基于NLRP3炎性小體通路探討金櫻子乙醇提取物對系膜增生性腎小球腎炎大鼠的保護(hù)作用①

林艷梅 彭慶海 陳 杰 林小小

(萍鄉(xiāng)市人民醫(yī)院藥物臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)，萍鄉(xiāng) 337000)

系膜增生性腎小球腎炎(mesenchymal prolifer-ative glomerulonephritis，MsPGN)屬于臨床常見腎小球病變疾病，MsPGN好發(fā)于青少年，其病隱匿，部分患者發(fā)展為終末期腎臟疾病[1]。MsPGN發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜，其中NALP3炎性體(NACHT-LRR-PYD-containing proteins-3,NALP3)的上調(diào)與MsPGN的發(fā)生密切相關(guān)[2]。金櫻子(Rosa laevigata michx.，RLM)屬于薔薇科植物，具有活血化瘀、消腫止痛、利尿補(bǔ)腎的功效，對腎炎、糖尿病腎病具有一定的改善作用[3,4]，推測其對MsPGN可能也具有一定的作用。本研究通過復(fù)制MsPGN大鼠模型，并給予金櫻子乙醇提取物治療，旨在探究其對MsPGN大鼠腎臟的保護(hù)作用，并初步探究其可能的作用機(jī)制，為MsPGN治療提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物 8周齡SPF級SD大鼠，體質(zhì)量200～220 g，購自河南省實(shí)驗(yàn)動物中心，動物許可證號：SCXK(豫)2018-0003。所有大鼠統(tǒng)一飼養(yǎng)在溫度18～22℃，濕度45%～60%，良好通風(fēng)環(huán)境內(nèi)，飼養(yǎng)期間大鼠自由攝食、飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行模型制備。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 金櫻子購自南寧醫(yī)藥有限公司；醋酸潑尼松購自天津天藥藥業(yè)股份有限公司，批號：180224；牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)購自北京Solarbio公司，貨號：A8020；IL-1β和IL-18 ELISA檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所，貨號C013-2，C011-2；RIPA裂解液、蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所，貨號：C0105、P0013B；鼠抗NLRP3、ASC、caspase-1抗體購自美國CST公司，貨號15101，17507，24232；HRP標(biāo)記IgG抗體、β-actin購自美國Abcam公司，貨號ab205719，ab156302；免疫組化試劑盒購自上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司，貨號：TL-015-QHD；DxC全自動生化儀購自貝克曼庫爾特公司；1658001型垂直電泳儀、ChemiDoc XRS凝膠成像儀均購自美國Bio-Rad公司；CKX53光學(xué)顯微鏡購自奧林巴斯公司。

1.2方法

1.2.1動物模型制備 參考文獻(xiàn)[5]復(fù)制MsPGN大鼠，隨機(jī)挑選73只大鼠進(jìn)行造模，腹腔注射0.3 ml/100 g 10%水合氯醛，經(jīng)背切除左腎，休養(yǎng)7 d后皮下注射BSA/弗式完全佐劑混合液(比例3 mg∶1 ml)，1周末、2周末再次加強(qiáng)注射，3周末連續(xù)注射BSA，劑量分別為0.5 mg、1 mg、1.5 mg、3 mg，共注射4次，每次間隔1 h，次日注射2 mg BSA。第4周開始腹腔、尾靜脈交替注射BSA，尾靜脈注射起始劑量為0.5 mg，每次增加0.5 mg，當(dāng)注射劑量為2.5 mg后每周增加0.5 mg，到每次劑量為5 mg。腹腔注射劑量為尾靜脈的2倍，至劑量10 mg為止。模型結(jié)束后1周收集大鼠24 h尿液檢測，尿蛋白陽性代表模型復(fù)制成功，本次3只大鼠造模未成功，死亡10只，共60只造模成功。另設(shè)置假手術(shù)組(Sham)12只，麻醉處理后僅暴露左腎，其他處理與模型組相同。

1.2.2動物分組與給藥 金櫻子乙醇提取物制備：將金櫻子果實(shí)切碎，去除種子，干燥處理，將2 kg干燥后的金櫻子果實(shí)置于80%食用乙醇溶液中浸潤24 h，過濾后減壓回收得到100 mg/L金櫻子乙醇提取液。造模后MsPGN大鼠分為5組，模型組(MsPGN)、金櫻子乙醇提取物低、中、高劑量組(RLM-L、RLM-M、RLM-H)、醋酸潑尼松組(Prednis-one acetate)，每組12只。RLM-L、RLM-M、RLM-H組：模型制備結(jié)束后，灌胃金櫻子乙醇提取液，劑量分別為2、4、8 mg/(kg·d)[6]，連續(xù)給藥4周。陽性藥物組(醋酸潑尼松組，Prednisone acetate)：模型制備結(jié)束后，灌胃劑量為5 mg/(kg·d)[7]，連續(xù)4周。Sham、MsPGN組大鼠灌胃等量生理鹽水，連續(xù)4周。

1.2.3觀察指標(biāo)與檢測方法

1.2.3.1樣本收集 末次給藥結(jié)束后采集各組大鼠24 h尿液，麻醉處死大鼠后，收集血液，獲得腎臟，一部分組織用4%多聚甲醛固定；另一部分置于-80℃保存。

1.2.3.224 h蛋白尿量測定 將尿液3 000 r/min離心10 min，收集上清，采取考馬斯亮藍(lán)法檢測24 h尿蛋白量，雙縮脲法檢測總蛋白(TP)水平；微量酶標(biāo)儀法檢測血清白蛋白(ALB)水平。

1.2.3.3血清中生化指標(biāo)檢測 采用肌氨酸氧化酶法檢測血清肌酐(serum creatinine,Scr)水平，二乙酰肟法檢測尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)水平。

1.2.3.4HE染色觀察大鼠腎組織病理形態(tài)學(xué)變化 常規(guī)制備腎組織石蠟切片，烘烤后、脫蠟脫水，依據(jù)HE染色試劑盒對腎組織石蠟切片進(jìn)行染色，經(jīng)脫水、透明處理后，置于光學(xué)顯微鏡下觀察組織變化情況。參考文獻(xiàn)[7]對腎組織損傷情況進(jìn)行評估，主要包括腎小球、腎小管病理形態(tài)學(xué)，根據(jù)系膜分布、增生情況將腎小球損傷分為4個等級評分為0～3分；腎小管間質(zhì)損傷比例評分為0～4分。

1.2.3.5蛋白免疫印跡法(Western blot，WB)檢測腎組織中NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表達(dá) 取出保存腎臟組織，使用RIPA蛋白提取試劑裂解腎臟組織，提取蛋白質(zhì)。4℃經(jīng)100 g/L SDS-PAGE分離蛋白，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜反應(yīng)后于脫脂牛奶中封閉1 h，添加NLRP3、ASC、caspase-1一抗(1∶300稀釋)，4℃孵育過夜；添加二抗(1∶5 000稀釋)，室溫孵育1 h，經(jīng)ECL發(fā)光顯色，采用Life Technologies Quantity One軟件定量各蛋白相對表達(dá)量。

1.2.3.6免疫組化檢測腎組織中NLRP3、ASC、caspase-1蛋白陽性表達(dá) 切片脫蠟脫水后置于檸檬酸鈉溶液中進(jìn)行抗原修復(fù)，3%過氧化氫溶液中進(jìn)行內(nèi)源過氧化酶活性消除，經(jīng)山羊血清封閉后添加NLRP3、ASC、caspase-1一抗4℃孵育過夜，與堿性磷酸酶(AP)偶聯(lián)的IgG二抗室溫孵育1 h，清洗后，添加 DAB溶液，在顯微鏡下觀察直至切片顯色，利用Image軟件評估NLRP3、ASC、caspase-1蛋白陽性表達(dá)情況。

1.2.3.7腎組織IL-1β和IL-18水平檢測 取1 g腎組織添加9 ml生理鹽水于玻璃勻漿器中研磨，12 000 r/min 離心20 min，取上清，采用ELISA檢測IL-1β和IL-18含量，嚴(yán)格參照ELISA試劑盒說明書操作。

2 結(jié)果

2.1金櫻子乙醇提取物對MsPGN大鼠一般情況的影響 Sham組大鼠飲水、毛發(fā)、精神狀況良好；MsPGN組大鼠毛發(fā)干枯，活動量減少，精神不振；經(jīng)不同劑量RLM、Prednisone acetate干預(yù)后毛發(fā)逐漸恢復(fù)光澤度，飲食、活動量有所增加，反應(yīng)靈敏。與Sham組相比，MsPGN組大鼠體重顯著降低(P<0.05)；與MsPGN組相比，RLM-L、RLM-M、RLM-H、Prednisone acetate組大鼠體重顯著升高(P<0.05)，見表1。

2.2金櫻子乙醇提取物對大鼠腎功能的保護(hù) 與Sham組相比，MsPGN組大鼠24 h尿蛋白、血清BUN、Scr水平顯著升高，TP、ALB水平顯著降低(P<0.05)；與MsPGN組相比，RLM-L、RLM-M、RLM-H、Prednisone acetate組大鼠24 h尿蛋白、血清BUN、Scr水平顯著降低，TP、ALB水平顯著升高(P<0.05)，見表2。

2.3金櫻子乙醇提取物對MsPGN大鼠腎組織形態(tài)學(xué)的影響 HE染色顯示Sham組腎小管、腎小球形態(tài)、結(jié)構(gòu)正常，未出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤；MsPGN組腎間質(zhì)出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤，血管壁增厚，炎癥周圍可見增生膠原，腎小管有明顯蛋白管型，腎小球可見炎性細(xì)胞，系膜區(qū)增寬，系膜細(xì)胞增生，見圖1。與MsPGN組相比，給藥組腎間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤數(shù)減少，血管壁變薄，腎小球可見炎性細(xì)胞數(shù)減少，系膜區(qū)變窄，系膜增生減少。其中金櫻子乙醇提取物高劑量組、Prednisone acetate組改善較明顯。與Sham組相比，MsPGN組腎組織損傷評分顯著升高(P<0.05)； 與MsPGN組相比，RLM各組、Prednisone acetate組腎組織損傷評分顯著降低(P<0.05)，見表3。

Tab.1 Comparison of body weight of rats in each group

GroupsBody weight(g)Sham group464.56±19.32MsPGN group423.17±13.781)RLM-L group435.81±14.261)2)RLM-M group440.37±15.011)2)RLM-H group445.56±13.271)2)Prednisone acetate group446.74±14.611)2)

Note：Compared with sham group,1)P<0.05；compared with MsPGN group，2)P<0.05.

GroupsBUN(mmol/L)Scr(μmol/L)24 h urinary protein(mg)TP(g/L)ALB(g/L)Sham group3.76±0.6445.33±6.875.52±0.3162.54±4.3838.76±1.64MsPGN group5.74±0.571)72.95±8.311)26.42±1.391)48.34±3.871)19.74±1.271)RLM-L group5.17±0.491)2)60.15±5.961)2)21.73±2.411)2)52.28±3.641)2)21.65±1.491)2)RLM-M group4.84±0.411)2)55.63±5.281)2)16.21±2.321)2)54.69±3.491)2)24.84±1.411)2)RLM-H group4.35±0.551)2)51.94±4.671)2)13.72±2.371)2)56.27±3.391)2)25.35±1.551)2)Prednisone acetate group4.26±0.421)2)45.75±5.741)2)10.66±1.511)2)57.61±3.621)2)27.26±1.381)2)

Note：Compared with sham group,1)P<0.05；compared with MsPGN group，2)P<0.05.

圖1 HE 染色觀察腎組織病理形態(tài)學(xué)變化(×400)Fig.1 Pathological and morphological changes of renal tissue observed by HE(×400)

GroupsTubulointerstitialinjury score(score)Glomerularinjury score(score)Sham group0.35±0.060.24±0.03MsPGN group3.04±0.161)2.82±0.491)RLM-L group2.37±0.181)2)2.44±0.652)RLM-M group1.54±0.191)2)1.76±0.512)RLM-H group1.26±0.221)2)1.28±0.242)Prednisone acetate group1.19±0.241)2)0.96±0.192)

Note：Compared with sham group,1)P<0.05；compared with MsPGN group，2)P<0.05.

圖2 Western blot檢測腎組織中NLRP3、ASC和caspase-1蛋白表達(dá)Fig.2 Expression of NLRP3,ASC and caspase-1 protein in renal tissue detected by Western blotNote: A.Sham group；B.MsPGN group；C.RLM-L group；D.RLM-M group；E.RLM-H group；F.Prednisone acetate group.

2.4金櫻子乙醇提取物對MsPGN大鼠腎組織中NLRP3炎性小體通路的影響

2.4.1金櫻子乙醇提取物對MsPGN大鼠腎組織中

GroupsNLRP3/β-actinASC/β-actincaspase-1/β-actinSham group0.14±0.030.18±0.040.20±0.04MsPGN group0.86±0.091)1.13±0.121)1.06±0.151)RLM-L group0.48±0.071)2)0.74±0.071)2)0.65±0.081)2)RLM-M group0.37±0.051)2)0.67±0.081)2)0.56±0.071)2)RLM-H group0.25±0.041)2)0.48±0.081)2)0.42±0.051)2)Prednisone acetate group0.21±0.031)2)0.45±0.051)2)0.33±0.041)2)

Note：Compared with sham group,1)P<0.05；compared with MsPGN group，2)P<0.05.

圖3 免疫組化檢測腎組織中NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表達(dá)(×200)Fig.3 Expression of NLRP3,ASC and caspase-1 protein in renal tissue detected by immunohistochemistry(×200)

GroupsNLRP3ASCcaspase-1Sham group11.26±2.3515.64±3.9415.66±3.79MsPGN group57.38±8.651)61.69±7.961)55.36±5.681)RLM-L group43.68±6.671)2)47.39±6.311)2)41.67±4.691)2)RLM-M group32.37±4.951)2)34.66±5.371)2)33.29±3.261)2)RLM-H group28.66±4.371)2)29.64±3.221)2)27.26±3.181)2)Prednisone acetate group25.26±3.351)2)25.64±3.941)2)24.66±3.791)2)

Note：Compared with sham group,1)P<0.05；compared with MsPGN group，2)P<0.05.

NLRP3、ASC和caspase-1蛋白表達(dá) 與Sham組相比，MsPGN組腎組織中NLRP3、ASC和caspase-1蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)。與MsPGN組相比，RLM各組、Prednisone acetate組腎組織中NLRP3、ASC和caspase-1蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，見圖2、表4。

2.4.2金櫻子乙醇提取物對MsPGN大鼠腎組織中NLRP3、ASC和caspase-1陽性表達(dá)的影響 與Sham組相比，MsPGN組腎組織中NLRP3、ASC和caspase-1蛋白陽性表達(dá)率顯著升高(P<0.05)。

GroupsIL-1β(pg/ml)IL-18(pg/ml)Sham group15.03±2.0514.34±3.11MsPGN group163.74±28.461)179.28±22.651)RLM-L group136.25±16.341)2)132.47±19.321)2)RLM-M group104.53±15.481)2)83.62±15.441)2)RLM-H group80.39±11.651)2)68.56±5.071)2)Prednisone acetate group74.47±11.161)2)62.66±5.511)2)

Note：Compared with sham group,1)P<0.05；compared with MsPGN group，2)P<0.05.

與MsPGN組相比，RLM各組、Prednisone acetate組腎組織中NLRP3、ASC和caspase-1蛋白陽性表達(dá)率顯著降低(P<0.05),見圖3，表5。

2.5金櫻子乙醇提取物對NLRP3炎性小體通路下游炎性因子的影響 與Sham組相比，MsPGN組組織勻漿中IL-1β、IL-18水平顯著升高(P<0.05)。與MsPGN組相比，RLM各組、Prednisone acetate組組織勻漿中IL-1β、IL-18水平顯著降低(P<0.05)，見表6。

3 討論

MsPGN病理特征主要表現(xiàn)為系膜基質(zhì)增多、系膜細(xì)胞增生等。以往研究顯示大鼠連續(xù)皮下注射高濃度BSA能夠加速免疫復(fù)合物介導(dǎo)腎炎的形成，該模型制備法具有造模成功率高、實(shí)用性強(qiáng)、周期短，與人腎小球腎炎發(fā)生過程相似程度高等優(yōu)點(diǎn)[8]。尿蛋白為MsPGN患者臨床表現(xiàn)之一，當(dāng)腎臟基底膜受損后，腎小球?yàn)V膜通透性增加，造成蛋白尿滲出，而蛋白量超出腎小管重吸收后，就會形成蛋白尿；此外腎臟受損后血液中的BUN、Scr無法排出體外造成水平升高[9]。本研究采用改良慢性病性血清法制備MsPGN大鼠，結(jié)果顯示與Sham組相比，大鼠體重降低，24 h尿蛋白、BUN、Scr水平升高，腎小管伴有充血、腫脹，腎組織細(xì)胞變性，腎小球基底膜增厚，出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤，提示MsPGN大鼠腎組織受損、腎功能受損，與過往研究相符[10]，提示MsPGN模型復(fù)制成功。正常生理狀態(tài)下機(jī)體內(nèi)大分子物質(zhì)不能透過腎小球?yàn)V膜，當(dāng)濾膜損傷后，血液中TP、ALB均會排出體外形成蛋白尿，因此兩者可以反映腎小球損傷情況[11]。本研究發(fā)現(xiàn)與Sham組相比，MsPGN組大鼠尿液中TP、ALB水平顯著升高，提示腎小球受損、腎功能障礙。

金櫻子為嶺南特色中藥，其果實(shí)具有利尿、補(bǔ)腎功效，葉子具有消腫解毒功效，根莖具有活血散瘀、祛風(fēng)除濕、固精澀腸之功效，藥理學(xué)研究顯示其具有降血糖、抗氧化、抗腫瘤的活性[12]?；A(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)對糖尿病腎病、腎炎大鼠腎功能具有保護(hù)作用[13]。然而其是否對MsPGN大鼠腎臟具有保護(hù)作用，目前尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)金櫻子乙醇提取物治療后能夠改善腎組織損傷，降低尿液中24 h尿蛋白量，升高TP、ALB水平，降低血清中 BUN、Scr水平，提示金櫻子乙醇提取物可能通過緩解腎組織損傷發(fā)揮對腎功能的保護(hù)。

NLRP3炎性小體在調(diào)控機(jī)體炎性反應(yīng)及自身免疫疾病中發(fā)揮重要作用。近期研究發(fā)現(xiàn)NLRP3炎性小體參與腎病的發(fā)生發(fā)展過程[14,15]。已有研究證實(shí)，正常腎臟組織中NLRP3 mRNA、蛋白表達(dá)較少，而在腎臟疾病組織中NLRP3表達(dá)明顯升高，提示NLRP3炎性小體可能參與腎病的發(fā)生[16]。另外，有文獻(xiàn)報道NLRP3炎性小體通路激活后可促進(jìn)腎損傷中重要炎癥介質(zhì)IL-1β、IL-6，進(jìn)而參與腎損傷發(fā)生發(fā)展[17]。Wang等[18]研究顯示抑制NLRP3炎癥小體活化能夠減輕慢性腎病患者的腎損傷和纖維化。此外有研究表明，caspase-1蛋白酶抑制劑及NLRP3敲除能夠抑制敗血癥引發(fā)的急性腎損傷中的中性粒細(xì)胞浸潤[19]。然而，NLRP3炎性小體在MsPGN大鼠腎組織損傷中的作用尚未有研究。本研究發(fā)現(xiàn)，與Sham組相比，MsPGN組大鼠腎組織中NLRP3蛋白表達(dá)明顯升高，且腎組織中NLRP3陽性細(xì)胞表達(dá)率也明顯升高，經(jīng)金櫻子乙醇提取物治療后腎組織中NLRP3蛋白、NLRP3陽性細(xì)胞數(shù)量均顯著降低，推測NLRP3炎性小體可能參與MsPGN腎損傷發(fā)生，金櫻子乙醇提取物可通過抑制NLRP3表達(dá)緩解腎組織損傷。

當(dāng)受到炎癥信號刺激后，NALP3的LRR結(jié)構(gòu)能夠識別特定信號，暴露NACHT結(jié)構(gòu)域，使NALP3在ATP作用下發(fā)生聚合反應(yīng)形成NALP3蛋白寡聚體，同時招募ASC、caspase-1前體，經(jīng)切割后形成成熟的caspase-1，成熟后caspase-1能夠活化IL-1β、IL-18前體形成成熟的IL-1β、IL-18并分泌至胞外，這些細(xì)胞因子均能夠進(jìn)一步引發(fā)炎癥反應(yīng)，加重動物模型中的腎損傷[20]。本研究結(jié)果顯示，金櫻子乙醇提取物能夠抑制MsPGN大鼠腎組織中ASC、caspase-1蛋白表達(dá)，同時降低腎組織中ASC、caspase-1陽性細(xì)胞數(shù)量，進(jìn)一步對下游因子檢測發(fā)現(xiàn)金櫻子乙醇提取物能夠抑制NLRP3炎癥依賴性細(xì)胞因子IL-18、IL-1β升高，提示金櫻子乙醇提取物可能是通過抑制腎組織中NLRP3炎癥小體活化，進(jìn)而抑制caspase-1的成熟及炎性因子IL-1β、IL-18的分泌，發(fā)揮緩解腎組織損傷的作用。

綜上所述，金櫻子乙醇提取物對MsPGN大鼠腎組織損傷具有保護(hù)作用，這種作用可能通過抑制NLRP3炎性小體的活化，從而抑制通路介導(dǎo)的促炎介質(zhì)IL-1β和IL-18的分泌，最終緩解肺組織損傷。然而，本研究中金櫻子乙醇提取物僅能部分緩解腎功能損傷，并非完全逆轉(zhuǎn)組織損傷，這可能與藥物劑量相關(guān)，也有可能與其他途徑引起MsPGN大鼠腎組織損傷有關(guān)，因此還有待在后續(xù)深入探究，以期提供更充足的理論依據(jù)。