亮菌甲素原輔料及其注射劑細胞毒性研究*

汪玉馨，唐婉，劉洋，孟長虹，陸益紅，，史清水，王廣基

(1.中國藥科大學藥物代謝動力學重點實驗室，南京 210009；2.江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院藥理毒理研究中心，南京 210019；3.徐州醫(yī)科大學新藥研究與臨床藥學重點實驗室，徐州 221004)

亮菌甲素又稱假蜜環(huán)菌甲素(armillarisin A)，為一種香豆素類化合物，是從我國擁有自主知識產權的環(huán)菌屬假蜜環(huán)菌中培養(yǎng)分離出的活性成分，具有促進膽汁分泌和對膽道末端括約肌的松弛、解痙作用，主要用于治療急慢性膽囊炎、急性膽源性胰腺炎、黃疸型肝炎、急慢性淤膽型肝炎、肝炎肝硬化重度膽汁淤積癥等[1-4]。由于亮菌甲素在水中幾乎不溶，常需加聚維酮 K30、丙二醇等輔料提高溶解度以滿足臨床用藥需求[5]，而輔料的安全性問題也越來越受到國內外的關注。除無菌、細菌內毒素不符合要求會導致安全風險外，注射用輔料潛在的過敏性、刺激性、溶血性和基因毒性以及注射用輔料與主藥之間的配伍不當均可導致安全性問題的發(fā)生[6-8]，因此，對于注射用輔料必須要有嚴格的安全性與質量要求。

根據(jù)前期亮菌甲素原輔料及其注射劑肌肉刺激、血管刺激及溶血安全性評價研究發(fā)現(xiàn)，亮菌甲素注射液對肌肉、血管刺激性大于注射用亮菌甲素，且其溶血率也接近標準限度，考慮其劑型不同安全性也存在一定差異，為了對在體試驗結果進行驗證，筆者比較不同生產企業(yè)、不同原輔料之間的細胞毒性是否存在差異，進一步考察亮菌甲素原輔料及其制劑在小鼠成纖維細胞(L929)上的毒性反應，為亮菌甲素注射劑原輔料來源的選擇、處方、工藝及劑型優(yōu)化提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1儀器與試劑 生物安全柜(美國賽默飛世爾科技公司，型號：Thermo 1300series A2)、5%二氧化碳(CO2)箱培養(yǎng)箱(德國Memmert公司)、倒置顯微鏡(日本奧林巴斯株式會社，型號：OLYMPUS IX53)、光學顯微鏡(日本奧林巴斯株式會社，型號：OLYMPUS BX41)、高壓蒸汽滅菌器(日本松下電器株式會社，型號：Panasonic MLS-3781L)、細胞計數(shù)儀(Countstar BioMed，上海睿鈺生物科技有限公司)、培養(yǎng)瓶(美國Costar公司，規(guī)格：25 mL)。二甲亞砜(DMSO，美國Solarbio生化試劑公司，批號： 1213C0341)、1640培養(yǎng)基(GIBCO公司，批號：8118167)、小牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司，批號：20170106)、0.25%胰酶消化液(HyClone公司，批號：J180013，)，細胞株[ATCC CCL1 NCTC clone 929(小鼠成纖維細胞)，上海細胞研究所]。

1.1.2實驗樣品 亮菌甲素注射劑生產企業(yè)、規(guī)格、批號及其原料來源相關信息見表1，其中注射用亮菌甲素有3家生產企業(yè)，3個規(guī)格，每個規(guī)格2批，共8批；亮菌甲素注射液生產企業(yè)僅1家，2個規(guī)格，共4批；原料生產企業(yè)有3家，由4個制劑生產企業(yè)提供，共4批。實驗時除原料用DMSO溶解后，用1640培養(yǎng)液(含10%小牛血清)稀釋外，其他均直接用1640培養(yǎng)液(含10%小牛血清)稀釋。

亮菌甲素注射液各輔料濃度分別為聚維酮K30 0.25%、N，N-二甲基乙酰胺5%、丙二醇30%、聚乙二醇400 1%、聚乙二醇6000 5%、聚山梨酯80 0.5%、硫脲0.06%，同時按上述濃度配制輔料總混液，配制后高壓滅菌。

注射用亮菌甲素各輔料濃度分別為甘露醇58.5%、精氨酸39%、枸櫞酸鈉10%，配制后高壓滅菌。

表1 亮菌甲素制劑及原料相關信息

Tab.1 The information of armillarisin A injections as well as its raw materials

劑型與生產企業(yè)規(guī)格批號備注注射用亮菌甲素 企業(yè)A2.5 mgA-1原料來源企業(yè)EA-2 企業(yè)B5 mgB-1原料來源企業(yè)GB-2 企業(yè)C5 mgC-1原料來源企業(yè)GC-2 企業(yè)C1 mgC-3原料來源企業(yè)GC-4亮菌甲素注射液 企業(yè)D10 mL5 mgD-1原料來源企業(yè)GD-2 企業(yè)D2 mL1 mgD-3D-4原料 企業(yè)EE-1企業(yè)A提供 企業(yè)FF-1企業(yè)F提供 企業(yè)GG-1企業(yè)B提供 企業(yè)GG-2企業(yè)G提供

1.2實驗方法

1.2.1L929細胞毒性實驗 將已培養(yǎng)48～72 h細胞生長旺盛的L929細胞用0.25%胰酶消化液，消化數(shù)秒，加入細胞培養(yǎng)液6 mL，用吸管把細胞從瓶壁上吹打下來，混勻后用血細胞計數(shù)板在細胞計數(shù)儀下計數(shù)。根據(jù)實測細胞濃度，用適量培養(yǎng)液加入培養(yǎng)瓶，配制成100 000個·mL-1的細胞懸液備用。取12孔細胞培養(yǎng)板，每孔加細胞懸浮液l mL，置37 ℃ ，5%CO2孵箱中培養(yǎng)24 h。

當細胞培養(yǎng)24 h后，棄去原培養(yǎng)液，分別加入用1640培養(yǎng)液配成的供試品液，每孔1 mL。原料陰性對照給予1640培養(yǎng)液(含10%小牛血清)990 μL，加DMSO 10 μL，其他陰性對照給予1640培養(yǎng)液(含10%小牛血清)1 mL。供試品溶液濃度，注射用粉針分別為：0.25，0.125，0.0625，0.031 25 mg·mL-1；注射液分別為：0.05，0.025，0.005，0.002 5 mg·mL-1；原料分別為：1，0.5，0.25，0.125，0.062 5 mg·mL-1；輔料根據(jù)其對應的原料濃度稀釋計算，注射液對應主藥活性藥用成分(active pharmaceutical ingredient,API)濃度為0.25，0.05，0.025，0.005，0.002 5 mg·mL-1，注射用粉劑對應主藥(API)濃度為0.5，0.25，0.125，0.062 5，0.031 25 mg·mL-1。

37 ℃、5%CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)72 h，光學倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長情況，棄去原培養(yǎng)液，加入0.25%胰酶消化液，消化數(shù)秒后棄去胰酶消化液，再加入細胞培養(yǎng)液1 mL，用吸管把細胞從瓶壁上吹打下來，混勻后在細胞計數(shù)儀下計數(shù)。

2 結果

2.1亮菌甲素注射劑細胞毒性測定及比較 將亮菌甲素原輔料及其注射劑相應每個濃度的細胞數(shù)轉換成細胞生長抑制率，用GraphPad Prism 5軟件計算出50%細胞生長抑制濃度(IC50)，結果見表2，3。

根據(jù)上述實驗結果將不同生產企業(yè)的注射用亮菌甲素及亮菌甲素注射液L929細胞IC50值進行比較，并按細胞毒性由小至大從左向右排列，結果見圖1。

2.2亮菌甲素原輔料細胞毒性測定及比較 將不同生產企業(yè)亮菌甲素原料、輔料及輔料總混液各濃度的細胞數(shù)轉換成細胞生長抑制率，用GraphPad Prism 5軟件計算IC50，結果見表4～6。

根據(jù)上述實驗結果將亮菌甲素注射劑各生產企業(yè)的原料及其制劑中的各輔料、輔料總混液按照其相應原料濃度計算的L929細胞IC50值進行比較，并按細胞毒性由小至大從左向右排列，結果見圖2。

3 討論

本實驗通過測定亮菌甲素原輔料及其注射劑對L929細胞染毒后的IC50值，比較不同劑型及不同原輔料間細胞毒性大小，由于亮菌甲素不易溶于水，因此用DMSO溶解后，用1640培養(yǎng)液(含10%小牛血清)稀釋后給藥，其中DMSO在細胞培養(yǎng)液中量不超過1%。同時，由于亮菌甲素原料及制劑均有一定顏色，噻唑藍(MTT)法測定結果存在一定干擾，故采用細胞計數(shù)法對活細胞數(shù)進行測定。與MTT法比較，雖然已采用細胞計數(shù)儀進行計數(shù)，減少人工計數(shù)存在的死活細胞辨認等主觀誤差，但仍然存在操作繁瑣、費時費力的局限性，但由于計數(shù)過程中可結合細胞形態(tài)進行觀察，綜合判斷，結果更為準確[9]。

比較各批次亮菌甲素注射劑IC50值可以發(fā)現(xiàn)，亮菌甲素注射液IC50值(0.005 83 ～0.010 25 mg·mL-1)均小于注射用亮菌甲素IC50值(0.060 49～0.175 3 mg·mL-1)，顯示注射液的L929細胞毒性明顯大于注射用粉針?？疾觳煌a企業(yè)原料的IC50值為0.078 02～0.134 mg·mL-1，與注射用粉針結果相似，故考慮注射液中由于輔料的影響導致細胞毒性增加。

表2 注射用亮菌甲素細胞毒性計數(shù)結果

表3 亮菌甲素注射液細胞毒性細胞計數(shù)結果

圖1 不同批號亮菌甲素注射液IC50值比較

Fig.1 Comparison of IC50value of armillarisin A injections among different batches

與原料及其他輔料相比，注射液中N，N-二甲基乙酰胺(API IC50為0.007 172 mg·mL-1)及丙二醇(API IC50為0.018 53 mg·mL-1)毒性較大，導致輔料總混液(API IC50為0.016 59 mg·mL-1)細胞毒性增加，從而增加注射液的細胞毒性。因此，有必要對亮菌甲素注射液處方和生產工藝進一步優(yōu)化，降低藥用輔料可能帶來的不良反應，從而保障人民群眾的用藥安全。

表4 亮菌甲素原料細胞毒性細胞計數(shù)結果

表5 亮菌甲素注射液輔料細胞毒性細胞計數(shù)結果

表6 注射用亮菌甲素輔料細胞毒性細胞計數(shù)結果

圖2 亮菌甲素原輔料IC50值比較

Fig.2 Comparison of IC50value of the raw material and the excipients of armillarisin A