中國(guó)北方屬魚(yú)類(lèi)一新種(鯉形目：鯉科)
——中華

朱蘭， 俞丹， 劉煥章*

(1. 大連海洋大學(xué)，遼寧大連116023； 2. 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所，水生生物多樣性與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢430072)

1 材料與方法

1.1 研究材料

在遼寧省朝陽(yáng)市朝陽(yáng)縣、朝陽(yáng)市北票市和錦州市義縣的大凌河水系和河南省洛陽(yáng)市黃河流域的伊河和洛河水系中(圖1)中共采集標(biāo)本170尾，用10%福爾馬林固定，分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)材料取自新鮮標(biāo)本右側(cè)背部的肌肉組織，保存于75%酒精中，統(tǒng)一保存于中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所。標(biāo)本的測(cè)量使用數(shù)顯游標(biāo)卡尺，由同一人對(duì)樣本的形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行詳細(xì)的測(cè)量，從標(biāo)本的左側(cè)進(jìn)行，精確到0.1 mm，使用SPSS 25.0處理數(shù)據(jù)，計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。形態(tài)計(jì)數(shù)和測(cè)量方法參照Hubbs和Lagler(2004)，其中，背鰭和臀鰭最后一根在基部的分枝的鰭條計(jì)為“1”，側(cè)線(xiàn)鱗的計(jì)數(shù)是從鰓蓋后方第一片有孔鱗數(shù)到尾鰭基部最后一片有孔鱗。并且對(duì)新種的同屬物種進(jìn)行檢視，檢視標(biāo)本為寬鰭：IHB 197607001和197607002，2尾，體長(zhǎng)93.3和100.1 mm，日本：琵琶湖，保存于中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所。棘頰：BMNH 1901.3.6.10～1901.3.6.15，6尾，體長(zhǎng) 87.2～130.0 mm，全模標(biāo)本，中國(guó)：浙江：甬江，保存于英國(guó)自然歷史博物館；IHB 201808102～201808113，12 尾，體長(zhǎng)63.4～95.1 mm，中國(guó)：浙江：甬江，保存于中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所。

1.2 基因組DNA的提取和PCR擴(kuò)增、測(cè)序

基因組DNA的提取采用高鹽濃度抽提法，參照Tang等(2009)的方法，并稍作改動(dòng)。cytb基因的擴(kuò)增及測(cè)序引物為正向引物L(fēng)14724(5’-GACTTGAAAAACCACCGTTG-3’)和反向引物H15915(5’-CTCCGATCTCCGGATTACAAGAC-3’)(Xiaoetal.，2001)。PCR反應(yīng)的總體積為30 μL：3 μL DNA模板，反應(yīng)體系包括：10×Buffer 3 μL，dNTPs 1.5 μL(10 mmol·L-1)，引物各1 μL(10 μmol·L-1)，Taq DNA聚合酶0.25 μL，加滅菌雙蒸水至30 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性45 s，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送測(cè)序公司雙向測(cè)序，測(cè)序引物與PCR擴(kuò)增引物相同。

圖1 中華Zacco sinensis sp. nov.采樣點(diǎn)Fig. 1 The sampling sites of Zacco sinensis sp. nov.

1. 遼寧省朝陽(yáng)市朝陽(yáng)縣柳城街下洼子村(120°37′62″E， 41°48′74″N)； 2. 遼寧省朝陽(yáng)市北票市章吉營(yíng)鄉(xiāng)章吉營(yíng)村(120°62′83″E， 41°60′20″N)； 3. 遼寧省錦州市義縣九道嶺鎮(zhèn)四方臺(tái)村(121°31′58″E， 41°55′19″N)； 4. 河南省洛陽(yáng)市伊川縣河濱街(112°47′39″E， 34°52′55″N)； 5. 河南省洛陽(yáng)市洛龍區(qū)凌波大橋(112°38′57″E， 34°59′91″N)

1. Xiawazi village， Liucheng street， Chaoyang county， Chaoyang city， Liaoning province (120°37′62″E， 41°48′74″N)； 2. Zhangjiying village， Zhangjiying town， Beipiao city， Chaoyang city， Liaoning province (120°62′83″E， 41°60′20″N)； 3. Sifangtai village， Jiudaoling town， Yi county， Jinzhou city， Liaoning province (121°31′58″E， 41°55′19″N)； 4. Hebin street， Yichuan county， Luoyang city， Henan province (112°47′39″E， 34°52′55″N)； 5. Lingbo bridge， Luolong district， Luoyang city， Henan province (112°38′57″E， 34°59′91″N)

1.3 遺傳變異與系統(tǒng)發(fā)育分析

DNA序列的比對(duì)使用Clustal X (Thompsonetal.，1997)，并在SEAVIEW中進(jìn)行手工校正(Galtieretal.，1996)。采用MEGA 6.0 分析序列中各堿基含量及變異情況(Tamuraetal.，2013)，并基于Kimura雙參數(shù)(Kimura 2-parameter，K2P)模型計(jì)算轉(zhuǎn)換/顛換比率與物種間遺傳距離等參數(shù)(Kimura，1980；Kondoetal.，2016)。在jModeltest 2 中基于AIC值選擇最適堿基替代模型(Darribaetal.，2012)。

馬口魚(yú)類(lèi)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)重建使用鄰接法(neighbor-joining，NJ)、貝葉斯法(Bayesian inferences，BI)和最大似然法(maximum likelihood，ML)。鄰接法使用MEGA 6.0基于K2P模型，系統(tǒng)樹(shù)分支置信度采用自引導(dǎo)法(bootstrap analysis)，進(jìn)行1 000次重復(fù)抽樣檢測(cè)。BI樹(shù)的重建使用MrBayes 3(Huelsenbeck & Ronquist，2001)，替代模型根據(jù)篩選結(jié)果設(shè)定為：nst=6，rates=gamma；起始樹(shù)設(shè)置為隨機(jī)樹(shù)，馬爾科夫鏈的蒙特卡洛方法(Markov chain Monte Carlo process，MCMC)設(shè)置為4條鏈同時(shí)運(yùn)行4×106代，3條熱鏈1條冷鏈。每100代對(duì)系統(tǒng)樹(shù)進(jìn)行抽樣，最終得到40 001棵系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，初始的10 000作為老化樣本舍棄，剩余的樣本構(gòu)建一致樹(shù)并計(jì)算后驗(yàn)概率。最大似然法分析使用RaxML 8.0(Stamatakis，2014)，替代模型為GRT+I+G，替代數(shù)設(shè)置為6，設(shè)置1 000次自舉檢驗(yàn)來(lái)計(jì)算各分支的置信度。

表1 研究所用樣本及來(lái)源Table 1 Samples and their localities in the present study

注：*新測(cè)序列

Note：*sequences in this study

2 結(jié)果

正模標(biāo)本IHB 180407020，雄，體長(zhǎng)79.8 mm；2018年4月采自遼寧省朝陽(yáng)市朝陽(yáng)縣柳城街道下洼子村(大凌河水系)(120°37′62″E，41°48′74″N)；采集人：胡華明、倪述。

副模標(biāo)本IHB 180407021～180407035，15尾，體長(zhǎng)69.3～92.4 mm；2018年4月采自遼寧省錦州市義縣九道嶺鎮(zhèn)四方臺(tái)村(大凌河水系)(121°31′58″E，41°55′19″N)、遼寧省朝陽(yáng)市北票市章吉營(yíng)鄉(xiāng)章吉營(yíng)村(大凌河水系)(120°62′83″E，41°60′20″N)、遼寧省朝陽(yáng)市朝陽(yáng)縣柳城街道下洼子村(大凌河水系)(120°37′62″E，41°48′74″N)；采集人：胡華明、倪述。

IHB 171101001～171101010，10尾，體長(zhǎng)61.1～89.1 mm；2017年10月采自河南省洛陽(yáng)市伊川縣河濱街(伊河水系)(112°47′39″E，34°52′55″N)、河南省洛陽(yáng)市洛龍區(qū)凌波大橋(洛河水系)(112°38′57″E，34°59′91″N)；采集人：邱寧。

形態(tài)描述測(cè)量新種標(biāo)本26尾，全長(zhǎng)72.7～112.4 mm，體長(zhǎng)61.1～92.4 mm。相關(guān)可量、可數(shù)性狀見(jiàn)表2。新種體長(zhǎng)而側(cè)扁，腹圓，頭長(zhǎng)略大于體高。唇較薄，光滑?？诙宋?，口裂較小，稍向上傾斜，上頜稍長(zhǎng)于下頜，上、下頜平整無(wú)缺口，向后延伸未到或剛到達(dá)眼前緣下方。眼較大，位于頭側(cè)中上方。鼻孔較大，位于眼前方。圍尾柄鱗13～17，鰓耙排列疏松，第一鰓弓外側(cè)鰓耙10～12，內(nèi)側(cè)12～17，末端成鉤狀。

背鰭無(wú)硬刺，位于體中部，外緣呈弧形；胸鰭末端尖，未到達(dá)腹鰭基部，背鰭略長(zhǎng)于胸鰭；腹鰭小，外緣呈弧形，未到達(dá)肛門(mén)，腹鰭起點(diǎn)與背鰭起點(diǎn)相對(duì)；臀鰭基部長(zhǎng)，臀鰭第二、三根分枝鰭條最長(zhǎng)，可到達(dá)尾鰭基部。尾鰭分叉，上下葉幾乎等長(zhǎng)。肛門(mén)離臀鰭起點(diǎn)很近，臀鰭基長(zhǎng)較背鰭基長(zhǎng)長(zhǎng)。體側(cè)鱗片中等大?。粋?cè)線(xiàn)完全，且在胸鰭后方向下彎曲，然后再向上延伸到尾柄中部。胸部與腹部均有鱗片覆蓋，胸部及腹中線(xiàn)的鱗片埋于皮下，不甚明顯。

體色生活時(shí)鮮艷，雄魚(yú)比雌魚(yú)明顯。眼睛上邊緣橘紅色，背部灰色帶橘黃色，腹部銀白色，體側(cè)胸鰭到臀鰭起點(diǎn)之間具有3～8條不規(guī)則的灰綠色條紋，雄魚(yú)體側(cè)條紋明顯，雌魚(yú)體色條紋不明顯。背鰭分枝鰭條分為三部分：基部鰭條邊緣黑色，鰭間膜夾雜黑色顆粒，中部鰭條透明，鰭間膜黑色條紋，外緣各鰭邊緣黑色，鰭間膜透明。胸鰭灰白色或橘黃色，腹鰭灰白色，臀鰭灰白色或淺黃色。福爾馬林固定的樣本背部灰黑色，腹部灰白色，背鰭基部黑色，尾鰭分叉，邊緣黑色。

地理分布該種目前僅知分布于大凌河水系和黃河流域。

詞源新種種名源自拉丁文“sinensis”，意為“中國(guó)的”，指的是該物種的產(chǎn)地。

圖2 中華， ♂ (正模標(biāo)本， IHB 180407020， 體長(zhǎng)79.8 mm)Fig. 2 Zacco sinensis sp. nov， male (holotype， IHB 180407020， 79.8 mm standard length)

表2 中華的可數(shù)性狀和測(cè)量比例性狀Table 2 Meristic characters and proportional measurements of Zacco sinensis sp. nov.

3 分子系統(tǒng)發(fā)育分析

本研究中，使用18種馬口魚(yú)類(lèi)的線(xiàn)粒體cytb基因序列共44條，另外采用2條細(xì)鯽屬Aphyocypris魚(yú)類(lèi)的cytb序列作為外類(lèi)群。所有序列經(jīng)比對(duì)分析后，得到單條全長(zhǎng)為1 140 bp的序列集。序列中無(wú)堿基的插入或缺失，該片段A、T、G、C的堿基含量平均值分別為(不含外群)25.7%、30.1%、16.4%、27.8%。A+T含量(55.8%)高于G+C含量(44.2%)，與魚(yú)類(lèi)線(xiàn)粒體基因A、T含量高，G、C含量低的特點(diǎn)基本一致。1 140個(gè)位點(diǎn)中，保守位點(diǎn)708個(gè)，占總位點(diǎn)數(shù)的62.1%；變異位點(diǎn)432個(gè)，占37.9%；單突變位點(diǎn)27個(gè)，占2.4%；簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)405個(gè)，占35.5%。所有序列轉(zhuǎn)換顛換比平均值為5.08。

圖3 基于cyt b基因序列構(gòu)建的馬口魚(yú)類(lèi)鄰接樹(shù)， 節(jié)點(diǎn)處數(shù)值為NJ/BI/ML分析中所得的支持率(僅顯示大于50/0.5)Fig. 3 Phylogenetic relationships of opsariichthine derived from NJ tree based on cyt b gene sequences， values at thenodes correspond to the support values for NJ/BI/ML methods (above 50/0.5 are shown)

4 討論

表3 中華與2個(gè)同屬近似物種的主要鑒別特征Table 3 Principal diagnostic characters for Zacco sinensis sp. nov. and its 2 related congeners

致謝：感謝中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所胡華明老師、倪述、邱寧在野外采集標(biāo)本方面提供的諸多幫助，感謝張旭在地圖制作上提供的幫助，感謝張智、沈中源、王雪在軟件使用上提供的幫助。