沈陽市交通相關的PM2.5 對孕鼠呼吸道菌群及胎鼠生長發(fā)育影響研究

王水苗， 張迪， 范榮華， 商磊， 張陽蕾

（1. 沈陽醫(yī)學院基礎醫(yī)學院臨床醫(yī)學專業(yè)學生， 遼寧 沈陽110034； 2. 公共衛(wèi)生學院衛(wèi)生檢驗教研室； 3. 藥學院藥理學教研室； 4. 沈陽市第十人民醫(yī)院）

沈陽作為我國重要的工業(yè)基地［1］， 大氣污染問題日益突出。 PM2.5是指大氣中直徑≤2.5 μm 的顆粒物［2］， 與呼吸系統(tǒng)疾病、 心腦血管疾病、 免疫疾病以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展等有著密切聯(lián)系［3］。通過對大氣污染物與高血壓大鼠呼吸道微生態(tài)的影響研究發(fā)現(xiàn)， 暴露于大氣污染物中可導致高血壓大鼠口咽部細菌出現(xiàn)菌群失調， 破壞機體的微生態(tài)平衡［4］。 國內外大量研究表明， PM2.5通過呼吸進入母體后， 不僅能夠影響孕婦本身的狀態(tài)，而且可能通過其他途徑造成胎兒早產、 流產、 死胎、 吸收胎、 子代出生體重降低等不良妊娠， 具有一定的胚胎毒性［5－10］， 動物實驗研究也證實了這一點［11］。 相關研究發(fā)現(xiàn)， PM2.5等空氣污染物和菌群失調常與兒童哮喘發(fā)作有關［12］。 但PM2.5暴露所致的孕鼠呼吸道菌群失調與胎兒生長發(fā)育的關系目前并不清楚。 本研究采用16S rDNA 高變區(qū)測序分析沈陽市交通相關的PM2.5對Wistar 孕鼠呼吸道微生態(tài)和對胎鼠生長發(fā)育造成的影響， 探討PM2.5改變孕鼠呼吸道微生態(tài)與胎鼠生長發(fā)育的聯(lián)系， 以期為孕婦和胎兒健康的相關研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 選取SPF 級Wistar 大鼠雄性10 只， 雌性20 只， 體重（200±10） g， 均未經生育交配， 由沈陽醫(yī)學院實驗動物中心提供， 實驗動物許可證號： SYXK （遼） 2015－0001）， 常規(guī)飼養(yǎng)于沈陽醫(yī)學院實驗動物中心。 實驗初始將發(fā)情期雌鼠與雄鼠按照2∶1 比例合籠飼養(yǎng)， 次日清晨采用顯微鏡觀察法確定雌鼠是否懷孕， 鏡下可見精子團或肉眼可見陰道栓者記為孕1 d。 隨后將受孕成功的20 只雌鼠隨機分為實驗組和對照組，每組10 只。

1.2 主要試劑及儀器 沈陽市空氣污染細顆粒物（采集于沈陽市黃河北大街） 制成混懸液； 無菌咽拭子培養(yǎng)管（蘇州康健醫(yī)療器械有限公司）； 顯微鏡（北京瑞科中儀科技有限公司）； 超聲儀（必能信超聲上海有限公司）； TE－6070VFC 大流量顆粒物采樣器（美國Tisch Environmental 公司）； 低溫高速離心機（美國Sigma 公司）； HRH－MNE 型動物口鼻吸入暴露系統(tǒng)（北京慧榮和科技有限公司）； －80 ℃低溫冰箱（日本Panasonic 公司）； 純水機（美國Milli－Q Integral 公司）； 16S rDNA 高變區(qū)測序分析（廣州基迪奧生物公司）。

1.3 方法

1.3.1 PM2.5標本采集與混懸液制備 將恒重超純石英纖維濾膜放置在沈陽醫(yī)學院交通活躍、 生活污染區(qū)距地面高1.6 m 的大流量顆粒物采樣器內，于冬季采暖期收集大氣細污染物PM2.5， 24 h 持續(xù)采樣， 采集6 個月。 采樣前濾膜干燥稱重， 采樣后的濾膜剪成3 cm×3 cm 的方塊， 置于提前備好的含有100 ml 超純水的燒杯中， 常溫（25 ℃） 超聲震蕩3 次（15 min／次）， 收集震蕩后粗洗液并用6 層紗布過濾， 除去殘渣。 后將濾過液離心（1 000 r／min） 1 h， 棄上清， 收集底部混懸液。

1.3.2 PM2.5暴露孕鼠模型 將實驗組孕7 d 孕鼠放入動物口鼻吸入暴露系統(tǒng)的口鼻暴露室內以1.3 mg／m3細顆粒物的濃度霧化吸入PM2.5至孕20 d，隔天暴露一次（4 h／次）， 共暴露7 次； 對照組以同等方式等量霧化吸入超純水。

1.3.3 標本的采集 孕20 d 用微生物專用無菌咽拭子棉簽采集孕鼠咽后壁的菌群樣本（注意取樣時勿致口腔咽頰及舌黏膜出血）， 采樣后標記并立即放入－80 ℃冰箱內低溫保存。 完成咽拭子標本的采集后， 用乙醚麻醉和頸椎脫位法將孕鼠處死后剖腹， 取出子宮稱取窩重。 剖開子宮取出全部胎鼠， 記錄每窩胎鼠數(shù)并測量每窩胎鼠重量和胎盤重， 以及單只胎鼠的體重、 體長， 比較不良妊娠結局。

1.3.4 16S rDNA 高變區(qū)測序分析 采用16S rDNA高變區(qū)測序方法對孕鼠口咽部菌群進行分析鑒定。 經過基因組DNA 提取、 PCR 擴增、 建庫和測序以及數(shù)據(jù)處理與分析獲得OTU 后， 依次進行物種注釋、 Alpha 多樣性分析、 Beta 多樣性分析等群落功能預測， 在有效分組的情況下進行組間差異檢驗及差異比較。 與環(huán)境因子結合進行特定的高級分析， 確定呼吸道微生態(tài)與PM2.5暴露之間的關系。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析， 計量資料采用均數(shù)±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t 檢驗和Wilcoxon 秩和檢驗進行統(tǒng)計分析， 以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 OTU 分析 本研究共得到7 174 個OTU。 選取比較分組平均豐度大于1 的所有OTU （即高豐度并集OTU） 進行韋恩圖分析得到， 兩組間共有的OTU 數(shù)為208 個， 分別占實驗組和對照組OTU總數(shù)的86%和36%； 實驗組和對照組獨有OTU 數(shù)分別為33 個和370 個， 實驗組較對照組的微生物種類更加集中， 見圖1。

圖1 PM2.5暴露后組間比較的韋恩圖

2.2 Alpha 多樣性分析 本研究繪制稀釋曲線（rarefaction curve）， 見圖2， 并采用Chao1、 Ace、Shannon、 Observed _ species、 Simpson 和Goods_coverage六大類常用統(tǒng)計方法分析Alpha 多樣性，見表1。 結果可以看出， PM2.5暴露影響孕鼠口咽部微生物的多樣性， 對照組的多樣性高于實驗組。

圖2 樣品在0.03 距離下的OTU 稀釋曲線圖

2.3 Beta 多樣性分析 利用R 語言的Pheatmap包， 以熱圖形式展示組間Weighted 和Unweighted Unifrac 指數(shù)， 見圖3； 基于樣本間的Weighted 和Unweighted Unifrac 數(shù)據(jù)結果， 繪制PCoA 圖形， 見圖4。 結果顯示， 實驗組較對照組的微生物種類少。

2.4 物種分類分析 經物種分類熱圖分析， 20 個樣品中總共有19 個門、 32 個綱、 47 個目、 73 個科、 114 個屬、 36 個種被鑒定， 結果見圖5。

2.5 物種差異分析 通過LEfSe 分析組間菌群差異， 找出實驗組和對照組之間差異顯著的物種，見圖6。 通過組間菌群差異數(shù)據(jù)表更加清晰地體現(xiàn)各主要差異菌群在實驗組與對照組間的差異， 見表2。 上述實驗結果顯示， 變形菌門、 擬桿菌門及厚壁菌門細菌在實驗組和對照組差異明顯。

圖3 樣本間Weighted （A） 和Unweighted Unifrac （B） 指數(shù)熱圖

2.6 窩重、 胎盤重量及不良妊娠結局 實驗組窩重低于對照組（P＜0.05）。 實驗組胎鼠的胎盤重量低于對照組， 但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表3。 實驗組中2 只孕鼠流產， 解剖后可見子宮明顯擴張但宮內無胎鼠。

2.7 胎鼠生長發(fā)育情況 實驗組每窩胎鼠數(shù)量少于對照組（P＜0.05）。 實驗組胎鼠平均體重、 平均體長均低于對照組， 但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）， 見表4。

圖4 基于Weighted （A） 和Unweighted Unifrac （B） 距離的PCoA 分析

圖5 物種分類熱圖

表2 實驗組和對照組的LEfSe 結果

續(xù)表2

表3 實驗組和對照組胎鼠窩重和胎盤重的比較

表3 實驗組和對照組胎鼠窩重和胎盤重的比較

注：*實驗組有2 只孕鼠流產。 與對照組比較，1）P ＝0.003

組別 n 窩重（g） 胎盤重量 （g）對照組 10 45.03±12.29 0.51±0.07實驗組 8* 23.82±13.371） 0.39±0.20

圖6 LEfSe 差異分析圖（柱狀圖的長度代表差異物種的影響大?。?/p>

表4 實驗組和對照組每窩胎鼠數(shù)及胎鼠平均體重、 平均體長的比較（）

表4 實驗組和對照組每窩胎鼠數(shù)及胎鼠平均體重、 平均體長的比較（）

注：*實驗組有2 只孕鼠流產。 與對照組比較，1）P ＝0.026

組別 鼠數(shù)（n） 每窩胎鼠數(shù)（個） 平均體重（g） 平均體長（g）對照組 10 11.00±3.50 2.38±0.12 3.31±0.11實驗組 8* 6.30±5.061） 2.17±1.20 2.65±1.35

3 討論

本實驗主要研究對象為孕鼠， 為了更好地模擬孕期受大氣PM2.5影響， 考慮到孕婦孕期PM2.5暴露頻率及時長， 故選擇隔天暴露（4 h／次） 作為本研究的暴露方式。 Wistar 大鼠孕期通常為19 ～23 d， 本試驗選擇21 d 作為大鼠妊娠周期。 張銘［13］研究結果表明， 模仿人類妊娠周期可以將Wistar 大鼠的妊娠周期分為3 個階段， 孕早期為懷孕后1～7 d， 孕中期為懷孕后8 ～14 d， 孕晚期為懷孕14 d 以后。 考慮到孕早期母體各項指標均不穩(wěn)定， 易導致意外流產、 畸形等不良妊娠結局，故選擇大鼠孕中期初始即孕7 d 開始進行造模。

PM2.5可以改變呼吸道正常菌群定植、 破壞呼吸道微生態(tài)， 從而引發(fā)呼吸系統(tǒng)疾?。?4］。 本研究采用16S rDNA 高通量測序技術對PM2.5暴露后孕鼠呼吸道菌群變化進行分析。 菌屬重疊結果顯示，實驗組獨有OTU 數(shù)明顯少于對照組， 表明PM2.5暴露可使孕鼠呼吸道菌群呈減少的趨勢。 由表1 可知， 實驗組和對照組間Chao1 指數(shù)和Ace 指數(shù)存在顯著差異， 說明暴露孕鼠和非暴露孕鼠呼吸道菌群的豐富度存在不同。 經過物種差異分析， 本研究共發(fā)現(xiàn)3 種組間差異明顯的細菌門， 包括變形菌門、 擬桿菌門及厚壁菌門， 且三種菌門的物種最高豐度平均值均高于對照組， 差異有統(tǒng)計學意義。 本實驗結果中實驗組和對照組間菌群豐度、數(shù)量、 多樣性等發(fā)生變化， 意味著當大氣污染達到一定時間和濃度時， 微生物防線被打破， 口咽部菌群改變。 張莉等［15］通過PM2.5對大鼠咽部微生態(tài)的影響研究， 發(fā)現(xiàn)吸入PM2.5后大鼠咽部菌群中正常菌的檢出率明顯降低， 而致病菌和條件致病菌檢出率明顯增加。 該研究表明PM2.5可以破壞大鼠咽部微生態(tài)平衡， 早期主要表現(xiàn)為需氧菌菌群失調， 晚期可發(fā)生厭氧菌菌群失調。 郭杰［16］利用16S rDNA 高變區(qū)測序分析法探討PM2.5對Wistar 大鼠呼吸道微生態(tài)的影響研究， 發(fā)現(xiàn)PM2.5暴露對Wistar 大鼠的口咽部呼吸道微生態(tài)優(yōu)勢菌菌群構成有影響， 并表明這些菌群相對比例變化可能與人群的肺炎和支氣管疾病等相關。

此外， 實驗組γ－變形菌綱中， 專性好氧菌及兼性厭氧菌檢出率減少； 擬桿菌綱中， 普雷沃氏菌檢出率減少。 文獻報道， 健康人群的呼吸道黏膜表面定居著以厚壁菌門、 變形菌門、 擬桿菌門為主的大量細菌［17］。 研究表明， 慢性阻塞性肺疾病患者支氣管肺泡灌洗液中變形菌門豐度增加［18］；哮喘患者氣道內擬桿菌門中的普雷沃氏菌比例低于正常人群［19］。 說明大鼠呼吸道優(yōu)勢菌群與人類非常相似， 人類呼吸道微生態(tài)與多種呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展有密切關系。 本研究16S rDNA 高通量測序結果表明， PM2.5暴露可致Wistar 孕鼠呼吸道中的厚壁菌門、 變形菌門和擬桿菌門等正常菌群豐度及數(shù)量減少、 多樣性降低， 即PM2.5暴露可致孕鼠呼吸道菌群構成發(fā)生變化， 提示PM2.5暴露可能引起孕婦孕期口咽部菌群改變， 破壞呼吸道微生態(tài)平衡， 從而引起生理機能發(fā)生改變。

本研究統(tǒng)計學分析胎鼠生長發(fā)育相關數(shù)據(jù)顯示， 實驗組窩重明顯減輕、 每窩胎鼠數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義， 表明PM2.5可致胎鼠總數(shù)減少、 窩重減輕， 提示PM2.5暴露對妊娠有一定影響。 且對照組整體標準差較小， 顯示PM2.5可致胎鼠胎盤重量和體重減輕、 體長減小。 文獻報道，大氣污染可通過影響孕婦的呼吸、 心血管等系統(tǒng)，進而影響子宮、 胎盤和臍血血流， 導致新生兒低體重、 胎兒生長遲緩或早產［20］。 Kannan 等［21］研究表明， 空氣顆粒物可通過全身氧化應激和炎癥反應、 血凝變化、 內皮功能和血流動力學的變化等生物學作用途徑， 單獨或聯(lián)合起作用影響胎盤和胎兒。 Perera 等［22］研究表明， 空氣污染可導致胎兒體重減輕、 體長減少等不良出生結局。 本研究統(tǒng)計學分析結果表明， PM2.5暴露可導致一定比例的孕鼠流產； 未流產孕鼠與對照組相比， 可引起胎鼠總數(shù)減少， 窩重、 胎盤重量和胎鼠體重減輕， 體長減少的趨勢。 即PM2.5暴露能夠對孕期胎鼠生長發(fā)育產生不良影響。

綜上所述， PM2.5暴露可打破孕鼠呼吸道微生態(tài)平衡， 引起呼吸道菌群失調， 同時對胎鼠生長發(fā)育產生不良影響。 在大氣嚴重污染的天氣情況下， 孕婦出行前應做好相應防護措施或盡量避免外出， 以減少或避免PM2.5對自身和胎兒的危害。