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    小檗堿聯(lián)合人參皂苷Rb1對(duì)脂肪細(xì)胞炎癥信號(hào)通路作用*

    2020-04-13 06:48:20蔡之幸
    陜西中醫(yī) 2020年3期
    關(guān)鍵詞:皂甙小檗人參

    蔡之幸,陳 越

    上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院中醫(yī)科(上海200336)

    慢性低度炎癥狀態(tài)是代謝綜合征(Metabolic syndrome,MS)存在的重要發(fā)病機(jī)制之一[1]。在肥胖的代謝綜合征患者血清中,多種脂肪細(xì)胞炎癥因子和血清炎癥標(biāo)志物如IL-6、TNF 等呈現(xiàn)明顯地高表達(dá)狀態(tài)。脂肪組織作為一個(gè)內(nèi)分泌器官[2]已經(jīng)成為學(xué)術(shù)界的共識(shí)。對(duì)抗脂肪組織的慢性炎性狀態(tài),有利于對(duì)胰島素抵抗的調(diào)控,最終將預(yù)防代謝綜合征患者的心腦血管等重要靶器官損傷事件的發(fā)生發(fā)展。

    傳統(tǒng)中藥飲片中,具有清熱燥濕作用的黃連和具有益氣作用的人參是中醫(yī)臨床治療2型糖尿病的常用藥對(duì)。已有多方研究發(fā)現(xiàn)[3-4]黃連的主要有效成分小檗堿具有降低3T3-L1脂肪細(xì)胞TNF-α、IL-6等表達(dá)的作用,而人參的主要有效成分,人參皂苷[5]可通過多種分子機(jī)制發(fā)揮調(diào)節(jié)糖、脂代謝的作用。目前,該藥對(duì)合用,對(duì)MS患者的干預(yù),在分子生物學(xué)層面,是否有確切的增效作用,鮮有報(bào)道,人參的主要有效化學(xué)成分人參皂苷Rb1和黃連的主要有效成分小檗堿合用對(duì)脂肪細(xì)胞信號(hào)通路的作用并不十分清楚。本研究,主要從細(xì)胞生物學(xué)層面,觀察兩種主要有效成分的合用對(duì)改善脂肪細(xì)胞的慢性炎性狀態(tài)下的胰島素抵抗是否有增效作用。

    材料和方法

    1 材 料

    1.1 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑:人參皂苷Rb1(簡(jiǎn)稱Rb1)、小檗堿(簡(jiǎn)稱Ber)、地塞米松(DXMS)、3-異丁基-1-甲基-黃嘌呤(IBMX);重組人胰島素(常規(guī)型,優(yōu)泌林R);牛血清白蛋白質(zhì)(BSA);胎牛血清(FCS)、高糖培養(yǎng)基(DMEM);抗β-actin單克隆抗體,抗IKK-β單克隆抗體,抗IKK-α/IKK-β多克隆抗體,羊抗兔辣根過氧化物酶(HRP)連接的二抗;ECL 化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒、BCA 蛋白質(zhì)檢測(cè)試劑盒;3T3-L1前脂肪細(xì)胞株,購(gòu)買于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

    1.2 主要儀器:通用電泳儀(E-1101)、伯樂半干轉(zhuǎn)膜儀(125-0143)、BioPhotometer D30核酸蛋白質(zhì)測(cè)定儀、高速離心機(jī)(E2720)。

    2 實(shí)驗(yàn)方法

    2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與誘導(dǎo)分化:將3T3-L1前脂肪細(xì)胞生長(zhǎng)至70%融合度,消化細(xì)胞種植于6 孔板中,用前體細(xì)胞培養(yǎng)液(90%DMEM+10%FCS)繼續(xù)培養(yǎng)48 h。更換前體細(xì)胞培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)48 h至細(xì)胞完全融合。待細(xì)胞完全融合后,更換為分化培養(yǎng)液(90%DMEM+10%FCS+IBMX+1.0μg/ml INS),繼續(xù)培養(yǎng)48 h。48 h后,更換分化培養(yǎng)基為脂肪細(xì)胞維持培養(yǎng)基(90%DMEM+10%FCS+1.0μg/ml INS)。將細(xì)胞培養(yǎng)于脂肪細(xì)胞維持培養(yǎng)基中7-15 d,每2-3 d更換維持培養(yǎng)液1 次。誘導(dǎo)分化成熟3T3-L 脂肪細(xì)胞>70%呈脂肪細(xì)胞表型,可用于實(shí)驗(yàn)(圖1)。

    圖1 分化成熟的脂肪細(xì)胞

    2.2 建立3T3-L1 脂肪細(xì)胞胰島素抵抗模型:3T3-L1前脂肪細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)分化成熟為3T3-L1 脂肪細(xì)胞后,置于0.2%BSA 的DMEM 無血清培養(yǎng)液中,分別加入10μmol/L 小 檗 堿、10μmol/L 人 參 皂 甙Rb1、10μmol/L小檗堿加人參皂甙Rb1干預(yù)24 h,吸棄上清液后,收集經(jīng)藥物干預(yù)的各組脂肪細(xì)胞待用。

    3T3-L1前脂肪細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)分化后,成為成熟的3T3-L1脂肪細(xì)胞,先置于0.2%BSA 的DMEM 無血清培養(yǎng)液,培養(yǎng)12 h后,換成含10μmol/L,TNF-α的0.2%BSA 的DMEM 無血清培養(yǎng)液,培養(yǎng)形成胰島素抵抗?fàn)顟B(tài),再培養(yǎng)12 h后,分別予10μmol/L 小檗堿、10μmol/L人參皂甙Rb1、10μmol/L 小檗堿+人參皂甙Rb1干預(yù),12 h后,再次吸棄上清液,收集經(jīng)藥物處理的各組胰島素抵抗模型脂肪細(xì)胞待用。

    2.3 實(shí)時(shí)熒光定量法檢測(cè)mRNA 的表達(dá)量:使用Trizol法抽提RNA,逆轉(zhuǎn)錄提取總m RNA,實(shí)時(shí)熒光定量法測(cè)定TNF-α、IL-6 的表達(dá)量。引物(TNF-α上游引物:ACGGCATCCATCTCAAAGAC 下游引物:CGGCAGAGAGGAGGTTGACT;IL-6 上 游 引物:AGTTGCCTTCTTTGGGACTGA 下 游 引 物:CAGAATTGCCATTGCACAAC),PCR 經(jīng)DNA 變性、退火、延伸三步法后,測(cè)定其熒光信號(hào)表達(dá),擴(kuò)增至40個(gè)循環(huán);根據(jù)熔解度曲線分析擴(kuò)增后的特異性表達(dá)情況,持續(xù)檢測(cè)其信號(hào)強(qiáng)度。

    2.4 蛋白免疫印跡法(Western-blotting)檢測(cè)IKK-β表達(dá):于上述各組備用的脂肪細(xì)胞中,加入細(xì)胞裂解液,充分裂解各組脂肪細(xì)胞。于4℃下,離心機(jī)設(shè)置13000轉(zhuǎn)/min,離心30 min 后,提取蛋白質(zhì),運(yùn)用BCA 法,測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。在蛋白質(zhì)樣品中,加入上樣緩沖液,經(jīng)95℃蛋白變性5 min,分離轉(zhuǎn)膜,室溫下封閉2 h,使用一抗,4℃度環(huán)境下,孵育過夜,使用二抗室溫環(huán)境下,蛋白質(zhì)雜交2 h,經(jīng)曝光、顯影后,采用蛋白免疫印跡(Western-blotting)法檢測(cè)IKK-β表達(dá)。

    3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件,進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有計(jì)數(shù)資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示,符合方差齊性檢驗(yàn)者,應(yīng)用單因素方差分析進(jìn)行各組組間比較,若差異顯著者,應(yīng)用LSD 法進(jìn)行兩兩比較;不符合方差齊性檢驗(yàn)者,若差異顯著,則應(yīng)用Tamhane's T2法進(jìn)行兩兩比較。當(dāng)P<0.05時(shí),認(rèn)為兩組之間差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1 Ber、Rb1及Rb1+Ber干預(yù)對(duì)基礎(chǔ)狀態(tài)下的脂肪細(xì)胞炎癥因子的作用 與空白對(duì)照組相比,Ber組脂肪細(xì)胞的TNF-α和IL-6的mRNA 表達(dá)量降低更明顯(P<0.01),Rb1組脂肪細(xì)胞的TNF-α和IL-6的mRNA表達(dá)量無明顯變化,Rb1+Ber聯(lián)合組的TNF-α和IL-6的mRNA 表達(dá)量亦無顯著變化。見表1。

    2 Ber+Rb1干預(yù)對(duì)胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下的(TNFα刺激)脂肪細(xì)胞炎癥因子的作用 與空白對(duì)照組比較,Ber組能顯著地抑制TNF-α刺激下上調(diào)的TNFα、IL-6的表達(dá)(P<0.01),而Rb1僅抑制TNF-α的表達(dá)(P<0.01),Ber+Rb1兩藥合用,與Rb1單用作用類似,僅抑制了TNF-α的表達(dá)(P<0.01)。見表2。

    表1 Ber、Rb1及Rb1+Ber基礎(chǔ)狀態(tài)下脂肪細(xì)胞炎癥因子表達(dá)比較

    表1 Ber、Rb1及Rb1+Ber基礎(chǔ)狀態(tài)下脂肪細(xì)胞炎癥因子表達(dá)比較

    組 別 n TNF-αm RNA 相對(duì)值IL-6m RNA相對(duì)值空白組6 1.17±0.020 1.00±0.022 10μmol/L小檗堿組 6 0.75±0.026 0.80±0.024 10μmol/L人參皂甙組 6 1.17±0.019 1.00±0.020 10μmol/L小檗堿+人參皂甙組 6 1.19±0.015 1.02±0.018 F 值 - 83.04 81.08 P 值 - <0.001 <0.001

    表2 Ber、Rb1及Rb1+Ber在TNF-α刺激下脂肪細(xì)胞炎癥因子表達(dá)比較

    表2 Ber、Rb1及Rb1+Ber在TNF-α刺激下脂肪細(xì)胞炎癥因子表達(dá)比較

    組 別 n TNF-αmRNA 相對(duì)值IL-6mRNA相對(duì)值空白組6 1.00±0.022 1.02±0.029 10μmol/L小檗堿組 6 0.78±0.024 0.88±0.020 10μmol/L人參皂甙組 6 0.81±0.019 1.84±0.020 10μmol/L小檗堿+人參皂甙組 6 0.82±0.016 1.88±0.018 F 值 - 69.47 92.08 P 值 - <0.001 <0.001

    3 Ber、Rb1及Rb1+Ber對(duì)脂肪細(xì)胞主要炎癥信號(hào)通路的影響 經(jīng)TNF-α誘導(dǎo)后,加入Ber處理24 h的脂肪細(xì)胞,NF-κB 和IKK-β 表達(dá)水平下調(diào),而RB1處 理 的 脂 肪 細(xì) 胞(無 論 是 否+Ber),NF-κB 和IKK-β表達(dá)水平上調(diào)。加入TNF-α誘導(dǎo)24 h 后,無論Ber、Rb1處理組或Ber+Rb1聯(lián)合處理組,其磷酸化的IKK-β表達(dá)水平都呈上調(diào)趨勢(shì)(圖2)。

    圖2 小檗堿和人參皂苷Rb1合用對(duì)脂肪細(xì)胞主要炎癥信號(hào)通路的影響

    討 論

    代謝綜合征(Metabolic syndromes,MS)是一類以中心性肥胖為核心,聚集了糖耐量異常、高血壓、高血脂、高尿酸等多種心腦血管疾患危險(xiǎn)因素的復(fù)雜代謝紊亂癥候群[6]。胰島素抵抗[7],是MS公認(rèn)的核心。目前認(rèn)為,脂肪細(xì)胞的堆積[8]使得脂肪組織中的單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)及單核細(xì)胞轉(zhuǎn)移抑制因子(MIF)被釋放,導(dǎo)致脂肪組織直接被巨噬細(xì)胞浸潤(rùn),在局部脂肪組織產(chǎn)生了大量的活性氧物質(zhì)[9],減少了抗氧化物質(zhì)的產(chǎn)生。局部脂肪組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)被激活,核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)被激活,諸多脂肪因子,如腫瘤壞死因子(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、瘦素、脂聯(lián)素的分泌異常,這些脂肪因子同時(shí)也是炎性因子,長(zhǎng)期慢性釋 放 入 血[10-11],TNF-α 可 通 過 激 活 核 因 子-κB(NF-κB)抑制因子激酶(IKK),使κB 抑制因子(IKB)磷酸化而激活NF-κB,而NF-κB 又可促進(jìn)TNF-α轉(zhuǎn)錄,從而形成低度炎癥信號(hào)的正反饋環(huán),導(dǎo)致或加重胰島素抵抗。在長(zhǎng)期慢性低度炎性反應(yīng)刺激下,最終能導(dǎo)致MS的產(chǎn)生。

    盡管MS 的診斷標(biāo)準(zhǔn)早已提出,MS 的心腦血管危害性也一再受到重視,現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)代謝綜合征的治療,近20年仍停留在針對(duì)某一癥候的各組治療,如單純控制體重、控制血糖、控制血壓、調(diào)脂固斑等,因代謝綜合征患者存在心腦血管事件的高危風(fēng)險(xiǎn),許多患者不得不選擇上述藥物的疊加給藥,且終身給藥?;凇罢w觀念”的中醫(yī)藥,在“代謝綜合征”的管理上,具有獨(dú)到優(yōu)勢(shì)。中醫(yī)認(rèn)為,黃連,苦寒之品,歸心肝胃經(jīng),既能清熱燥濕,又善清心胃之火。人參,性甘,微溫,有大補(bǔ)元?dú)?,補(bǔ)脾益肺的功效,助運(yùn)化,輸精微,使氣旺津生,以達(dá)到生津止渴的目的,能夠針對(duì)MS患者肺脾之虛,補(bǔ)肺平喘又健脾調(diào)中,鼓舞脾氣。黃連、人參相須為用,此藥對(duì)主導(dǎo)的清熱益氣法對(duì)代謝綜合征積極作用被許多學(xué)者認(rèn)可[12]。

    本實(shí)驗(yàn)中,我們利用現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)技術(shù),再次驗(yàn)證了Ber對(duì)脂肪細(xì)胞主要的炎性通路NF-κB 的下調(diào)作用。在臨床實(shí)踐中取得良好降糖療效的人參,其主要成分人參皂苷Rb1,卻能明顯上調(diào)TNF-α誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞炎性通路NF-κB和IKK-β的表達(dá)水平,并且其磷酸化的IKK-β表達(dá)水平都呈上調(diào)趨勢(shì)。當(dāng)Ber聯(lián)合Rb1時(shí),這種上調(diào)趨勢(shì)仍然沒有改變。這與臨床實(shí)踐中觀察到的黃連、人參藥對(duì)有降低胰島素抵抗的作用不符[13-14]。可見,人參的主要有效成分Rb1,并非從脂肪細(xì)胞炎性通路NF-κB的調(diào)節(jié)角度,實(shí)現(xiàn)其改善胰島素抵抗的作用。最新研究發(fā)現(xiàn),人參皂甙Rb1主要作用于PI3K/Akt信號(hào)通路,促進(jìn)GLUT1、GLUT4蛋白表達(dá)和Akt磷酸化實(shí)現(xiàn)其胰島素抵抗作用[15-16],同時(shí),人參皂苷Rb1及代謝物還可通過降低IRS1絲氨酸磷酸化、增加PI3K 活性、促使Akt活化來提高葡萄糖攝?。煌瑫r(shí)抑制炎性反應(yīng),達(dá)到改善IR 的目的。

    NF-κB是機(jī)體的主要炎性通路之一。本研究未顯示出人參皂甙Rb1對(duì)NF-κB通路的下調(diào)作用,恰恰相反,我們觀察到人參皂甙Rb1有上調(diào)脂肪細(xì)胞炎性通路NF-κB 和IKK-β 的表達(dá)水平及上調(diào)磷酸化的IKK-β表達(dá)水平的趨勢(shì),這能否否認(rèn)人參皂甙Rb1的降糖作用?能否可因人參皂甙Rb1無論是否聯(lián)合小檗堿均有上調(diào)脂肪細(xì)胞炎性通路NF-κB 和IKK-β的表達(dá)水平及上調(diào)磷酸化的IKK-β表達(dá)水平的趨勢(shì),認(rèn)為相互疊加的中藥有效成分,有助增長(zhǎng)脂肪細(xì)胞炎性反應(yīng),增加胰島素抵抗的風(fēng)險(xiǎn)。

    結(jié)合前述人參皂甙Rb1 在PI3K/Akt胰島素信號(hào)傳導(dǎo)上的研究[15-16],我們認(rèn)為中藥的有效成分對(duì)脂肪細(xì)胞炎性反應(yīng)及胰島素抵抗的調(diào)控是多方面的;本研究中人參皂甙Rb1的胰島素抵抗作用并不是通過對(duì)脂肪細(xì)胞NF-κB 通路的“抗炎”這條途徑完成的。由此我們想到:中藥的有效成分對(duì)單一信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用與臨床所見的療效可能不盡相同。同一中藥的有效成分,可以作用于多條信號(hào)通路,發(fā)揮不同的調(diào)節(jié)作用[17]。中藥有效成分對(duì)信號(hào)通路的影響,并非“1對(duì)1”的線性關(guān)系,也非“1+1”的增效關(guān)系,而是復(fù)雜的、相互作用的“非線性”關(guān)系?;蛟S用“非線性”[18]方式來研究藥物作用于靶標(biāo)及信號(hào)通路中的困惑,可能為中藥有效成分對(duì)疾病的積極作用研究提供途徑。

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