傳統(tǒng)膏方的長期穩(wěn)定性試驗研究

梁欣健 姜倩娥 孔燕興 王葉茗▲ 周健文

1.廣州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，廣東廣州 510801；2.廣州市天河區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，廣東廣州 510665；3.廣東在田藥業(yè)有限公司，廣東清遠 511517

膏方是中醫(yī)的一種傳統(tǒng)用藥劑型，是采用中藥飲片加水煎煮，經(jīng)濃縮收膏等工藝制作而成的稠糊、半流狀固體[1]，其應用是在中醫(yī)藥基礎(chǔ)理論的指導下，遵循個體化用藥、一人一方、辨證論治、隨證加減原則，具有滋補強身、抗衰延年、防病治病等多種作用[2]，在臨床診療及日常養(yǎng)生保健中的應用十分廣泛。

目前國內(nèi)有開展膏方診療服務的醫(yī)療機構(gòu)，其患者膏方的制作主要有兩種方式：一是由各醫(yī)療機構(gòu)膏方室自行組織安排生產(chǎn)制作，二是委托藥廠代為加工制作。因此，各單位制作的中藥膏方其質(zhì)量參差不齊。但目前國內(nèi)仍然未見關(guān)于中醫(yī)膏方的“國家標準”，僅有中華中醫(yī)藥學會發(fā)布的《中醫(yī)養(yǎng)生保健技術(shù)規(guī)范——膏方》、以及上海中藥行業(yè)協(xié)會發(fā)布的《定制膏方加工管理規(guī)范》和《定制膏方加工管理細則》等行業(yè)規(guī)范，因此全國大部分地區(qū)的膏方只能按照《中國藥典》（2015年版）四部通則0183項“煎膏劑”的標準執(zhí)行。

穩(wěn)定性研究是藥品質(zhì)量控制研究的重要組成部分，它直接影響著藥品的質(zhì)量、臨床用藥的有效性和安全性[3]，而近年國內(nèi)學者對膏方質(zhì)量標準的研究大部分集中于薄層鑒定、含量測定等項目[4-5]進行研究，但對于中醫(yī)膏方的穩(wěn)定性如何？一般服用的保質(zhì)期為多久？按照《中國藥典》（2015年版）的微生物限度檢查法進行檢查是否可行？仍然有待進一步研究和考察。為此，筆者對傳統(tǒng)膏方的長期穩(wěn)定性進行研究，現(xiàn)將有關(guān)結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 儀器

Sartorius BS 110S電子天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]；SH-系列鼓風干燥箱（上杭儀器有限公司）；SW-CJ系列潔凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；HPX-9162 MBE數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱（上海海迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）；ZRH-150B生化培養(yǎng)箱（廣東省醫(yī)療器械廠）；LRH-150-M霉菌培養(yǎng)箱（廣東省醫(yī)療器械廠）；立式壓力蒸汽滅菌器 （上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠 ）；KQ-100DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；恒溫水浴鍋（北京永光明醫(yī)療儀器廠）；SC69-02型水分快速測定儀（上海平平儀器廠）；PYX-DHS-35電熱恒溫水浴鍋（上海躍進醫(yī)療器械廠）。

1.2 試藥

益母阿膠膏（由廣州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院膏方室提供，批號：171101，171102，171103）金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]，銅綠假單胞菌[CMCC（B）10104]，枯 草 芽 孢 桿 菌[CMCC（B）63501]，白 色 念 珠 菌[CMCC（B）98001]，黑 曲 霉[CMCC（B）98003]，大 腸 埃 希 菌[CMCC（B）44102]（均購自中國藥品生物制品檢定研究院），胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（20160621），沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（20160224），麥康凱液體培養(yǎng)基（20150820），麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（20151123），無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（20160316）（均購自青島海博生物技術(shù)有限公司），聚山梨酯-80（20160503，購自湖南爾康制藥有限公司）。

1.3 方法

由于傳統(tǒng)膏方的制作是采用一人一方的形式，其藥物組成并不固定，難以制定一個相對穩(wěn)定的指標，對其化學成分等進行定性或定量測定，因此在本實驗的長期穩(wěn)定性研究中，以廣州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院產(chǎn)科和婦科常用的傳統(tǒng)中醫(yī)特色膏方基本方（處方由益母草、當歸、川芎、桃仁、炮姜等組成），采用銅鍋煎煮，明火加熱的傳統(tǒng)制作方法制成的益母阿膠膏作為模型藥物，在常規(guī)傳統(tǒng)膏方的儲存條件下（陶瓷容器密封包裝、冰箱2～8℃條件下儲存），分別考察其在0、1、2、3、6、12個月的水分含量、相對密度及微生物含量。

1.3.1 微生物限度檢查方法學驗證

1.3.1.1 菌液的制備 接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、沙門菌和枯草芽孢桿菌至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，30～35℃培養(yǎng)18～24h，接種白色念珠菌至沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，20～25℃培養(yǎng)2～3d，接種黑曲霉至沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，20～25℃培養(yǎng)5～7 d。

取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物，用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液制成適宜濃度的菌懸液；取黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物加入3～5mL含0.05%（mL/mL）聚山梨酯-80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫，吸出孢子菌液至滅菌試管內(nèi)，制成適宜濃度的黑曲霉孢子懸液。

1.3.1.2 供試液的制備 取供試品10g，加pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液作稀釋劑至100mL，用勻漿儀混勻，制成1∶10的儲備液；再取10mL的儲備液，加pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋至100mL，搖勻，制成1∶100的供試品溶液。

1.3.1.3 需氧菌總數(shù)、霉菌及酵母菌總數(shù)計數(shù)方法驗證（平皿法）

1.3.1.3.1 試驗組 取1mL供試液，在供試液中分別加入銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌菌液或白色念珠菌和黑曲霉菌菌液小于100cfu，混勻，加入相應培養(yǎng)基，培養(yǎng)，計數(shù)。

1.3.1.3.2 菌液組 取小于100cfu的銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌菌液或白色念珠菌和黑曲霉菌菌液，注皿，培養(yǎng)，計數(shù)。

1.3.1.3.3 供試品對照組 取供試液1mL注入平皿，加入相應培養(yǎng)基，培養(yǎng)，計數(shù)。

1.3.1.3.4 培養(yǎng)條件 進行需氧菌總數(shù)計數(shù)方法適用性試驗時，使用胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為32℃，培養(yǎng)時間為3d。

進行霉菌及酵母菌總數(shù)計數(shù)方法適用性試驗時，使用沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為22℃，培養(yǎng)時間為5d。

1.3.1.3.5 回收率計算公式 試驗組回收率=（ 試驗組菌落數(shù)-供試品對照組菌落數(shù)）/菌液組菌落數(shù)。

1.3.1.4 控制菌檢查方法驗證 由于益母阿膠膏的藥材原料不含動物臟器，因此在控制菌檢查中只需要檢查大腸埃希菌一項。

1.3.1.4.1 試驗組 取1∶10供試液10mL加入到100mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，搖勻，加入80cfu的大腸埃希菌，于35℃培養(yǎng)18～24h后，取預培養(yǎng)物1mL接種至100mL麥康凱液體培養(yǎng)基中，于42～44℃培養(yǎng)24～48h。再取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板中，按照30 ～ 35℃培養(yǎng)18 ～ 72h后檢查。

1.3.1.4.2 供試品對照組 除不加試驗菌液外，其余按1.3.1.4.1項同法進行檢查。

1.3.1.4.3 菌液組 直接取菌液，按2.1.4.1項同法進行檢查。

表1 益母阿膠膏的需氧菌總數(shù)、霉菌及酵母菌總數(shù)計數(shù)方法驗證的平均回收率（%）

表2 益母阿膠膏的控制菌檢查方法驗證結(jié)果

表3 益母阿膠膏的微生物限度檢查結(jié)果

表4 益母阿膠膏的水分含量及相對密度測定結(jié)果

1.3.2 微生物限度檢查 取益母阿膠膏三批，按照上述已建立的微生物限度檢查方法，分別于第0，1，2，3，6，12月最后一天時取樣，按照《中國藥典》（2015年版）四部通則的1105項及1106項下[6]的微生物限度檢查法進行微生物限度檢查。

1.3.3 水分檢查 取益母阿膠膏三批，按照《中國藥典》（2015年版）四部通則0832項[6]有關(guān)水分的測定方法，采用烘干法分別于第0，1，2，3，6，12月最后一天時取樣，進行水分含量測定。

1.3.4 相對密度檢查 取益母阿膠膏三批，按照《中國藥典》（2015年版）四部通則0601項[6]有關(guān)相對密度的檢查方法，采用比重瓶法分別于第0，1，2，3，6，12月最后一天時取樣，進行相對密度測定。

2 結(jié)果

2.1 微生物限度檢查方法學驗證結(jié)果

需氧菌總數(shù)、霉菌及酵母菌總數(shù)計數(shù)方法適應性驗證結(jié)果見表1，控制菌檢查方法適應性驗證結(jié)果見表2。由結(jié)果可知，需氧菌總數(shù)、霉菌及酵母菌總數(shù)的平均回收率均大于70%，說明采用1∶100的稀釋法可以去除益母阿膠膏的抑菌能力，采用稀釋法聯(lián)合平皿法作為微生物限度的檢查方法是可行的。而建立的控制菌檢查方法結(jié)果呈陽性，說明該方法也是可行的。

2.2 益母阿膠膏的長期穩(wěn)定性實驗結(jié)果

益母阿膠膏的微生物限度、相對密度、水分含量的檢查結(jié)果見表3～4。由結(jié)果可知，在12個月內(nèi)，益母阿膠膏的微生物含量均符合《中國藥典》（2015年版）的有關(guān)要求，而其水分含量和相對密度在12個月內(nèi)的變化浮動均小于5%，說明其水分含量和相對密度質(zhì)量情況穩(wěn)定。

3 討論

本實驗的基本方組成中含有的當歸[7]、川芎[8]、桃仁[9]、益母草[10]、炮姜[11-12]等中藥均有抑菌性，藥物中若污染的微生物，在上述具有抑菌性中藥的影響下，常規(guī)的微生物限量檢查法下有可能出現(xiàn)陰性結(jié)果，但是隨著時間的推移，當藥物中的抑菌成分消除后或濃度降低時，這些微生物便可復蘇并繁殖，影響藥品質(zhì)量[13-14]。因此本實驗采用常規(guī)法進行需氧菌總數(shù)檢查和控制菌總數(shù)檢查時，需要先去除藥物中的抗菌活性。一般來說，中藥制劑采用稀釋法和薄膜過濾法以消除其抑菌活性[15]，項目組曾采用稀釋法（1∶20，1∶50，1∶100）3個稀釋級進行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)1：100稀釋級的回收率可達到50%～200%，可消除其抑菌活性。

長期以來膏方一直在江浙地區(qū)流行，并且服用時基本集中在冬季進補，在嶺南地區(qū)則難以推廣，其主要原因是在于氣候問題。因為傳統(tǒng)膏方富含糖類等營養(yǎng)成分，并且不添加任何防腐劑，在全國大部分地區(qū)的夏季，以及在氣候長年炎熱潮濕的嶺南地區(qū)，膏方均難以保存。隨著現(xiàn)代科技的發(fā)展，冰箱的出現(xiàn)解決了膏方儲存的難題，使得膏方這一傳統(tǒng)中醫(yī)劑型得以煥發(fā)新活力，在全國推廣使用。

而傳統(tǒng)中醫(yī)膏方的制作方法是采用銅鍋，直接以明火加熱，歷經(jīng)煎煮、濃縮、收膏、凉膏等多個步驟制作而成。由于現(xiàn)代制藥車間對于動用明火有嚴格的規(guī)定，必須要有相應的安全配套設施，符合消防安全的有關(guān)規(guī)定，因此國內(nèi)大部分制藥企業(yè)的GMP車間和醫(yī)療機構(gòu)的GPP車間，基本上都不會采用傳統(tǒng)的方法制作中醫(yī)膏方，所以國內(nèi)采用傳統(tǒng)方法制作膏方的醫(yī)療機構(gòu)，其膏方制作室基本上都是非潔凈車間，因此考察其質(zhì)量的長期穩(wěn)定性，從而判斷其安全性就顯得尤為重要。

本實驗結(jié)果表明，在常規(guī)傳統(tǒng)膏方的儲存條件下（陶瓷容器密封包裝、冰箱2～8℃條件下儲存），在12個月內(nèi)其水分含量、相對密度及微生物含量均符合《中國藥典》（2015年版）的有關(guān)規(guī)定，并且質(zhì)量情況穩(wěn)定。進一步探究傳統(tǒng)膏方能夠通過長期穩(wěn)定性試驗的原因，與其制作工藝、物質(zhì)狀態(tài)、產(chǎn)品包裝都密切相關(guān)。從制作工藝來說，明火直接煎煮濃縮直至收膏的工藝，長時間的高溫沸騰狀態(tài)可殺滅多種病原微生物；從物質(zhì)狀態(tài)來說，膏方其實是一種高度濃縮的半固體狀制劑，即膏體處于高滲狀態(tài)，再加上儲存于2～8℃的條件下，微生物的繁殖受到抑制[16]，難以生長；從產(chǎn)品包裝來看，選用密封性能好的容器在消毒滅菌后盛裝膏方，也有助膏方的質(zhì)量保持穩(wěn)定。