人工飼養(yǎng)條件下黃額閉殼龜?shù)姆敝承袨檠芯?/h1>
2020-04-13 09:10:12曹鑫盛黃凱路斌潘建洲曹嘉慧張震陳成勛
四川動(dòng)物 2020年2期
曹鑫盛， 黃凱， 路斌， 潘建洲， 曹嘉慧， 張震， 陳成勛*
(1. 廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南寧530004； 2. 天津農(nóng)學(xué)院，水產(chǎn)學(xué)院，天津300384；3. 天津贊蘭科技有限公司，天津300384； 4. 廣西防城港東興市北投集團(tuán)，廣西防城港538100)
黃額閉殼龜Cuoragalbinifrons屬地龜科Geoemydidae閉殼龜屬，在中國(guó)僅分布于廣西、海南(周婷，李丕鵬，2013)。相關(guān)研究表明，野外生境破碎化日益嚴(yán)重與猖獗的偷獵現(xiàn)象導(dǎo)致黃額閉殼龜野外種群逐漸衰亡(武正軍，李義明，2003；汪繼超等，2011)。黃額閉殼龜被國(guó)際自然保護(hù)聯(lián)盟(IUCN)、中國(guó)脊椎動(dòng)物紅色名錄列為極危(CR)物種(蔣志剛等，2016；IUCN，2018)，同時(shí)被收錄入瀕危野生動(dòng)植物國(guó)際貿(mào)易公約(CITES)附錄Ⅱ(曾巖，2011)。
面對(duì)野生資源逐漸枯竭的現(xiàn)實(shí)，對(duì)黃額閉殼龜?shù)姆敝沉?xí)性進(jìn)行研究，不僅可以對(duì)該物種進(jìn)行人工繁育，用于補(bǔ)充自然資源，維持野外種群基數(shù)，同時(shí)還能滿足寵物市場(chǎng)的需求，創(chuàng)造經(jīng)濟(jì)價(jià)值。與野外資源枯竭及市場(chǎng)需求相對(duì)應(yīng)的是目前國(guó)內(nèi)外均無(wú)對(duì)人工養(yǎng)殖條件下黃額閉殼龜繁殖習(xí)性的研究報(bào)道，目前有記錄的人工孵化個(gè)體僅為野生待產(chǎn)種龜在人工暫養(yǎng)時(shí)繁殖并人工孵化而來(lái)，不能認(rèn)為已成功對(duì)該物種進(jìn)行人工繁殖。綜上所述，對(duì)人工養(yǎng)殖條件下黃額閉殼龜?shù)姆敝承袨檫M(jìn)行研究，為該物種的人工保育及后續(xù)產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供理論基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 試驗(yàn)對(duì)象
于2013年查閱相關(guān)資料，擬定研究方法，儲(chǔ)備飼養(yǎng)相關(guān)工具、材料，并建設(shè)試驗(yàn)場(chǎng)所(2014年場(chǎng)地建設(shè)完畢)。2014年由廣西壯族自治區(qū)東興市專業(yè)養(yǎng)殖戶劉洪高、潘建洲協(xié)助引種黃額閉殼龜親龜7只，經(jīng)過(guò)2014—2016年的預(yù)飼養(yǎng)，并改進(jìn)、添加相關(guān)物資，2017—2019年正式開(kāi)始對(duì)人工繁殖條件下黃額閉殼龜?shù)姆敝承袨檫M(jìn)行研究。
選擇人工隔離飼養(yǎng)2年以上非待產(chǎn)黃額閉殼龜性成熟個(gè)體，共7只(5雌2雄)。分別使用150T型電子數(shù)顯卡尺(Meinaite)、DT2000型電子天平(美國(guó)雙杰)測(cè)定6個(gè)可量性狀(圖1)：腹甲寬(plastron width，PW)、腹甲長(zhǎng)(plastron length，PL)、背甲寬(carapace width，CW)、背甲長(zhǎng)(carapace length，CL)、體高(carapace height，CH)和體質(zhì)量(weight，WT)；測(cè)定龜卵的5個(gè)可量性狀：卵長(zhǎng)徑(L1)、卵短徑(L2)、卵殼質(zhì)量(L3)、卵殼厚(L4)和卵質(zhì)量(weight of egg，WE)，長(zhǎng)度測(cè)量值精確至0.01 mm，質(zhì)量測(cè)量值精確至0.01 g。
圖1 黃額閉殼龜背甲及腹甲形態(tài)指標(biāo)測(cè)量Fig. 1 Measurement of the morphological indexof Cuora galbinifrons
1.體高， 2. 背甲長(zhǎng)， 3. 背甲寬， 4. 腹甲寬， 5. 腹甲長(zhǎng)
1. carapace height， 2. carapace length， 3. carapace width， 4. plastron width， 5. plastron length
1.2 飼養(yǎng)環(huán)境及方式
黃額閉殼龜養(yǎng)殖條件參照曹鑫盛等(2018)飼養(yǎng)繁殖鋸緣閉殼龜C.mouhotii的養(yǎng)殖環(huán)境進(jìn)行設(shè)置，區(qū)別在于通風(fēng)窗朝向東北，日常光照強(qiáng)度最高為11 000 lx。
黃額閉殼龜與鋸緣閉殼龜習(xí)性相近，生境與分布地區(qū)部分重疊(周婷，李丕鵬，2013)，因此，餌料配方及投喂方式均參考曹鑫盛等(2018)的方法，不同的是在12月轉(zhuǎn)移養(yǎng)殖區(qū)至SPX-450BE人工氣候培養(yǎng)箱(天津賽得利斯實(shí)驗(yàn)分析儀器制造廠)內(nèi)，參照海南省五指山市(黃額閉殼龜野外生境)控制箱內(nèi)溫濕度，光照時(shí)間7～9 h，光照強(qiáng)度250～400 lx。試驗(yàn)中觀察到黃額閉殼龜喜好攝食綠化遮陽(yáng)種植的紅薯Ipomoeabatatas，因此每日增加投放新鮮紅薯葉片供其采食，該飼養(yǎng)條件下親龜年均體質(zhì)量增長(zhǎng)率為6.37%，生長(zhǎng)狀況良好。
1.3 繁殖及孵化
雄性黃額閉殼龜?shù)念I(lǐng)地意識(shí)極強(qiáng)，經(jīng)常被觀察到相互攻擊現(xiàn)象，因此為避免雄性之間的相互爭(zhēng)斗造成損傷，同一時(shí)間雌性養(yǎng)殖區(qū)域僅有1只雄性；而雌性黃額閉殼龜有嚙噬同類龜卵的習(xí)性，在產(chǎn)卵前也會(huì)表現(xiàn)出較強(qiáng)的領(lǐng)地性，因此雌性在產(chǎn)卵前也單獨(dú)飼養(yǎng)。交配及求偶行為的記錄以李敏(2014)和魏玉峰(2015)中的方法為依據(jù)，通過(guò)H9W 4K高清紅外線相機(jī)(新佰)對(duì)養(yǎng)殖區(qū)內(nèi)黃額閉殼龜進(jìn)行24 h攝錄觀察并記錄。
黃額閉殼龜龜卵孵化方法參考曹鑫盛等(2018)，不同的是溫度設(shè)置為27 ℃±0.2 ℃，空氣相對(duì)濕度為85%±5%。
2 結(jié)果
2.1 親龜?shù)目闪啃誀钆c繁殖
在試驗(yàn)過(guò)程及對(duì)其他養(yǎng)殖戶的走訪過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，黃額閉殼龜交配和繁殖行為的出現(xiàn)，不能僅以親龜?shù)捏w質(zhì)量為參考，還需要參考親龜?shù)捏w型。
人工養(yǎng)殖條件下，對(duì)初次出現(xiàn)交配、繁殖行為的黃額閉殼龜進(jìn)行研究(表1)。以其體質(zhì)量為因變量，背甲長(zhǎng)、背甲寬、腹甲長(zhǎng)、腹甲寬、體高為自變量，進(jìn)行多元回歸分析：WT=8.92CL+9.81CW+7.77PL-7.80PW-2.56CH-2 164.53(式1)(Multiple R=0.99，R Square=0.98，Adjusted R Square=0.89，標(biāo)準(zhǔn)誤差=46.37；n=7)。
表1 黃額閉殼龜親龜可量性狀Table 1 Measurable characteristics of Cuora galbinifrons
2.2 求偶及交配行為
2014—2016年人工養(yǎng)殖條件下，黃額閉殼龜非冬眠期間均可見(jiàn)交配行為，而2018年的交配高峰期為5—6月(占全年交配次數(shù)的41.94%)，交配成功率最高峰也在5—6月(50%)(表2)。黃額閉殼龜交配行為多發(fā)生在16∶00—18∶00，陰雨天氣(空氣濕度≥90%)時(shí)，交配次數(shù)顯著上升。雄性黃額閉殼龜在交配高峰期爭(zhēng)斗次數(shù)顯著上升，在水流噴濺刺激下外陰莖易伸出。雌性在交配期食欲上升，且偏愛(ài)高蛋白的鮮活餌料(如昆蟲、蚯蚓、螯蝦等)，遇刺激易發(fā)生后足撐地，泄殖孔擴(kuò)張的行為，在此期間體質(zhì)量輕微提高。
黃額閉殼龜?shù)慕慌湫袨?表3)可在陸地或淺水中進(jìn)行，交配行為依次為：
表2 2018年黃額閉殼龜交配及雄性爭(zhēng)斗行為記錄Table 2 Mating behavior and male fight behaviorrecord of Cuora galbinifrons in 2018
雄性：
感受：聞嗅到雌性的氣味，輕嚙口部發(fā)出“咔咔”聲，抬頭觀望、尋找雌性。
接近：看到雌性時(shí)，快速爬行接近雌性。
追逐：當(dāng)雌性逃跑時(shí)，以快速爬行的方式追逐，并會(huì)從口部呼出大量氣體發(fā)出“呼呼”聲。
嗅探：接近雌性后，會(huì)環(huán)繞其爬行，并不時(shí)聞嗅雌性身軀多處。
爬跨：從后方爬上雌性背部并用前肢爪子緊抓雌性背甲邊緣。偶有發(fā)生從前端趴背雌性，出現(xiàn)兩龜朝向不一的現(xiàn)象。
制服雌性：調(diào)整體位，緊抓在雌性背甲邊緣，同時(shí)伸縮脖子咬嚙其頭部和頸盾，迫使雌性將頭部縮入殼內(nèi)尾部更多的伸出殼外。同時(shí)尾基部緊貼雌性泄殖腔區(qū)域，觸探雌性泄殖孔。
攻擊：當(dāng)雌性反抗交配時(shí)，會(huì)攻擊性地撕咬雌性的背甲邊緣和四肢，易對(duì)雌性造成傷害。
交配：制服雌性后，用前肢撐起身體的前半部，此時(shí)2只龜身體角度45～50°。同時(shí)移動(dòng)后肢抓住雌性背甲邊緣，后伸出陰莖緊勾雌性尾部，并輔助下插入泄殖腔，偶有發(fā)生在陰莖插入后雄性向后仰倒。
雌性：
逃離：當(dāng)雄性朝自己移動(dòng)或發(fā)生接觸時(shí)或反抗交配后，迅速遠(yuǎn)離雄性。
反抗交配：當(dāng)雄性移動(dòng)到身邊或爬到背上時(shí)，試圖逃跑或攻擊性地撕咬雄性，強(qiáng)烈地掙扎、爬行，將雄性甩離，不接受交配。
接受交配：當(dāng)雄性移動(dòng)到身邊或爬到背上時(shí)，保持安靜，無(wú)逃離或反抗，偶有輕微掙扎(不影響正常的交配行為)，泄殖孔擴(kuò)張，接受雄性的求偶。
2.3 產(chǎn)卵行為
人工養(yǎng)殖條件下，雌性黃額閉殼龜每年產(chǎn)卵1次，每次1～2枚，全年最大產(chǎn)卵量2枚，產(chǎn)卵高峰期在6—7月，在產(chǎn)卵前1～10 d會(huì)表現(xiàn)出明顯的食欲下降，但均未發(fā)現(xiàn)食物廢絕的現(xiàn)象。黃額閉殼龜?shù)?次繁殖間隔積溫為197 230～207 955 ℃·h(n=5)，產(chǎn)卵前表現(xiàn)出極強(qiáng)的攻擊性，排斥周圍的所有同類，產(chǎn)卵時(shí)用后腿挖掘3～4 cm的坑穴，埋藏深度為0.5～1 cm(n=5)。產(chǎn)卵行為持續(xù)時(shí)間為 107～237 min(n=5)，雖未表現(xiàn)出顯著的天氣傾向性，但表現(xiàn)出了明顯的時(shí)間傾向性(10∶00—18∶00)。黃額閉殼龜在產(chǎn)卵后當(dāng)天即攝食，產(chǎn)卵后的1～15 d攝食欲望顯著增加，攻擊性增加的現(xiàn)象消失。
表3 黃額閉殼龜求偶交配行為的持續(xù)時(shí)間Table 3 Courtship and mating duration ofCuora galbinifrons
人工養(yǎng)殖條件下，黃額閉殼龜?shù)漠a(chǎn)卵行為(表4)完全在陸地進(jìn)行，產(chǎn)卵過(guò)程依次為：
觀察：雌性在產(chǎn)卵前伸長(zhǎng)頸部四處觀望、搜索適宜的產(chǎn)卵區(qū)域。優(yōu)先選擇光照強(qiáng)度低(200 lx以下)的松軟區(qū)域，用前腿挖掘并聞嗅該區(qū)域(該過(guò)程不會(huì)使用后腿挖掘產(chǎn)卵區(qū))。
驅(qū)散：雌性停止嗅探，匍匐于產(chǎn)卵區(qū)域觀察四周，并通過(guò)啃咬和撞擊將產(chǎn)卵區(qū)直徑0.5 m內(nèi)的其他動(dòng)物，尤其是同類驅(qū)離該范圍。
營(yíng)巢：雌性使用后腿在產(chǎn)卵區(qū)挖掘出3～4 cm的坑穴，尾部下垂朝向坑穴內(nèi)準(zhǔn)備產(chǎn)卵(此過(guò)程中雌性頸部無(wú)持續(xù)性前伸，泄殖孔未出現(xiàn)擴(kuò)張)。如受到驚嚇，雌性大概率會(huì)放棄該產(chǎn)卵區(qū)。
產(chǎn)卵：雌性頸部持續(xù)前伸，泄殖孔反復(fù)收縮、擴(kuò)張，在巢穴內(nèi)產(chǎn)出1～2枚龜卵，龜卵表面有黏液，此階段對(duì)外界刺激不敏感。
掩埋：產(chǎn)卵后，雌性泄殖孔收縮，后腿快速挖掘泥土掩埋龜卵，掩埋后雌性常見(jiàn)呆立于原地休憩，體能恢復(fù)后離開(kāi)，試驗(yàn)對(duì)象均未表現(xiàn)出護(hù)巢習(xí)性。
表4 黃額閉殼龜產(chǎn)卵行為的持續(xù)時(shí)間Table 4 Spawning behavior duration of Cuora galbinifrons
2.4 龜卵形態(tài)及孵化
2016年3號(hào)、4號(hào)黃額閉殼龜分別產(chǎn)出3枚龜卵，其中受精卵2枚，沿用鋸緣閉殼龜人工飼養(yǎng)條件下的孵化方法(溫度28 ℃±0.2 ℃，相對(duì)濕度85%±5%)進(jìn)行孵化(曹鑫盛等，2018)，發(fā)育至37 d時(shí)，卵內(nèi)胚胎全部死亡。參考與黃額閉殼龜野外棲息地重疊的鋸緣閉殼龜卵的自然孵化溫度(22～28 ℃)(Fischeretal.，2010；Wangetal.，2011)，在正式試驗(yàn)時(shí)使用恒溫27 ℃±0.2 ℃孵化黃額閉殼龜卵。
2017—2019年的正式試驗(yàn)中共獲得黃額閉殼龜卵9枚，其中受精卵5枚，平均受精率55.56%(表5)。龜卵為硬殼卵，長(zhǎng)徑39.78～51.36 mm，短徑26.93～31.13 mm，卵質(zhì)量22.78～32.09 g，卵殼厚0.57～0.63 mm。
共孵化黃額閉殼龜稚龜3只，總孵化率60.00%，孵化周期為118～136 d，孵化積溫為76 464～88 128 ℃·h，1日齡稚龜體質(zhì)量為17.92～21.46 g(表6)。1日齡稚龜背甲長(zhǎng)57.14～62.21 mm，背甲寬36.67～38.69 mm(圖2)。
表5 黃額閉殼龜產(chǎn)卵與孵化情況Table 5 Circumstances of the eggs and incubationof Cuora galbinifrons
表6 黃額閉殼龜受精卵孵化數(shù)據(jù)Table 6 Eggs incubation data of Cuora galbinifrons
3 討論
3.1 人工養(yǎng)殖條件下黃額閉殼龜可量性狀應(yīng)用
本地林業(yè)局曾向筆者提出“近年來(lái)常有走私者使用‘野生動(dòng)物馴養(yǎng)繁殖許可證’作為掩護(hù)，有關(guān)部門對(duì)查獲的黃額閉殼龜是否為野生個(gè)體進(jìn)行判別時(shí)存在較高的難度”相關(guān)問(wèn)題。本試驗(yàn)階段對(duì)越南分布的黃額閉殼龜進(jìn)行野外調(diào)查，共測(cè)量、記錄野生性成熟黃額閉殼龜個(gè)體12只，代入式1計(jì)算。野生黃額閉殼龜?shù)膶?shí)際W值均小于計(jì)算結(jié)果，且差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。這或許與野生動(dòng)物在人工圈養(yǎng)后食物的充裕、營(yíng)養(yǎng)充足以及運(yùn)動(dòng)消耗量降低，會(huì)在養(yǎng)殖初期內(nèi)出現(xiàn)體質(zhì)量顯著增長(zhǎng)后逐漸趨于平穩(wěn)的過(guò)程(馬澤芳，2004)有關(guān)。
圖2 黃額閉殼龜卵及稚龜形態(tài)Fig. 2 The morphological characteristics ofCuora galbinifrons’s eggs and juveniles
a、b. 龜卵； c. 破殼中的稚龜； d. 1日齡的稚龜
a， b. eggs； c. turtles that are hatching； d. 1-day old turtle
試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)黃額閉殼龜在消化道感染變形蟲、細(xì)菌性腸炎等疾病時(shí)，也會(huì)出現(xiàn)短時(shí)間內(nèi)體質(zhì)量顯著降低的現(xiàn)象。而雌性在產(chǎn)卵前則會(huì)出現(xiàn)短時(shí)間內(nèi)體質(zhì)量顯著上升的現(xiàn)象。其可量性狀回歸方程或可用于對(duì)成熟親龜健康狀況和發(fā)育狀況的判定。但本試驗(yàn)樣本數(shù)較少，后續(xù)將對(duì)更多不同性別、生長(zhǎng)階段的個(gè)體可量性狀進(jìn)行更深入的研究，為人工養(yǎng)殖條件下黃額閉殼龜健康狀況、生長(zhǎng)及營(yíng)養(yǎng)狀況的判定提供參考。
3.2 黃額閉殼龜卵受精率與孵化
相關(guān)研究表明，動(dòng)物的受精率(受孕率)受到交配溫度(陳紹孟等，2012)和交配頻率(高富友，2008)的影響，過(guò)高的溫度和交配頻率將使動(dòng)物的受精率(受孕率)降低。在試驗(yàn)結(jié)果中，人工養(yǎng)殖條件下黃額閉殼龜卵受精率僅為55.56%，顯著低于人工養(yǎng)殖條件下其他閉殼龜類的受精率(李貴生，唐大由，2002；楊治國(guó)，2005；曹鑫盛等，2018)。結(jié)合野外種群分布數(shù)據(jù)(汪繼超等，2011)與溫度數(shù)據(jù)(Fischeretal.，2010；李敏，2014)，分析其野外相遇、交配概率、交配溫度，為獲得更高的龜卵受精率，或可適當(dāng)降低黃額閉殼龜交配強(qiáng)度及養(yǎng)殖環(huán)境溫度。
同時(shí)針對(duì)黃額閉殼龜孵化率不理想的現(xiàn)象，我們了解到黃額閉殼龜產(chǎn)地海南吊羅山保護(hù)區(qū)，龜卵孵化期營(yíng)巢地溫度為18.5～24 ℃，平均溫度20.7 ℃，溫度波動(dòng)5.5 ℃(Fischeretal.，2010；Wangetal.，2011)。該孵化溫度區(qū)間與其他同屬龜類的孵化條件(22～28 ℃)差異較大(李貴生，唐大由，2002；楊治國(guó)，2005)，試驗(yàn)中未敢貿(mào)然采用該溫度。因此，黃額閉殼龜受精卵的最適發(fā)育溫度也將是后續(xù)研究的方向。
本試驗(yàn)在參照黃額閉殼龜?shù)娜斯ゐB(yǎng)殖方法的基礎(chǔ)上，首次于全人工條件下連續(xù)3年成功繁殖、孵化出子一代個(gè)體，平均受精率、孵化率分別為55.56%、60.00%。雖然成功突破了黃額閉殼龜?shù)姆敝撤椒ǎ禽^低的受精率、孵化率仍是目前制約其人工繁殖、保育的關(guān)鍵因素。后續(xù)我們將對(duì)黃額閉殼龜受精率、孵化率低下等原因進(jìn)行深入研究，為這種瀕臨滅絕動(dòng)物的保護(hù)提供有力的幫助。
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(1. 廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南寧530004； 2. 天津農(nóng)學(xué)院，水產(chǎn)學(xué)院，天津300384；3. 天津贊蘭科技有限公司，天津300384； 4. 廣西防城港東興市北投集團(tuán)，廣西防城港538100)
黃額閉殼龜Cuoragalbinifrons屬地龜科Geoemydidae閉殼龜屬，在中國(guó)僅分布于廣西、海南(周婷，李丕鵬，2013)。相關(guān)研究表明，野外生境破碎化日益嚴(yán)重與猖獗的偷獵現(xiàn)象導(dǎo)致黃額閉殼龜野外種群逐漸衰亡(武正軍，李義明，2003；汪繼超等，2011)。黃額閉殼龜被國(guó)際自然保護(hù)聯(lián)盟(IUCN)、中國(guó)脊椎動(dòng)物紅色名錄列為極危(CR)物種(蔣志剛等，2016；IUCN，2018)，同時(shí)被收錄入瀕危野生動(dòng)植物國(guó)際貿(mào)易公約(CITES)附錄Ⅱ(曾巖，2011)。
面對(duì)野生資源逐漸枯竭的現(xiàn)實(shí)，對(duì)黃額閉殼龜?shù)姆敝沉?xí)性進(jìn)行研究，不僅可以對(duì)該物種進(jìn)行人工繁育，用于補(bǔ)充自然資源，維持野外種群基數(shù)，同時(shí)還能滿足寵物市場(chǎng)的需求，創(chuàng)造經(jīng)濟(jì)價(jià)值。與野外資源枯竭及市場(chǎng)需求相對(duì)應(yīng)的是目前國(guó)內(nèi)外均無(wú)對(duì)人工養(yǎng)殖條件下黃額閉殼龜繁殖習(xí)性的研究報(bào)道，目前有記錄的人工孵化個(gè)體僅為野生待產(chǎn)種龜在人工暫養(yǎng)時(shí)繁殖并人工孵化而來(lái)，不能認(rèn)為已成功對(duì)該物種進(jìn)行人工繁殖。綜上所述，對(duì)人工養(yǎng)殖條件下黃額閉殼龜?shù)姆敝承袨檫M(jìn)行研究，為該物種的人工保育及后續(xù)產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供理論基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 試驗(yàn)對(duì)象
于2013年查閱相關(guān)資料，擬定研究方法，儲(chǔ)備飼養(yǎng)相關(guān)工具、材料，并建設(shè)試驗(yàn)場(chǎng)所(2014年場(chǎng)地建設(shè)完畢)。2014年由廣西壯族自治區(qū)東興市專業(yè)養(yǎng)殖戶劉洪高、潘建洲協(xié)助引種黃額閉殼龜親龜7只，經(jīng)過(guò)2014—2016年的預(yù)飼養(yǎng)，并改進(jìn)、添加相關(guān)物資，2017—2019年正式開(kāi)始對(duì)人工繁殖條件下黃額閉殼龜?shù)姆敝承袨檫M(jìn)行研究。
選擇人工隔離飼養(yǎng)2年以上非待產(chǎn)黃額閉殼龜性成熟個(gè)體，共7只(5雌2雄)。分別使用150T型電子數(shù)顯卡尺(Meinaite)、DT2000型電子天平(美國(guó)雙杰)測(cè)定6個(gè)可量性狀(圖1)：腹甲寬(plastron width，PW)、腹甲長(zhǎng)(plastron length，PL)、背甲寬(carapace width，CW)、背甲長(zhǎng)(carapace length，CL)、體高(carapace height，CH)和體質(zhì)量(weight，WT)；測(cè)定龜卵的5個(gè)可量性狀：卵長(zhǎng)徑(L1)、卵短徑(L2)、卵殼質(zhì)量(L3)、卵殼厚(L4)和卵質(zhì)量(weight of egg，WE)，長(zhǎng)度測(cè)量值精確至0.01 mm，質(zhì)量測(cè)量值精確至0.01 g。
圖1 黃額閉殼龜背甲及腹甲形態(tài)指標(biāo)測(cè)量Fig. 1 Measurement of the morphological indexof Cuora galbinifrons
1.體高， 2. 背甲長(zhǎng)， 3. 背甲寬， 4. 腹甲寬， 5. 腹甲長(zhǎng)
1. carapace height， 2. carapace length， 3. carapace width， 4. plastron width， 5. plastron length
1.2 飼養(yǎng)環(huán)境及方式
黃額閉殼龜養(yǎng)殖條件參照曹鑫盛等(2018)飼養(yǎng)繁殖鋸緣閉殼龜C.mouhotii的養(yǎng)殖環(huán)境進(jìn)行設(shè)置，區(qū)別在于通風(fēng)窗朝向東北，日常光照強(qiáng)度最高為11 000 lx。
黃額閉殼龜與鋸緣閉殼龜習(xí)性相近，生境與分布地區(qū)部分重疊(周婷，李丕鵬，2013)，因此，餌料配方及投喂方式均參考曹鑫盛等(2018)的方法，不同的是在12月轉(zhuǎn)移養(yǎng)殖區(qū)至SPX-450BE人工氣候培養(yǎng)箱(天津賽得利斯實(shí)驗(yàn)分析儀器制造廠)內(nèi)，參照海南省五指山市(黃額閉殼龜野外生境)控制箱內(nèi)溫濕度，光照時(shí)間7～9 h，光照強(qiáng)度250～400 lx。試驗(yàn)中觀察到黃額閉殼龜喜好攝食綠化遮陽(yáng)種植的紅薯Ipomoeabatatas，因此每日增加投放新鮮紅薯葉片供其采食，該飼養(yǎng)條件下親龜年均體質(zhì)量增長(zhǎng)率為6.37%，生長(zhǎng)狀況良好。
1.3 繁殖及孵化
雄性黃額閉殼龜?shù)念I(lǐng)地意識(shí)極強(qiáng)，經(jīng)常被觀察到相互攻擊現(xiàn)象，因此為避免雄性之間的相互爭(zhēng)斗造成損傷，同一時(shí)間雌性養(yǎng)殖區(qū)域僅有1只雄性；而雌性黃額閉殼龜有嚙噬同類龜卵的習(xí)性，在產(chǎn)卵前也會(huì)表現(xiàn)出較強(qiáng)的領(lǐng)地性，因此雌性在產(chǎn)卵前也單獨(dú)飼養(yǎng)。交配及求偶行為的記錄以李敏(2014)和魏玉峰(2015)中的方法為依據(jù)，通過(guò)H9W 4K高清紅外線相機(jī)(新佰)對(duì)養(yǎng)殖區(qū)內(nèi)黃額閉殼龜進(jìn)行24 h攝錄觀察并記錄。
黃額閉殼龜龜卵孵化方法參考曹鑫盛等(2018)，不同的是溫度設(shè)置為27 ℃±0.2 ℃，空氣相對(duì)濕度為85%±5%。
2 結(jié)果
2.1 親龜?shù)目闪啃誀钆c繁殖
在試驗(yàn)過(guò)程及對(duì)其他養(yǎng)殖戶的走訪過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，黃額閉殼龜交配和繁殖行為的出現(xiàn)，不能僅以親龜?shù)捏w質(zhì)量為參考，還需要參考親龜?shù)捏w型。
人工養(yǎng)殖條件下，對(duì)初次出現(xiàn)交配、繁殖行為的黃額閉殼龜進(jìn)行研究(表1)。以其體質(zhì)量為因變量，背甲長(zhǎng)、背甲寬、腹甲長(zhǎng)、腹甲寬、體高為自變量，進(jìn)行多元回歸分析：WT=8.92CL+9.81CW+7.77PL-7.80PW-2.56CH-2 164.53(式1)(Multiple R=0.99，R Square=0.98，Adjusted R Square=0.89，標(biāo)準(zhǔn)誤差=46.37；n=7)。
表1 黃額閉殼龜親龜可量性狀Table 1 Measurable characteristics of Cuora galbinifrons
2.2 求偶及交配行為
2014—2016年人工養(yǎng)殖條件下，黃額閉殼龜非冬眠期間均可見(jiàn)交配行為，而2018年的交配高峰期為5—6月(占全年交配次數(shù)的41.94%)，交配成功率最高峰也在5—6月(50%)(表2)。黃額閉殼龜交配行為多發(fā)生在16∶00—18∶00，陰雨天氣(空氣濕度≥90%)時(shí)，交配次數(shù)顯著上升。雄性黃額閉殼龜在交配高峰期爭(zhēng)斗次數(shù)顯著上升，在水流噴濺刺激下外陰莖易伸出。雌性在交配期食欲上升，且偏愛(ài)高蛋白的鮮活餌料(如昆蟲、蚯蚓、螯蝦等)，遇刺激易發(fā)生后足撐地，泄殖孔擴(kuò)張的行為，在此期間體質(zhì)量輕微提高。
黃額閉殼龜?shù)慕慌湫袨?表3)可在陸地或淺水中進(jìn)行，交配行為依次為：
表2 2018年黃額閉殼龜交配及雄性爭(zhēng)斗行為記錄Table 2 Mating behavior and male fight behaviorrecord of Cuora galbinifrons in 2018
雄性：
感受：聞嗅到雌性的氣味，輕嚙口部發(fā)出“咔咔”聲，抬頭觀望、尋找雌性。
接近：看到雌性時(shí)，快速爬行接近雌性。
追逐：當(dāng)雌性逃跑時(shí)，以快速爬行的方式追逐，并會(huì)從口部呼出大量氣體發(fā)出“呼呼”聲。
嗅探：接近雌性后，會(huì)環(huán)繞其爬行，并不時(shí)聞嗅雌性身軀多處。
爬跨：從后方爬上雌性背部并用前肢爪子緊抓雌性背甲邊緣。偶有發(fā)生從前端趴背雌性，出現(xiàn)兩龜朝向不一的現(xiàn)象。
制服雌性：調(diào)整體位，緊抓在雌性背甲邊緣，同時(shí)伸縮脖子咬嚙其頭部和頸盾，迫使雌性將頭部縮入殼內(nèi)尾部更多的伸出殼外。同時(shí)尾基部緊貼雌性泄殖腔區(qū)域，觸探雌性泄殖孔。
攻擊：當(dāng)雌性反抗交配時(shí)，會(huì)攻擊性地撕咬雌性的背甲邊緣和四肢，易對(duì)雌性造成傷害。
交配：制服雌性后，用前肢撐起身體的前半部，此時(shí)2只龜身體角度45～50°。同時(shí)移動(dòng)后肢抓住雌性背甲邊緣，后伸出陰莖緊勾雌性尾部，并輔助下插入泄殖腔，偶有發(fā)生在陰莖插入后雄性向后仰倒。
雌性：
逃離：當(dāng)雄性朝自己移動(dòng)或發(fā)生接觸時(shí)或反抗交配后，迅速遠(yuǎn)離雄性。
反抗交配：當(dāng)雄性移動(dòng)到身邊或爬到背上時(shí)，試圖逃跑或攻擊性地撕咬雄性，強(qiáng)烈地掙扎、爬行，將雄性甩離，不接受交配。
接受交配：當(dāng)雄性移動(dòng)到身邊或爬到背上時(shí)，保持安靜，無(wú)逃離或反抗，偶有輕微掙扎(不影響正常的交配行為)，泄殖孔擴(kuò)張，接受雄性的求偶。
2.3 產(chǎn)卵行為
人工養(yǎng)殖條件下，雌性黃額閉殼龜每年產(chǎn)卵1次，每次1～2枚，全年最大產(chǎn)卵量2枚，產(chǎn)卵高峰期在6—7月，在產(chǎn)卵前1～10 d會(huì)表現(xiàn)出明顯的食欲下降，但均未發(fā)現(xiàn)食物廢絕的現(xiàn)象。黃額閉殼龜?shù)?次繁殖間隔積溫為197 230～207 955 ℃·h(n=5)，產(chǎn)卵前表現(xiàn)出極強(qiáng)的攻擊性，排斥周圍的所有同類，產(chǎn)卵時(shí)用后腿挖掘3～4 cm的坑穴，埋藏深度為0.5～1 cm(n=5)。產(chǎn)卵行為持續(xù)時(shí)間為 107～237 min(n=5)，雖未表現(xiàn)出顯著的天氣傾向性，但表現(xiàn)出了明顯的時(shí)間傾向性(10∶00—18∶00)。黃額閉殼龜在產(chǎn)卵后當(dāng)天即攝食，產(chǎn)卵后的1～15 d攝食欲望顯著增加，攻擊性增加的現(xiàn)象消失。
表3 黃額閉殼龜求偶交配行為的持續(xù)時(shí)間Table 3 Courtship and mating duration ofCuora galbinifrons
人工養(yǎng)殖條件下，黃額閉殼龜?shù)漠a(chǎn)卵行為(表4)完全在陸地進(jìn)行，產(chǎn)卵過(guò)程依次為：
觀察：雌性在產(chǎn)卵前伸長(zhǎng)頸部四處觀望、搜索適宜的產(chǎn)卵區(qū)域。優(yōu)先選擇光照強(qiáng)度低(200 lx以下)的松軟區(qū)域，用前腿挖掘并聞嗅該區(qū)域(該過(guò)程不會(huì)使用后腿挖掘產(chǎn)卵區(qū))。
驅(qū)散：雌性停止嗅探，匍匐于產(chǎn)卵區(qū)域觀察四周，并通過(guò)啃咬和撞擊將產(chǎn)卵區(qū)直徑0.5 m內(nèi)的其他動(dòng)物，尤其是同類驅(qū)離該范圍。
營(yíng)巢：雌性使用后腿在產(chǎn)卵區(qū)挖掘出3～4 cm的坑穴，尾部下垂朝向坑穴內(nèi)準(zhǔn)備產(chǎn)卵(此過(guò)程中雌性頸部無(wú)持續(xù)性前伸，泄殖孔未出現(xiàn)擴(kuò)張)。如受到驚嚇，雌性大概率會(huì)放棄該產(chǎn)卵區(qū)。
產(chǎn)卵：雌性頸部持續(xù)前伸，泄殖孔反復(fù)收縮、擴(kuò)張，在巢穴內(nèi)產(chǎn)出1～2枚龜卵，龜卵表面有黏液，此階段對(duì)外界刺激不敏感。
掩埋：產(chǎn)卵后，雌性泄殖孔收縮，后腿快速挖掘泥土掩埋龜卵，掩埋后雌性常見(jiàn)呆立于原地休憩，體能恢復(fù)后離開(kāi)，試驗(yàn)對(duì)象均未表現(xiàn)出護(hù)巢習(xí)性。
表4 黃額閉殼龜產(chǎn)卵行為的持續(xù)時(shí)間Table 4 Spawning behavior duration of Cuora galbinifrons
2.4 龜卵形態(tài)及孵化
2016年3號(hào)、4號(hào)黃額閉殼龜分別產(chǎn)出3枚龜卵，其中受精卵2枚，沿用鋸緣閉殼龜人工飼養(yǎng)條件下的孵化方法(溫度28 ℃±0.2 ℃，相對(duì)濕度85%±5%)進(jìn)行孵化(曹鑫盛等，2018)，發(fā)育至37 d時(shí)，卵內(nèi)胚胎全部死亡。參考與黃額閉殼龜野外棲息地重疊的鋸緣閉殼龜卵的自然孵化溫度(22～28 ℃)(Fischeretal.，2010；Wangetal.，2011)，在正式試驗(yàn)時(shí)使用恒溫27 ℃±0.2 ℃孵化黃額閉殼龜卵。
2017—2019年的正式試驗(yàn)中共獲得黃額閉殼龜卵9枚，其中受精卵5枚，平均受精率55.56%(表5)。龜卵為硬殼卵，長(zhǎng)徑39.78～51.36 mm，短徑26.93～31.13 mm，卵質(zhì)量22.78～32.09 g，卵殼厚0.57～0.63 mm。
共孵化黃額閉殼龜稚龜3只，總孵化率60.00%，孵化周期為118～136 d，孵化積溫為76 464～88 128 ℃·h，1日齡稚龜體質(zhì)量為17.92～21.46 g(表6)。1日齡稚龜背甲長(zhǎng)57.14～62.21 mm，背甲寬36.67～38.69 mm(圖2)。
表5 黃額閉殼龜產(chǎn)卵與孵化情況Table 5 Circumstances of the eggs and incubationof Cuora galbinifrons
表6 黃額閉殼龜受精卵孵化數(shù)據(jù)Table 6 Eggs incubation data of Cuora galbinifrons
3 討論
3.1 人工養(yǎng)殖條件下黃額閉殼龜可量性狀應(yīng)用
本地林業(yè)局曾向筆者提出“近年來(lái)常有走私者使用‘野生動(dòng)物馴養(yǎng)繁殖許可證’作為掩護(hù)，有關(guān)部門對(duì)查獲的黃額閉殼龜是否為野生個(gè)體進(jìn)行判別時(shí)存在較高的難度”相關(guān)問(wèn)題。本試驗(yàn)階段對(duì)越南分布的黃額閉殼龜進(jìn)行野外調(diào)查，共測(cè)量、記錄野生性成熟黃額閉殼龜個(gè)體12只，代入式1計(jì)算。野生黃額閉殼龜?shù)膶?shí)際W值均小于計(jì)算結(jié)果，且差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。這或許與野生動(dòng)物在人工圈養(yǎng)后食物的充裕、營(yíng)養(yǎng)充足以及運(yùn)動(dòng)消耗量降低，會(huì)在養(yǎng)殖初期內(nèi)出現(xiàn)體質(zhì)量顯著增長(zhǎng)后逐漸趨于平穩(wěn)的過(guò)程(馬澤芳，2004)有關(guān)。
圖2 黃額閉殼龜卵及稚龜形態(tài)Fig. 2 The morphological characteristics ofCuora galbinifrons’s eggs and juveniles
a、b. 龜卵； c. 破殼中的稚龜； d. 1日齡的稚龜
a， b. eggs； c. turtles that are hatching； d. 1-day old turtle
試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)黃額閉殼龜在消化道感染變形蟲、細(xì)菌性腸炎等疾病時(shí)，也會(huì)出現(xiàn)短時(shí)間內(nèi)體質(zhì)量顯著降低的現(xiàn)象。而雌性在產(chǎn)卵前則會(huì)出現(xiàn)短時(shí)間內(nèi)體質(zhì)量顯著上升的現(xiàn)象。其可量性狀回歸方程或可用于對(duì)成熟親龜健康狀況和發(fā)育狀況的判定。但本試驗(yàn)樣本數(shù)較少，后續(xù)將對(duì)更多不同性別、生長(zhǎng)階段的個(gè)體可量性狀進(jìn)行更深入的研究，為人工養(yǎng)殖條件下黃額閉殼龜健康狀況、生長(zhǎng)及營(yíng)養(yǎng)狀況的判定提供參考。
3.2 黃額閉殼龜卵受精率與孵化
相關(guān)研究表明，動(dòng)物的受精率(受孕率)受到交配溫度(陳紹孟等，2012)和交配頻率(高富友，2008)的影響，過(guò)高的溫度和交配頻率將使動(dòng)物的受精率(受孕率)降低。在試驗(yàn)結(jié)果中，人工養(yǎng)殖條件下黃額閉殼龜卵受精率僅為55.56%，顯著低于人工養(yǎng)殖條件下其他閉殼龜類的受精率(李貴生，唐大由，2002；楊治國(guó)，2005；曹鑫盛等，2018)。結(jié)合野外種群分布數(shù)據(jù)(汪繼超等，2011)與溫度數(shù)據(jù)(Fischeretal.，2010；李敏，2014)，分析其野外相遇、交配概率、交配溫度，為獲得更高的龜卵受精率，或可適當(dāng)降低黃額閉殼龜交配強(qiáng)度及養(yǎng)殖環(huán)境溫度。
同時(shí)針對(duì)黃額閉殼龜孵化率不理想的現(xiàn)象，我們了解到黃額閉殼龜產(chǎn)地海南吊羅山保護(hù)區(qū)，龜卵孵化期營(yíng)巢地溫度為18.5～24 ℃，平均溫度20.7 ℃，溫度波動(dòng)5.5 ℃(Fischeretal.，2010；Wangetal.，2011)。該孵化溫度區(qū)間與其他同屬龜類的孵化條件(22～28 ℃)差異較大(李貴生，唐大由，2002；楊治國(guó)，2005)，試驗(yàn)中未敢貿(mào)然采用該溫度。因此，黃額閉殼龜受精卵的最適發(fā)育溫度也將是后續(xù)研究的方向。
本試驗(yàn)在參照黃額閉殼龜?shù)娜斯ゐB(yǎng)殖方法的基礎(chǔ)上，首次于全人工條件下連續(xù)3年成功繁殖、孵化出子一代個(gè)體，平均受精率、孵化率分別為55.56%、60.00%。雖然成功突破了黃額閉殼龜?shù)姆敝撤椒ǎ禽^低的受精率、孵化率仍是目前制約其人工繁殖、保育的關(guān)鍵因素。后續(xù)我們將對(duì)黃額閉殼龜受精率、孵化率低下等原因進(jìn)行深入研究，為這種瀕臨滅絕動(dòng)物的保護(hù)提供有力的幫助。
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