粉管導(dǎo)入法、顯微及激光注射法以及納米基因載體介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法等。

3.1?基因槍法

利用基因槍進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的方法開(kāi)始于20世紀(jì)80年代，基因槍的出現(xiàn)促進(jìn)了核轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，尤其是多基因共轉(zhuǎn)化，同時(shí)基因槍轉(zhuǎn)化也是葉綠體轉(zhuǎn)化領(lǐng)域應(yīng)用最多、最有效的方法。其原理是將外源DNA黏附在金屬顆粒表面，然后在高壓動(dòng)力作用下將金屬顆粒轟擊受體細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)外源DNA向細(xì)胞的導(dǎo)入?；驑屴D(zhuǎn)化法不受物種與基因型限制，基因槍轟擊后的植物組織可以迅速完成再生分化獲得植株。目前報(bào)道的大多數(shù)葉綠體轉(zhuǎn)化成功的案例都是通過(guò)基因槍轉(zhuǎn)化法實(shí)現(xiàn)的。

Ruf等[26]結(jié)合對(duì)核基因的基因編輯技術(shù)，開(kāi)發(fā)了一種高效穩(wěn)定的葉綠體轉(zhuǎn)化方法，該研究首先通過(guò)CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)敲除核基因組中的一個(gè)抑制葉綠體基因翻譯的基因ACC2，獲得的植株在葉綠體轉(zhuǎn)化過(guò)程中對(duì)奇霉素抗性的敏感性增強(qiáng)，利用靶向擬南芥葉綠體載體pCH8，通過(guò)基因槍轉(zhuǎn)化根系愈傷組織，奇霉素篩選，獲得了葉綠體轉(zhuǎn)基因植株，且通過(guò)與野生型的正反交試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)奇霉素抗性能夠通過(guò)母性遺傳在后代中保留。但有研究表明基因槍轉(zhuǎn)化會(huì)對(duì)受體基因組造成破壞，包括染色體截短、大片段缺失和染色體斷裂-融合-橋循環(huán)等損傷[27]。

3.2?PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法?PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法常作為基因槍轉(zhuǎn)化法的替代方法[28]，該方法不受專利保護(hù)，不需要昂貴的設(shè)備，但對(duì)技術(shù)要求較高，更費(fèi)時(shí)費(fèi)力。該方法的原理是：除去細(xì)胞壁的植物細(xì)胞原生質(zhì)體在PEG的作用下細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生重構(gòu)，原生質(zhì)體縮水，在細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生不可逆破壞前去除PEG，則細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)將恢復(fù)原來(lái)的狀態(tài)，外源DNA在這一過(guò)程中有機(jī)會(huì)進(jìn)入植物細(xì)胞以及質(zhì)體中，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化。PEG介導(dǎo)的葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化依賴于成熟的原生質(zhì)體再生體系，目前已在煙草[29]、番茄[30]、花椰菜[31]、萵苣[32]等植物中取得成功。

3.3?花粉管導(dǎo)入法?pabA基因是來(lái)源于龍葵的抗阿特拉津基因。劉博林等[33]將含有pabA基因的pBR322質(zhì)粒通過(guò)花粉管通道注入大豆子房中，得到的后代具有阿特拉津抗性。在后代的葉綠體中成功檢測(cè)到pBR322 DNA的存在，但沒(méi)有證明外源基因是否整合在葉綠體基因組中。

3.4?顯微及激光注射法

Weber[34]報(bào)道了一種通過(guò)激光照射進(jìn)行葉綠體轉(zhuǎn)化的方法。將油菜離體葉綠體置于DNA溶液中并用波長(zhǎng)為343 nm的激光照射，觀察到葉綠體膜上出現(xiàn)了小洞并持續(xù)存在了112 s，通過(guò)后續(xù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)外源DNA已經(jīng)進(jìn)入到葉綠體中。該方法盡管能夠?qū)崿F(xiàn)將外源DNA向葉綠體中的導(dǎo)入，但利用激光照射法直接照射細(xì)胞、組織或器官進(jìn)行葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化的方法鮮見(jiàn)報(bào)道。

3.5?納米基因載體介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化

納米材料具有化學(xué)、熱力學(xué)性能穩(wěn)定、粒徑小、比表面積大等特性，可作為DNA甚至蛋白質(zhì)的載體用于動(dòng)植物遺傳轉(zhuǎn)化。納米材料介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化在動(dòng)物中應(yīng)用廣泛，但由于植物細(xì)胞壁的存在使得該技術(shù)在植物遺傳轉(zhuǎn)化的應(yīng)用中受到了一定限制。納米基因載體與病毒載體不同，其沒(méi)有毒性或毒性很低，容易被細(xì)胞接受，同時(shí)可通過(guò)對(duì)其表面官能團(tuán)進(jìn)行修飾，使其在基因傳輸過(guò)程中的靶向性增強(qiáng)[35-36]。此外，與基因槍相比，納米載體所能攜帶的分子不僅限于DNA，可以實(shí)現(xiàn)RNA、蛋白質(zhì)等其他生物大分子的遞送[37]。納米載體介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化適用于大多數(shù)植物，且可以實(shí)現(xiàn)將生物大分子直接向植物成熟組織的遞送，因此避免了繁瑣的再生分化步驟。Torney等[38]報(bào)道了一種利用介孔二氧化硅納米材料 （mesoporous silica nanoparticle，MSN）向植物離體細(xì)胞或正常組織者遞送DNA的方法，通過(guò)將含有GFP的質(zhì)粒裝載到MSN系統(tǒng)中，并用納米金材料包裹，利用基因槍轟擊煙草子葉后，成功檢測(cè)到了熒光信號(hào)。

Kwak等[39]在納米材料向植物葉綠體中遞送DNA的研究中取得了突破進(jìn)展。利用一種由殼聚糖復(fù)合單壁碳納米管（chitosan-complexed single-walled carbon nanotubes，CS-SWNTs ）組成的納米顆粒，將外源DNA定向地導(dǎo)入到植物葉綠體中，開(kāi)創(chuàng)了葉綠體轉(zhuǎn)化的新方法。該納米材料攜帶正電荷，可松散結(jié)合帶有負(fù)電荷的質(zhì)粒DNA，形成pDNA-SWNT復(fù)合物。pDNA-SWNT復(fù)合物通過(guò)葉片氣孔進(jìn)入葉片內(nèi)部，復(fù)合物在脂質(zhì)交換膜滲透（lipid exchange envelope penetration，LEEP）機(jī)制下能夠穿越細(xì)胞壁、細(xì)胞膜以及葉綠體的雙層脂質(zhì)膜，進(jìn)入葉綠體中，在葉綠體基質(zhì)的弱酸性環(huán)境下，質(zhì)粒DNA釋放并進(jìn)一步表達(dá)。該方法不需要額外的試劑和設(shè)備，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了外源DNA向蕓芥、豆瓣菜、煙草和菠菜以及擬南芥葉肉原生質(zhì)體葉綠體的遞送和瞬時(shí)表達(dá)。

4?葉綠體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的應(yīng)用

自單細(xì)胞藻類及種子植物煙草實(shí)現(xiàn)了葉綠體穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化以來(lái)，遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)在基礎(chǔ)研究和應(yīng)用生物技術(shù)研究領(lǐng)域展現(xiàn)了極高的價(jià)值，在為研究細(xì)胞內(nèi)質(zhì)體基因的表達(dá)調(diào)控和功能、核質(zhì)互作提供了方法的同時(shí)，也為分子農(nóng)業(yè)和作物改良開(kāi)辟了新道路。

質(zhì)體被稱為植物細(xì)胞的“生物合成中心”，很多代謝反應(yīng)在質(zhì)體中進(jìn)行。由于葉綠體具有很多優(yōu)點(diǎn)，為葉綠體基因工程應(yīng)用于作物性狀改良提供了條件，并且已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了作物在抗除草劑[40-41]、抗蟲(chóng)[42]、抗病[43]、耐鹽[44]等上的應(yīng)用。將抗蟲(chóng)基因轉(zhuǎn)化葉綠體，能夠?qū)崿F(xiàn)其在葉綠體中的大量高效表達(dá)，Kota等[45]和Cosa等[46]研究表明，在葉綠體轉(zhuǎn)化中不需要對(duì)Cry基因的序列進(jìn)行任何調(diào)整便可使其葉綠體中正常表達(dá)。Chakrabarti等[47]研究表明，質(zhì)體中的Cry9Aa2基因表達(dá)的殺蟲(chóng)蛋白含量很高，但超過(guò)細(xì)胞質(zhì)可溶蛋白的10%時(shí)，會(huì)對(duì)植物生長(zhǎng)起抑制作用。劉青青[48]又成功地將Cry基因?qū)氲酱蠖购陀筒酥?，這說(shuō)明葉綠體轉(zhuǎn)化技術(shù)在作物改良方面前景廣闊。通過(guò)葉綠體轉(zhuǎn)化將抗菌肽MSI299基因?qū)霟煵葜锌墒雇庠吹鞍椎谋磉_(dá)量占到可溶性蛋白總量的21.5%～43.0%[49]。將外源基因TPS1轉(zhuǎn)化葉綠體后，植物體內(nèi)產(chǎn)生的海藻糖含量比核轉(zhuǎn)化技術(shù)提高了25倍[50]。通過(guò)葉綠體轉(zhuǎn)化提高煙草抗除草劑能力在煙草中已經(jīng)獲得成功，質(zhì)體表達(dá)Bar基因蛋白可占到細(xì)胞可溶性蛋白的7%以上[51]。葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)以其眾多的優(yōu)點(diǎn)也在生物制藥上得到越來(lái)越多的應(yīng)用，尤其是在作為生物反應(yīng)器進(jìn)行食用結(jié)晶蛋白和人類藥用蛋白的生產(chǎn)等方面[52]，目前為止已經(jīng)用在生產(chǎn)疫苗類的霍亂毒素、破傷風(fēng)毒素、動(dòng)物疫苗等，醫(yī)療性蛋白如人類生長(zhǎng)素、胰島素類生長(zhǎng)因子等中。

葉綠體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立也為其自身研究和核質(zhì)互作研究提供新方法，如葉綠體中核糖體的組裝、葉綠體基因轉(zhuǎn)錄的研究以及葉綠體基因翻譯的研究等方面。然而，葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)也有其自身的缺點(diǎn)，限制了葉綠體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的應(yīng)用。

5?問(wèn)題與展望

葉綠體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)建立于20世紀(jì)80年代，經(jīng)過(guò)科學(xué)家的努力，近些年也取得了一些很大的發(fā)展，在擬南芥、油菜、水稻、馬鈴薯、生菜、胡蘿卜等植物中均有相關(guān)研究，但在高等植物中僅在煙草中獲得了穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因株系，葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)之所以沒(méi)有廣泛應(yīng)用于育種中主要原因如下：①葉綠體基因組序列信息的限制。目前具有完整的葉綠體基因組序列信息的植物非常少，大多數(shù)植物葉綠體基因組尚未測(cè)序，沒(méi)有公開(kāi)的基因組序列，在載體構(gòu)建過(guò)程中無(wú)法確定用于外源基因的插入的同源片段。②組織培養(yǎng)體系的限制。選擇合適的植物器官或組織片段作外植體是高效進(jìn)行葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化的一個(gè)關(guān)鍵方面。禾本科作物愈傷組織往往由幼穗或成熟胚經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)獲得，如果利用愈傷組織進(jìn)行葉綠體轉(zhuǎn)化，用于遺傳轉(zhuǎn)化的愈傷組織中不含有成熟葉綠體，而是葉綠體的前體前質(zhì)體，體積比葉綠體更小，更難以實(shí)現(xiàn)外源基因的導(dǎo)入，另外禾本科植物葉片較難進(jìn)行脫分化和再分化，這也是葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化較難進(jìn)行的一個(gè)原因。③轉(zhuǎn)化植株同質(zhì)化方法的限制。如果要獲得真正意義上的葉綠體轉(zhuǎn)化體就意味著在每個(gè)拷貝的質(zhì)體基因組中都必須有外源基因的存在。高效獲得葉綠體轉(zhuǎn)化事件的另一關(guān)鍵因素在于建立合適的篩選培養(yǎng)體系，采取相應(yīng)手段促進(jìn)高效篩選。目前采用的高篩選壓進(jìn)行多輪再生，以及在轉(zhuǎn)化前降低受體細(xì)胞中葉綠體DNA拷貝數(shù)都是耗時(shí)長(zhǎng)、操作復(fù)雜的過(guò)程。今后在一定時(shí)期內(nèi)葉綠體轉(zhuǎn)化迫切需要解決上述一系列問(wèn)題。

隨著對(duì)葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化的研究深入以及新材料、新技術(shù)在葉綠體轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用，將很有可能作為一個(gè)重要工具用于植物研究，也將推動(dòng)植物生物技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展。

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