酮康唑抑制氧化亞油酸代謝物介導(dǎo)的外周炎性疼痛機(jī)制*

黃文濤，程璐，張耕，胡松

(武漢市第一醫(yī)院藥學(xué)部，武漢 430022)

組織損傷導(dǎo)致炎癥遞質(zhì)的釋放，這些炎癥遞質(zhì)使外周傷害感受器敏感并激活，從而導(dǎo)致對背角神經(jīng)元的傳入攻擊。瞬時(shí)受體電位香草酸亞型-1(transient receptor potential vaniuoed 1，TRPV1)受體是配體門控的陽離子通道，在某些傷害感受器上表達(dá)，被有害刺激如熱激活，并介導(dǎo)炎性熱痛覺過敏[1-2]。在組織炎癥過程中，TRPV1活性受多種遞質(zhì)調(diào)節(jié)，如花生四烯酸代謝物、緩激肽、神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)和前列腺素[3-5]。激活的一類內(nèi)源性遞質(zhì)TRPV1由氧化亞油酸代謝產(chǎn)物(oxidized linoleic acid metabolites，OLAM)組成，即9-和13-羥基-10E，12Z-十八二烯酸(9-HODE和13-HODE)及其代謝產(chǎn)物(9-氧自由基和13-氧自由基)。亞油酸為不飽和脂肪酸，在生物體內(nèi)金屬離子作用下氧化，可以轉(zhuǎn)變?yōu)棣?亞麻酸，并繼而生成為花生四烯酸。研究報(bào)道OLAM是，在炎癥條件下合成的，如動(dòng)脈粥樣硬化和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎[6-8]，慢性胰腺炎患者血清中OLAM含量顯著增加[9]。此外，一些研究小組還檢測OLAM在內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞[10-11]，以及在組織炎癥過程中激活的細(xì)胞類型。然而，研究發(fā)現(xiàn)OLAM能夠激活外周組織和脊髓背角的TRPV1[12]。重要的是，由于不知道OLAM在組織炎癥期間是否促進(jìn)外周TRPV1的激活，所以對這個(gè)系統(tǒng)的認(rèn)識存在差距。酮康唑可通過干擾細(xì)胞色素P450酶的活性，抑制真菌細(xì)胞膜主要固醇類——麥角固醇的生物合成，造成真菌細(xì)胞膜損傷并改變其通透性，造成重要的細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外漏而殺傷真菌細(xì)胞[13]。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 除了一組野生型和TRPV1基因敲除為C57BL/6小鼠外，其他動(dòng)物組為雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均購自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK(粵)2016-0041；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號：SYXK(粵)2016-0167。動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)前至少飼養(yǎng)7 d，每日17:00～18:00喂食，不論前日飼料有無剩余，均加入當(dāng)日相應(yīng)量飼料，大鼠自由飲水。每日明暗時(shí)間各為12 h，室溫保持在22～25 ℃，相對濕度約50%。

1.2試藥 酮康唑注射液(深圳市思美泉生物科技有限公司，批號：2016-0523，規(guī)格：每支15 g)；亞油酸(linoleic acid，LA，深圳市思美泉生物科技有限公司，批號：2016-1185)；抗9-HODE抗體(南京碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：11252589)；抗13-HODE抗體(南京碧云天生物技術(shù)有限公司，批號： 001240762)；弗羅因德佐劑(CFA，北京恒業(yè)中遠(yuǎn)化工有限公司，批號：2017-08656)。

1.3儀器 貝克曼免疫分析儀(美國貝克曼公司)；501型超級恒溫器(重慶浩為試驗(yàn)儀器有限公司)；24孔聚D-賴氨酸包被板(南京碧云天生物技術(shù)有限公司)；尼康TE 2000 U顯微鏡(日本尼康公司)。

1.4三叉神經(jīng)節(jié)(trigeminal ganglion，TG)培養(yǎng) 使用培養(yǎng)1 d的大鼠TG。從正常大鼠中分離TG，用聚D-賴氨酸/層粘連蛋白包被的玻璃蓋玻片電鍍，置于10%胎牛血清(fetal calf serum，F(xiàn)BS)和100 ng·mL-1NGF中。將3只大鼠的TGs按文獻(xiàn)[14]所述方法培養(yǎng)，并置于24孔聚D-賴氨酸包被板上，每孔8000個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng)液在24 h后替換，48 h后再次替換。所有實(shí)驗(yàn)均在神經(jīng)元培養(yǎng)第5天進(jìn)行。

1.5鈣成像 熒光成像法測量感覺神經(jīng)元鈣的蓄積。TG培養(yǎng)物與鈣敏感染料Fura-2AM在Hanks改良緩沖液中孵育。用顯微鏡進(jìn)行熒光檢測。利用MetaFaulor軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行收集和分析。鈣離子流入的凈變化通過減去細(xì)胞內(nèi)鈣[Ca2+]i水平計(jì)算接觸到激動(dòng)劑后達(dá)到的[Ca2+]i值。細(xì)胞用載體或酮康唑(30 μmol·L-1)進(jìn)行預(yù)處理，15 min后再加入LA(1 mmol·L-1)，酮康唑組增加2 min。每個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，應(yīng)用LA后，給予250 mmol·L-1氯化鉀溶液。雙波長激發(fā)(340/360 nm)的比值超過0.03被認(rèn)為是對鈣離子流入的積極反應(yīng)。

1.6脂質(zhì)提取物的制備 大鼠注射CFA 20 h后，在頸部注射載體或酮康唑9.5 mg·kg-1，皮下注射。注射藥物4 h后，處死動(dòng)物，用6 mm穿孔器收集炎癥后足組織。將組織切成小塊，轉(zhuǎn)入抗山羊IgG抗體(HBSS)中，37 ℃洗滌，平衡30 min。然后將組織轉(zhuǎn)移到含有載體或酮康唑(150 μmol·L-1)的新鮮HBSS緩沖液中，37 ℃下孵育1 h。在氮?dú)?N2)環(huán)境下，干燥樣品，再懸浮在HBSS中，并應(yīng)用于培養(yǎng)的感覺神經(jīng)元，以確定降鈣素與基因相關(guān)肽(calcitonin gene related peptide，CGRP)釋放。

1.7CGRP釋放分析和放射免疫測定 用培養(yǎng)5 d的TG在HBSS溶液中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在最初的清洗和收集之后，這些神經(jīng)元在發(fā)炎的皮膚上親脂萃取物之前的15 min，給予媒介物或TRPV1拮抗劑(I-RTX)前處理15 min。收集遞質(zhì)，并在貝克曼免疫分析儀上進(jìn)行CGRP的放射免疫分析。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8行為測定

1.8.1痛閾值的測定 將抗9-HODE抗體和抗13-HODE抗體各25 μg的混合物50 μL，或熱變性抗體50 μL，注射到發(fā)炎24 h的大鼠后足。注射后15， 30，60 min，測量大鼠熱閾值。為了研究酮康唑?qū)FA熱痛覺過敏的影響，在注射CFA造模前30 s，在同側(cè)后足注射酮康唑1次，24 h后注射酮康唑1次。在第2次注射酮康唑后1 h，用熱板法測定痛閾值。

1.8.2非綜合行為時(shí)間的測定 ①大鼠注射CFA造炎癥模型前30 s及注射CFA后24 h，對側(cè)足內(nèi)分別注射載體或酮康唑(相同劑量)，1 h后測量熱痛覺過敏。②將LA(10，100或1000 μg)或載體(50 μL)足底注射到正常和炎癥模型大鼠后足中，每2 min記錄一次傷害性反應(yīng)，直至15 min。③在野生型和TRPV1KO小鼠進(jìn)行同樣實(shí)驗(yàn)，方法同上。記錄動(dòng)物非綜合行為時(shí)間。

1.8.3傷害性行為時(shí)間的測定 大鼠后足注射CFA造炎癥模型，24 h后進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。①大鼠后足皮下注射辣椒堿(50 mg·kg-1)或載體，1 h后注射LA 1000 μg。②大鼠足底注射抗9-和抗13-HODE抗體混合物(每種25 μg)或非特異性山羊IgG，，10 min后注射LA 1000 μg。③大鼠在給予LA(1000 μg)前30 min，足底注射酮康唑(4 μg)或載體。記錄大鼠出現(xiàn)傷害性行為的時(shí)間。

2 結(jié)果

2.2OLAM通過抑制CYP減少炎癥性熱痛覺過敏作用 結(jié)果見圖1A和1B。CFA顯著誘導(dǎo)熱痛覺過敏，在24 h效果仍然明顯。注射HODE抗體(圖1A)，在足底注射后30 min，熱痛覺過敏明顯逆轉(zhuǎn)，熱變性抗體(圖1B)無明顯逆轉(zhuǎn)。在未發(fā)炎足中熱潛伏期接受兩種抗體的混合物 (圖1C)或變性抗體(圖1D)沒有變化。

與媒介物組比較(圖2A和2B)，足底注射酮康唑1 h后，發(fā)炎足明顯減少炎性熱痛敏。這種效果是注射酮康唑后的外周調(diào)節(jié)作用在側(cè)后肢，對炎癥足無影響。

2.2酮康唑抑制內(nèi)源性TRPV1的釋放受體激動(dòng)劑 培養(yǎng)的TG神經(jīng)元在使用遞質(zhì)進(jìn)行預(yù)處理后，隨后進(jìn)行LA刺激，[Ca2+]i增長3倍，至0.156±0.01。酮康唑預(yù)處理后，[Ca2+]i為(0.027±0.01)，消除LA對 [Ca2+]i增強(qiáng)的影響(P<0.005)。

①與空白組比較，P P

①與空白組比較，P

再懸浮的提取物培養(yǎng)TG引起CGRP的釋放增至(980.39±21.04)%，與I-RTX共同處理提取物的CGRP釋放減弱至(200.31±10.01)%，CFA/酮康唑+遞質(zhì)處理提取物的CGRP釋放減弱至(498.03±13.02%)。

2.3炎癥過程中亞油酸誘發(fā)的不良反應(yīng)具有TRPV1依賴性 與遞質(zhì)組比較，正常大鼠后足注射LA后，自發(fā)性傷害性反應(yīng)行為的時(shí)間增加不顯著。在CFA炎癥模型建立后24 h，足底注射LA產(chǎn)生劑量依賴的傷害性鎮(zhèn)痛效應(yīng)。見表1。

表1 CFA對TRPV釋放的影響

組別與劑量自發(fā)性傷害性反應(yīng)行為的時(shí)間/s正常 遞質(zhì)組0.39±0.04 LA 1000 μg組3.31±0.01CFA炎癥模型組 遞質(zhì)組45.03±3.02 LA 10 μg組58.91±5.23 LA 100 μg組78.39±9.04 LA 1000 μg組148.92±13.42F28.459P<0.05

在CFA炎癥模型中，注射LA，非綜合行為時(shí)間為(59.39±10.04)s，而使用CPZ預(yù)處理，非綜合行為時(shí)間為(20.31±8.01)s，可顯著減少被喚起的非綜合行為(t=12.113，P<0.05)。野生型小鼠CFA炎癥模型中，注射LA后，非綜合行為時(shí)間為(42.39±8.10)s；而在基因敲除TRPV1小鼠中，僅注射遞質(zhì)，非綜合行為時(shí)間為(5.31±0.41)s，注射LA后，非綜合行為的時(shí)間為(20.13±5.72) s，顯著延長(F=51.263，P<0.05)。

2.4抗HODE抗體抑制LA誘導(dǎo)的疼痛 遞質(zhì)組大鼠傷害性行為時(shí)間為(2.11±0.10) s，遞質(zhì)+LA組為(37.02±4.13) s，抗IgG+LA組為(43.28±5.10) s，抗9-HODE+抗13-HODE +LA組傷害性行為時(shí)間下調(diào)至(12.03±4.13)s，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=40.902，P<0.05)。

2.5酮康唑抑制LA誘導(dǎo)疼痛 遞質(zhì)組大鼠傷害性行為時(shí)間為(2.45±0.14) s，遞質(zhì)+LA組為(36.42±6.13) s， 酮康唑+LA組傷害性行為時(shí)間下調(diào)至(11.28±4.10) s，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=69.132，P<0.05)。

3 討論

酮康唑?qū)儆谶溥蝾惪拐婢帲瑢φ婢溄晴薮嫉裙檀嫉纳锖铣删哂幸种谱饔?；對真菌?xì)胞膜具有損傷，可改變其通透性，引起胞內(nèi)重要物質(zhì)漏失；同時(shí)也可抑制真菌的三酰甘油和磷脂的生物合成，抑制氧化和過氧化酶的活性，致過氧化物在胞內(nèi)過度積聚，造成真菌亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)變性和壞死。亞油酸的氧化代謝物在炎癥條件下升高，如動(dòng)脈粥樣硬化、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和慢性胰腺炎[15]。9-HODE、13-HODE及其代謝物是內(nèi)源性TRPV1激動(dòng)劑，本研究通過其在炎癥熱痛覺過敏中的作用，擴(kuò)大對OLAMs的認(rèn)識。因此，OLAM不僅可以介導(dǎo)感覺神經(jīng)元對熱刺激的急性反應(yīng)[16]，而且還可以參與慢性炎癥的發(fā)生。由于酮康唑是一種廣泛作用的氧化酶抑制劑，可以抑制發(fā)炎皮膚釋放內(nèi)源性TRPV1激動(dòng)劑，抑制CFA誘導(dǎo)的熱痛覺過敏，抑制外源性亞油酸對誘發(fā)自發(fā)性傷害行為的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，外源性亞油酸會在注射到發(fā)炎部位時(shí)觸發(fā)自發(fā)的行為，但不能控制后爪組織。這種影響與亞油酸呈劑量相關(guān)。并且用抗9-HODE和抗13-HODE抗體的預(yù)處理可以顯著降低亞油酸的影響，使這些遞質(zhì)對自發(fā)的不良行為產(chǎn)生影響。而這種免疫化實(shí)驗(yàn)并沒有完全阻止亞油酸的綜合效應(yīng)。這種不完全的敲除可能是由于非HODE OLAMs的形成，例如，9-OXOODE或13-對非OLAM機(jī)制，或抗體量不足。事實(shí)上，基因芯片研究已經(jīng)指出在注射CFA后，CYP上調(diào)[17]，包括CYP3A1，一種表達(dá)在TRPV1+神經(jīng)元的酶。本研究發(fā)現(xiàn)，酮康唑具有抗痛覺過敏作用。酮康唑的這種作用是外周介導(dǎo)的，因?yàn)樽⑸涞綄?cè)后肢沒有效果。這種效應(yīng)歸因于OLAM的抑制作用。酮康唑阻斷亞油酸誘導(dǎo)培養(yǎng)神經(jīng)元中[Ca2+]i升高，并顯著降低亞油酸誘導(dǎo)的大鼠行為[18]。

酮康唑抑制內(nèi)源性TRPV1激動(dòng)劑從炎癥組織中釋放。然而，由于酮康唑抑制多種氧化酶，包括CYP，其生化作用機(jī)制需要進(jìn)一步研究。因此，酮康唑在損傷部位藥理作用，表明它可能作為新型外周活性鎮(zhèn)痛劑的原型。OLAMs在外周炎性熱痛覺過敏中發(fā)揮作用，并且提示氧化酶，如CYP同工酶在OLAM合成中起重要作用?？筄LAM抗體減少CFA誘導(dǎo)的熱痛覺過敏和亞油酸誘發(fā)的傷害性鎮(zhèn)痛行為的發(fā)現(xiàn)有力地支持OLAM在組織炎癥過程中旁分泌功能，因?yàn)榭贵w不太可能通過血管膜。鑒定表達(dá)這些酶的細(xì)胞類型和驅(qū)動(dòng)OLAM合成的特異性異構(gòu)體可為新型鎮(zhèn)痛藥物的開發(fā)提供潛在的靶點(diǎn)。

綜上所述，氧化亞油酸代謝物對周圍的炎癥性產(chǎn)生痛覺，而CYP酶在調(diào)節(jié)OLAM對炎癥性熱痛覺過敏的作用方面起著至關(guān)重要的作用。