miR-146a-5p通過調(diào)控Notch2表達對心肌缺血再灌注模型大鼠心肌損傷的影響①

牛丹丹 劉 振 李方方

(新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院心電圖室，新鄉(xiāng) 453000)

心肌缺血再灌注(MI/R)是心肌細胞從可逆轉(zhuǎn)的缺血性損傷，血流恢復后轉(zhuǎn)變成不可逆轉(zhuǎn)的損傷的過程[1]。常發(fā)生于心肌梗死、心臟搭橋手術(shù)后，MI/R損傷涉及一系列復雜的病理機制，其中包括氧化應激、炎癥反應、心功能紊亂、鈣泵障礙、心肌細胞壞死和凋亡[2]，是治療缺血性心臟疾病的一大障礙。

近期的很多研究表明Notch信號通路與多種器官內(nèi)的缺血再灌注損傷有關(guān)[3,4]，該信號通路由一系列跨膜受體、對應的配體、修飾基因以及轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)成，調(diào)控細胞的增殖與分化[5]。研究發(fā)現(xiàn)，Notch2/hes-1信號通路在腎缺血再灌注損傷引起的炎癥和凋亡中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，通過DAPT抑制Notch信號通路關(guān)鍵蛋白酶γ-分泌酶的表達，下調(diào)Notch2/hes-1信號通路，可以顯著降低炎癥因子的表達，減少細胞凋亡[6]。Notch2在MI/R損傷中可能存在著相似的調(diào)控機制。

miRNA是一種由22個核苷酸組成的內(nèi)源非編碼RNA，已有超過2 000種miRNA在人體中被發(fā)現(xiàn)，并且調(diào)控了人類基因組中至少三分之一的基因。miRNA在很多人類疾病中都發(fā)揮著重要的作用，具有作為臨床診斷物和基因治療靶點的應用價值[7]。miR-146a-5p是miRNA的成員之一，已有很多文獻報道該基因在不同的疾病中發(fā)揮著重要的功能。既往研究報道了miR-146a-5p可以靶向作用于Notch2調(diào)控食管鱗狀腫瘤細胞的上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化[8]，在正常細胞中，miR-146a-5p可能通過類似的作用方式調(diào)控生長代謝或疾病進程。本研究通過構(gòu)建心肌缺血再灌注大鼠模型和培養(yǎng)大鼠心肌細胞，從體內(nèi)體外兩方面探究了miR-146a-5p和Notch2的作用關(guān)系及作用機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑 DMEM細胞培養(yǎng)液(貨號SH30022.01B)、牛胎血清(FBS)(貨號SH30070.03)購自美國Hyclone公司。Trizol試劑(貨號15596026)、TUNEL細胞凋亡試劑盒(貨號T2190)、MTT試劑盒(貨號M1020)、Hoechst染色試劑(貨號G3680)、RIPA裂解液(貨號R0020)、BCA試劑盒(貨號PC0020)、ECL顯色液(貨號SW2030)、免疫組化(IHC)試劑盒(SE134)購自北京索萊寶生物公司。肌酸激酶(creatine kinase,CK)(貨號A032)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoe-nzymes,CK-MB)(貨號H197)、血清乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)(貨號A020-1)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)(貨號A005)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)(貨號A003-1)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)(貨號A001-1-1)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。IL-6(貨號ml064292)、IL-1β(貨號ml037361)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)(貨號ml002859)試劑盒購自上海酶聯(lián)生物。烏拉坦(貨號U2500)購自Sigma-Aldrich公司。miRNA陰性對照、miR-146a-5p mimic購自上海吉瑪公司，Lipofectamin2000轉(zhuǎn)染試劑(貨號11668500)、pcDNA3.1(貨號V79020)購自Invitrogen公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號1708890)和SsoFastTMEva-Green?Supermix試劑盒(貨號172-5201)購自美國Bio-Rad公司。Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)(貨號ab32503)、B細胞淋巴瘤/白血病-2蛋白(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)(貨號ab196495)、Notch2(貨號ab8926)、Hes1(貨號ab108937)抗體購自Abcam生物公司。雙熒光素酶報告監(jiān)測系統(tǒng)(貨號E1910)購自美國Promega公司。所有引物采用Primer3 Input網(wǎng)站設計，由上海生工合成。

1.1.2實驗動物 40只健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量(200±20)g,購自廣東醫(yī)學實驗動物中心[SCXK(粵)2013-0002]，于恒溫恒濕、明暗交替的環(huán)境(12 h)喂養(yǎng)48 h。

1.2方法

1.2.1動物分組及處理 40只大鼠隨機分為Control組、MI/R組、MI/R+mimic mock組、MI/R+mimic組，每組10只。miRIDIAN shMIMIC miR-146a-5p和陰性對照慢病毒由Thermo Scientific公司合成，滴度可達1×109PFU/ml。大鼠用20%烏拉坦腹腔注射進行麻醉，氣管插管控制呼吸。MI/R+mimic組采用30號針頭心臟注射(左肋骨4～5根之間)10 μl miR-146a-5p慢病毒，MI/R+mimic mock組注射10 μl 陰性對照慢病毒。

1.2.2動物模型制備及心臟功能檢測 根據(jù)1.2.1描述的實驗方法分組處理后，在第4肋左側(cè)開胸，剪開心包使心肌暴露，用無創(chuàng)縫合針穿一段6/0絲線置于左冠狀動脈前降支起始段下游2 mm處備用。除Control組外，其余各組結(jié)扎冠狀動脈前降支，以EKGII導聯(lián)1 ST段明顯抬高或T波高聳，心肌暗紅色為結(jié)扎成功標志。結(jié)扎60 min后，松開結(jié)扎線再灌注4 h。使用Vivid 7.0彩色超聲儀檢測大鼠左心室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)和左心室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)。處死大鼠，4℃ 3 000 g離心10 min 收集血清和心肌組織，用于后續(xù)實驗。

1.2.3細胞培養(yǎng)及分組處理 大鼠心肌細胞株H9c2購自美國ATCC公司，使用含1.5 g/L NaHCO3、10%FBS、1%谷氨酰胺、1%青鏈霉素的DMEM細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)于5%CO237℃恒溫培養(yǎng)箱中，隔天換液一次，2～3 d根據(jù)細胞生長狀態(tài)換液一次。將細胞分為Control組、OGD/R組、OGD/R+mimic mock組、OGD/R+mimic組，除Control組外，其余組換成無糖無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)于95%N2，5%CO2的37℃培養(yǎng)盒中4 h，造成缺糖缺氧損傷。之后將培養(yǎng)液換成正常DMEM培養(yǎng)液，在5% CO237℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h形成復氧復糖環(huán)境。按照Lipofectamin2000轉(zhuǎn)染試劑的操作說明分別制備miRNA陰性對照和miR-146a-5p的miRNA/Lipofectamin復合物，對OGD/R+mimic mock組和mimic組進行轉(zhuǎn)染。同時，部分OGD/R組和OGD/R+mimic組細胞共轉(zhuǎn)染連接Notch2序列的pcDNA。轉(zhuǎn)染48 h后，1 000 r/min離心5 min收集細胞，保存于-80℃冰箱備用。

1.2.4大鼠心肌梗死面積檢測 按1.2.1和1.2.2描述的實驗方法對組織分組處理后，取大鼠心臟，4℃生理鹽水清洗3次后稱重，將心肌沿結(jié)扎線切成5份，0.125% NBT常溫染色15 min，非梗塞區(qū)被染成藍色，梗塞區(qū)灰白色。將梗塞區(qū)心肌剪下稱重，以梗塞區(qū)心肌重量占全心肌重量的百分比來表示心肌梗死面積。

1.2.5心肌損傷標志物CK、CK-MB、LDH檢測 按1.2.1和1.2.2描述的實驗方法分組處理后，靜脈采血靜置10 min，待血液凝固后3 000 r/min離心15 min，取血清。通過酶聯(lián)免疫吸附劑(ELISA)檢測CK、CK-MB、LDH。

1.2.6TUNEL法檢測細胞凋亡 按照1.2.1和1.2.2描述的實驗方法對組織分組處理后，使用10%甲醛固定，石蠟包埋后切片，按照TUNEL細胞凋亡試劑盒的操作進行染色，封片后使用光學顯微鏡觀察凋亡細胞。

1.2.7IHC檢測組織Ki67陽性細胞率 按照1.2.6描述的實驗方法切片，使用Ki67作為一抗，按免疫組化試劑盒操作進行免疫組化染色，DAB顯色液顯色，封片后使用光學顯微鏡觀察Ki67陽性細胞。

1.2.8氧化應激標志物SOD、GSH-Px、MDA檢測 按照1.2.3和1.2.5描述的實驗方法處理血清或細胞，按照試劑盒操作說明分別檢測SOD、GSH-Px活力和MDA濃度水平。其中SOD采用羥胺法，GSH-Px采用比色法，MDA采用TBA法。

1.2.9促炎細胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α檢測 按照1.2.5描述的實驗方法處理血清，按照ELISA試劑盒操作說明檢測IL-6、IL-1β、TNF-α。

1.2.10Western blot檢測 按照1.2.2和1.2.3描述的方法對組織或細胞分組處理后，使用RIPA裂解液提取各組總蛋白，用BCA試劑盒定量，每組30 μg 蛋白使用10% SDS-PAGE分離，分離后的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入對應的一抗，4℃孵育過夜，次日使用PBS緩沖液清洗 3次，加入二抗室溫孵育2 h，ECL顯色液曝光顯影，GAPDH作為內(nèi)參。

1.2.11RT-PCR檢測mRNA表達水平 按照1.2.3描述的方法對細胞分組處理，用Trizol提取各組RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR循環(huán)為：預變性95℃ 10 min，變性95℃ 15 s，退火60℃ 1 min 40個循環(huán)。根據(jù)SsoFastTMEva-Green?Supermix試劑盒檢測檢測各組mRNA水平，結(jié)果采用2-ΔΔCt法進行計算。

1.2.12MTT檢測細胞活性 按照1.2.3描述的方法對細胞分組處理，取各組細胞接種于96孔板，100 μl 的MTT溶液(5 mg/ml)混勻培養(yǎng)4 h。每孔加入150 μl的二甲基亞砜搖床低速振蕩10 min，490 nm檢測細胞吸光度。

1.2.13Hoechst檢測細胞凋亡 按照1.2.3描述的方法對細胞分組處理，將細胞接種于6孔板，4%多聚甲醛固定細胞，0.5% TrintonX-100透膜處理，Hoechst熒光染料室溫染色30 min后，熒光顯微鏡觀察細胞凋亡情況。

1.2.14熒光素酶報告實驗檢測 用生物信息學方法預測了miR-146a-5p的結(jié)合位點位于Notch基因的1869-1891 nt區(qū)域，分別構(gòu)建Notch2 Lenti-reporter-Luciferase野生型和突變型載體，將細胞分為Notch2 wt、Notch2 wt+miR-146a mimic、Notch2 mut、Notch2 mut+miR-146a mimic四組，24孔板中放置1 d。將上述野生型載體(200 ng)和pRL-CMV載體(20 ng)轉(zhuǎn)染Notch2 wt、Notch2 wt+miR-146a mimic組，突變型載體(200 ng)和pRL-CMV載體(20 ng)轉(zhuǎn)染Notch2 mut、Notch2 mut+miR-146a mimic組。其中Notch2 wt+miR-146a mimic組和Notch2 mut+miR-146a mimic組轉(zhuǎn)染miR-146a-5p。48 h后使用熒光素酶報告檢測系統(tǒng)檢測熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1MI/R降低大鼠心肌組織miR-146a-5p表達水平 如圖1所示，與Control組比較，MI/R組miR-146a-5p表達水平顯著降低(P<0.01)，差異有統(tǒng)計學意義；與MI/R組比較，MI/R+mimic組miR-146a-5p表達水平顯著升高(P<0.01)，差異有統(tǒng)計學意義。結(jié)果表明成功構(gòu)建了miR-146a-5p過表達動物模型。

2.2miR-146a-5p保護MI/R大鼠心臟功能 如圖2所示，與Control組比較，MI/R組LVEDD、LVESD顯著升高(P<0.01)；與MI/R組比較，MI/R+mimic組LVEDD、LVESD顯著降低(P<0.01)，差異有統(tǒng)計學意義。同時，與Control組比較，MI/R組心肌梗死面積、CK-MB、CK、LDH活性顯著升高(P<0.01)；與MI/R組比較，MI/R+mimic組心肌梗死面積、CK-MB、CK、LDH活性顯著降低(P<0.01)，差異有統(tǒng)計學意義，見圖3。

2.3miR-146a-5p抑制大鼠心肌細胞凋亡 如圖4所示，與Control組比較，MI/R組大鼠心肌組織細胞凋亡率顯著升高(P<0.01)；與MI/R組比較，MI/R+mimic組大鼠心肌組織細胞凋亡率顯著降低(P<0.01)，差異有統(tǒng)計學意義。

圖1 大鼠心肌組織miR-146a-5p表達水平Fig.1 Expression levels of miR-146a-5p in myocardial tissue of ratsNote: n=10,**.P P

圖2 miR-146a-5p對大鼠心臟功能的影響Fig.2 Effect of miR-146a-5p on cardiac function in ratsNote: n=10,**.P P

2.4miR-146a-5p恢復大鼠心肌組織活力 如圖5所示，與Control組比較，MI/R組大鼠心肌組織Ki67陽性細胞率顯著升高(P<0.01)；與MI/R組比較，MI/R+mimic組大鼠心肌組織Ki67陽性細胞率顯著升高(P<0.01)，差異有統(tǒng)計學意義。

2.5miR-146a-5p降低大鼠心肌組織的氧化應激 如圖6所示，與Control組比較，MI/R組大鼠心肌組織SOD、GSH-Px活力顯著降低，MDA濃度顯著升高(P<0.01)，差異有統(tǒng)計學意義；與MI/R組比較，MI/R+mimic組大鼠心肌組織SOD、GSH-Px活力顯著升高，MDA濃度顯著降低(P<0.01)，差異有統(tǒng)計學意義。

2.6miR-146a-5p減輕大鼠心肌組織炎癥 如圖7

圖3 miR-146a-5p對大鼠心肌損傷的影響Fig.3 Effect of miR-146a-5p on myocardial injury in ratsNote: n=10,**.P P

圖4 miR-146a-5p對大鼠心肌細胞凋亡的影響(×400)Fig.4 Effect of miR-146a-5p on myocardial cell apoptosis in rats(×400)Note: n=10,**.P P

所示，與Control組比較，MI/R組大鼠心肌組織IL-6、IL-1β、TNF-α濃度顯著升高(P<0.01)，差異有統(tǒng)計學意義；與MI/R組比較，MI/R+mimic組大鼠心肌組織IL-6、IL-1β、TNF-α濃度顯著降低(P<0.01)，差異有統(tǒng)計學意義。

2.7miR-146a-5p調(diào)控大鼠心肌凋亡相關(guān)蛋白和Notch2/Hes1通路蛋白的表達 如圖8所示，與Control組比較，MI/R組大鼠心肌組織Bax、Notch2、Hes1表達水平顯著升高，Bcl-2表達水平顯著降低(P<0.01)，差異有統(tǒng)計學意義；與MI/R組比較，MI/R+mimic組大鼠心肌組織Bax、Notch2、Hes1表達水平顯著降低，Bcl-2表達水平顯著升高(P<0.01)，差異有統(tǒng)計學意義。

圖5 miR-146a-5p對大鼠心肌組織Ki67陽性細胞率的影響(×400)Fig.5 Effect of miR-146a-5p on myocardial positive cells of Ki67 in rats(×400)Note: n=10,**.P P

圖6 miR-146a-5p對大鼠心肌氧化應激的影響Fig.6 Effect of miR-146a-5p on myocardial oxidative stress in ratsNote: n=10,**.P P

圖7 miR-146a-5p對大鼠心肌促炎因子水平的影響Fig.7 Effect of miR-146a-5p on myocardial proinflamm-atory cytokine levels in ratsNote: n=10,**.P P

圖8 miR-146a-5p對體內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白和Notch2/Hes1通路蛋白的影響Fig.8 Effect of miR-146a-5p on apoptosis-related and Notch2/Hes1 pathway protein in vivoNote: n=10,**.P P

2.8miR-146a-5p抑制Notch2基因在心肌細胞內(nèi)的表達 如圖9所示，與Control組比較，OGD/R組miR-146a-5p顯著降低，同時，Notch2 mRNA表達水平顯著升高(P<0.01)，差異有統(tǒng)計學意義；與OGD/R組比較，OGD/R+mimic組miR-146a-5p顯著升高，表明miR-146a-5p mimic成功轉(zhuǎn)染了OGD/R大鼠心肌細胞；同時，OGD/R+mimic組Notch2 mRNA表達水平顯著降低(P<0.01)，差異有統(tǒng)計學意義。

2.9Notch2抑制細胞活力并促進凋亡 如圖10和圖11所示，與Control組比較，OGD/R組Notch2蛋白表達水平顯著升高，細胞活力顯著降低，細胞凋亡率顯著升高(P<0.01)，差異有統(tǒng)計學意義；與OGD/R組比較，OGD/R+mimic組Notch2蛋白表達水平顯著降低，細胞活力顯著升高，細胞凋亡率顯著降低(P<0.01)，OGD/R+pc-Notch2組Notch2蛋白表達水平顯著升高，細胞活力顯著降低，細胞凋亡率顯著升高(P<0.01)，差異有統(tǒng)計學意義；與OGD/R+mimic組比較，OGD/R+mimic+pc-Notch2組Notch2蛋白表達水平和細胞凋亡率顯著升高，但仍低于OGD/R+pc-Notch2組，細胞活力顯著降低，仍高于OGD/R+pc-Notch2組(P<0.01)，差異有統(tǒng)計學意義。

圖9 miR-146a-5p在心肌細胞中的表達水平及對Notch2基因表達水平的影響Fig.9 Expression level of miR-146a-5p in cardiomyocyte and effect on gene expression level of Notch2Note: n=6,**.P P

圖10 Notch2蛋白過表達對心肌細胞活力的影響Fig.10 Effect of Notch2 protein overexpression on cell viability of cardiomyocyteNote: n=6,**.P PP

2.10Notch2提高心肌細胞的氧化應激 如圖12所示，與Control組比較，OGD/R組SOD活性水平顯著降低，MDA濃度顯著升高(P<0.01)，差異有統(tǒng)計學意義；與OGD/R組比較，OGD/R+mimic組SOD活性水平顯著升高，MDA濃度顯著降低(P<0.01)，OGD/R+pc-Notch2組SOD活性水平顯著降低，MDA濃度顯著升高(P<0.01)，差異有統(tǒng)計學意義；與OGD/R+mimic組比較，OGD/R+mimic+pc-Notch2組SOD活性水平顯著降低，但仍高于OGD/R+pc-Notch2組(P<0.01)， MDA濃度升高，但仍低于OGD/R+pc-Notch2組(P<0.01)，差異有統(tǒng)計學意義。

圖11 Notch2蛋白過表達對心肌細胞凋亡率的影響(×400)Fig.11 Effect of Notch2 protein overexpression on cell apoptosis of cardiomyocyte(×400)Note: n=6,**.P PP

圖12 Notch2對心肌細胞氧化應激的影響Fig.12 Effect of Notch2 on oxidative stress of cardiomyocyteNote: n=6,**.P PP

圖13 熒光素酶報告實驗檢測miR-146a-5p與Notch2的靶向作用關(guān)系Fig.13 Luciferase reporter assay was performed for measuring targeting relationship between miR-146a-5p and Notch2Note: n=3,**.P

2.11miR-146a-5p靶向作用于Notch2 如圖13所示，與Notch2 wt組比較，Notch2 wt+miR-146a mimic組熒光素酶活性顯著降低(P<0.01)，差異有統(tǒng)計學意義；Notch2 mut組、Notch2 mut+miR-146a mimic組熒光素酶活性不存在顯著差異。實驗驗證了miR-146a-5p靶向作用于Notch2。

3 討論

缺血再灌注損傷(ischemia/reperfusion injury,IRI)在很多器官疾病中都發(fā)揮著重要的作用，在組織器官缺血后，快速恢復供血不僅不能使組織器官功能恢復，反而加重了組織器官損傷，引發(fā)功能障礙[2]。近年來很多研究表明，Notch2與包括腦、腎臟等很多器官的IRI都有著密切聯(lián)系[3,4]，Notch2在心臟中可能有著相似的調(diào)控機制。過去的研究報道了miR-146a-5p在食管鱗狀腫瘤細胞中和Notch2的相互作用關(guān)系[8]，本研究推測，miR-146a-5p在動物正常心肌組織內(nèi)可能存在相同的機制，參與調(diào)控MI/R的病程。

為了證實上述猜想，本研究首先對miR-146a-5p基因表達水平進行檢測，發(fā)現(xiàn)MI/R大鼠心肌組織中該miRNA表達水平下調(diào)，表明miR-146a-5p與MI/R的病情發(fā)展有關(guān)。對大鼠心臟LVEDD和LVESD進行檢測發(fā)現(xiàn)，miR-146a-5p過表達模型大鼠的心功能相比于普通MI/R大鼠得到了明顯恢復，與miRNA表達水平一致。同時miR-146a-5p過表達顯著降低了大鼠的心肌梗死面積，CK-MB、CK、LDH的血清活性也顯著降低，CK-MB、CK、LDH為常見的心肌損傷標記物，心肌細胞損傷時會從細胞滲出進入血液，導致血清中CK-MB、CK、LDH活性升高[9]。此外，miR-146a-5p過表達顯著降低了MI/R大鼠的心肌凋亡率，提高了Ki67陽性細胞率。Ki67是一種細胞增殖標記物，除G0期以外，Ki67在細胞周期各期均有表達，在S期表達量顯著升高，M期結(jié)束后Ki67被降解[10]。結(jié)合實驗結(jié)果表明，miR-146a-5p對心肌功能具有保護作用。

氧化應激在MI/R發(fā)病過程中發(fā)揮著重要的作用?；钚匝?reactive oxygen species,ROS)是生物體內(nèi)氧分子還原過程的中間產(chǎn)物，生理狀態(tài)下，ROS的產(chǎn)生與SOD、GSH-Px等酶的清除作用達成平衡，當缺血再灌注發(fā)生時，大量的H+和Ca2+積累，線粒體膜電位的破壞，導致了大量ROS產(chǎn)生。ROS會直接損傷細胞DNA、蛋白以及脂質(zhì)，最終造成氧化應激[11]。其中脂質(zhì)過氧化時產(chǎn)生氧化終產(chǎn)物MDA，進一步加重膜損傷[12]。SOD、GSH-Px、MDA水平變化能夠直觀反映出氧化應激的變化過程，是測定氧化應激的標志物。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-146a-5p過表達顯著升高了MI/R大鼠SOD、GSH-Px活性，降低了MDA表達水平，表明miR-146a-5p能夠抑制氧化應激，其具體機制可能是通過調(diào)控Notch信號通路實現(xiàn)[13]。

炎癥細胞因子在參與了MI/R炎癥的發(fā)展過程，MI/R引起的非特異性損傷起始了細胞因子介導的級聯(lián)反應[14]，TNF-α表達量的升高，TNF-α的過度表達會誘發(fā)心臟收縮紊亂、纖維化以及細胞死亡[15]。TNF-α作為機體應對有害刺激最初分泌的炎癥細胞因子，可誘導IL-1β的分泌，IL-1β與TNF-α可協(xié)同誘導IL-6的分泌。三者是啟動炎癥反應的關(guān)鍵細胞因子[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-146a-5p過表達顯著降低了MI/R大鼠IL-6、IL-1β、TNF-α濃度，表明miR-146a-5p能夠抑制炎癥反應，可能是通過抑制Notch2對NF-κB信號通路的作用實現(xiàn)[6]。

細胞凋亡是MI/R損傷的病理機制中扮演著重要角色，當心肌細胞凋亡減輕時，MI/R患者的心臟功能得到明顯改善[17]。其中Bcl-2家族蛋白Bcl-2與Bax比率是衡量細胞凋亡是否發(fā)生的關(guān)鍵因素[18]，Bax為促凋亡基因，可形成二聚體引發(fā)凋亡，當Bcl-2表達水平提高時，可與Bax結(jié)合形成異源二聚體抑制凋亡發(fā)生。Notch信號通路通過相鄰細胞的交流，在調(diào)節(jié)細胞、組織、器官的分化與發(fā)育中具有重要作用[19]。研究表明Notch2/hes1信號通路在腎臟IRI中可促進腎小管細胞凋亡[6]，推測在心肌中Notch2/hes1有類似的機制。本研究檢測了MI/R大鼠心肌組織中Bcl-2、Bax、Notch2、hes1的蛋白表達水平，發(fā)現(xiàn)miR-146a-5p過表達顯著降低了MI/R大鼠心肌組織Bax、Notch2、Hes1蛋白表達水平，提高了Bcl-2蛋白表達水平。表明miR-146a-5p減輕了MI/R導致的心肌細胞凋亡，與之前的凋亡檢測結(jié)果一致，Notch2/Hes1信號通路很可能參與了MI/R誘導的細胞凋亡。進一步研究發(fā)現(xiàn)，Notch2過表達可降低心肌細胞活性，提高細胞凋亡率和氧化應激水平，miR-146a-5p可顯著降低心肌細胞中Notch2基因和蛋白的表達水平，miR-146a-5p與Notch2在體外可發(fā)生相互作用，表明miR-146a-5p保護心肌的作用主要是通過抑制Notch2的表達實現(xiàn)的。

綜上所述，miR-146a-5p能抑制Notch2/hes1信號通路的激活，抑制促凋亡蛋白Bax的表達，促進抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，提高心肌細胞的活力，抑制心肌細胞凋亡、氧化應激和炎癥反應，從而在MI/R中保護心肌功能。本研究初步探究了miR-146a-5p在MI/R中保護心肌功能的作用和機制，Notch2在心臟細胞中對IRI的調(diào)控作用和機制，以及與miR-146a-5p的相互作用關(guān)系?？赡転镸I/R治療提供了新的靶向治療思路。后期將對miR-146a-5p和Notch2對MI/R其他病理環(huán)節(jié)及信號通路的作用和機制進行進一步研究。