一株水貂細小病毒分離與鑒定

盧軍霞 董炳梅

（1，河北石家莊工程職業(yè)學(xué)院 050000；2，山東綠都生物科技有限公司 256600）

水貂病毒性腸炎是由水貂細小病毒引起的一種以劇烈腹瀉為主要特征的急性、烈性、高度接觸性傳染病，是危害水貂養(yǎng)殖業(yè)的 3 大疫病之一[1,2]。本病多發(fā)生于 7～9 月份，傳染源多為患病/帶毒水貂，其傳播途徑主要為經(jīng)口與呼吸道傳播[3]?；疾□鯃鋈绮患皶r采取有效措施加以控制，該病常會引起地方性、周期性流行，且第二年仔貂斷乳前后有再次發(fā)生的可能。該病毒對外界環(huán)境具有較強的抵抗力，在污染的籠舍可存活5～10 個月[4]；冷凍狀態(tài)下，其毒力可維持一年不下降；56℃30min 可使該病毒滅活；但水貂細小病毒對福爾馬林與苛性鈉比較敏感，0.5%福爾馬林或2%苛性鈉溶液，室溫12h 可使該病毒失去活力，這也是該病難以根除的原因之一。近年來，隨著毛皮動物養(yǎng)殖規(guī)模與養(yǎng)殖密度的不斷擴大，因免疫程序不合理及飼養(yǎng)條件差等原因，該病在我國水貂養(yǎng)殖區(qū)仍時有發(fā)生[5]。

山東某水貂養(yǎng)殖場養(yǎng)水貂約2000 只，近期陸續(xù)出現(xiàn)體溫升高、厭食、嘔吐、腹瀉等癥狀，糞便呈淺黃色與煤焦油樣，且斷奶仔貂發(fā)病率高于成年水貂。該貂場發(fā)病率為52.3%，死亡率為65.8%。剖檢可見心外膜出血，胃黏膜有點狀出血，小腸腸壁變薄，腸黏膜出血，腸內(nèi)容物含有黏稠的纖維素性物質(zhì)多呈暗紅色，腸系膜淋巴結(jié)腫大充血。綜合以上癥狀及剖檢變化，結(jié)合該貂場免疫情況，初步判斷為水貂細小病毒感染。通過一系列的防控措施使該病得以有效控制，從而為本地區(qū)該類疾病的診療提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 細胞

貓腎傳代細胞系F81，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.1.2 鑒別用血清

1.1.3 試劑

DMEM 培養(yǎng)基購自 GIBCO 公司。PCR 10×buffer、Taq DNA聚合酶、dNTPs 購自寶生物 （大連） 生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 水貂腸炎病毒的分離

取山東省某水貂養(yǎng)殖場送檢的疑似水貂細小病毒感染的水貂糞便，加適量的生理鹽水，-20℃反復(fù)凍融 3 次，10000r 離心 20min，取上清液，經(jīng) 0.22μm 微孔的濾膜過濾，加入青、鏈霉素至100U/ml，置于-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR 檢測

取處理好的病料，應(yīng)用酚氯仿抽提法提取總DNA 作為模板，應(yīng)用 PCR 方法進行擴增。PCR 反應(yīng)體系為 25μl，其中含有 10×buffer 2.5μl，dNTP 2μl，MgCl2 2.5μl，Taq 酶 1μl，引物1 和 2 各 1μl，DNA 模板 0.5μl，去離子水 16.5μl。PCR 反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性 5min；95℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 2min，30個循環(huán)；72℃延伸10min，冷至4℃保存。經(jīng)瓊脂糖電泳檢測，所擴增目的片段為600bp。上、下游引物分別為：

MEV-1：5’ -GTAAGCTTCCAGGAGACTTT-3’

MEV-2：5’ -GTAAGCTTCGTCGTGTTCTT-3’

1.2.3 病毒分離

將F81 細胞按常規(guī)方法進行傳代培養(yǎng)，將上述處理的濾液，同步接種于F81 細胞中[6]，接毒量為細胞培養(yǎng)液的1/10，置于37℃培養(yǎng)箱中，觀察5～7d，并盲傳三代，同時設(shè)1 瓶正常細胞對照。

1.2.4 水貂腸炎病毒的鑒定及生物學(xué)特性的測定

1.2.4.1 PCR 鑒定

將細胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融3 次后，10000r 離心20min，取上清，按照1.2.2 的方法進行PCR 鑒定。

1.2.4.2 紅細胞凝集譜的測定

應(yīng)用微量凝集試驗，將雞、豬、綿羊、豚鼠、小白鼠、兔子與人O 型紅細胞0.015 M pH6.5 的PBS 緩沖液稀釋成1%的紅細胞懸液，按常規(guī)方法測定細胞培養(yǎng)物的血凝特性，以50%以上紅細胞凝集判定為紅細胞凝集陽性。

1.2.4.3 對流免疫電泳試驗

將細胞培養(yǎng)物與水貂細小病毒陽性對照病毒加入氯仿抽提10min，3000r 離心 10min，取上清液備用。用 pH8.6 0.025mol/L的巴比妥緩沖液配制1%的瓊脂凝膠，冷凝后打孔，在相對的2孔內(nèi)分別加入抗原與血清。加樣后，置于電泳槽內(nèi)進行電泳。在抗原孔和血清孔之間出現(xiàn)白色沉淀線判為陽性，不產(chǎn)生沉淀線者判為陰性。

1.2.4.4 細胞培養(yǎng)物毒力的測定

（1） HA 效價的測定

將細胞培養(yǎng)物用0.015M pH6.5 的 PBS 緩沖液進行2x 倍比稀釋后，加入1%豬紅細胞，4℃作用 60min，觀察紅細胞凝集情況，計算HA 效價。

（2） TCID50 的測定

將F81 細胞進行常規(guī)傳代，加入96 孔細胞培養(yǎng)板中。隨后應(yīng)用細胞培養(yǎng)液將細胞培養(yǎng)物進行10x 倍比稀釋，采用同步接毒法，加入含有 F81 細胞的 96 孔板中，100μl/孔，置于 37℃5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d，觀察并記錄細胞病變情況，應(yīng)用Reed-Muench 法計算分離病毒的TCID50。

1.2.5 動物感染試驗

選取血清 HA 效價≤1：4 的健康易感水貂 6 只，其中 4 只灌服 15ml 細胞培養(yǎng)物，另 2 只作為對照，灌服 15ml 正常 F81 細胞培養(yǎng)液，隔離觀察，并于每天觀察記錄臨床癥狀、收集糞便，10d 后對所有水貂進行剖殺，觀察腸道等臟器的病理變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR 檢測結(jié)果

將處理好的病料提取基因組作為模板，進行PCR 擴增。結(jié)果顯示，擴增出一條600bp 左右的片段，初步判定該場水貂攜帶有水貂細小病毒 （圖1）。

2.2 病毒的分離與鑒定

2.2.1 疑似水貂細小病毒的分離

將處理好的病料按同步接毒的方法接種F81 細胞后，觀察5～7d，并盲傳 3 代。傳代至 F3代，可見明顯的細胞病變，局部細胞圓縮、拉網(wǎng)，隨后逐漸擴展，直至細胞溶解脫落 （圖2）。

2.2.2 水貂細小病毒的鑒定

取疑似水貂細小病毒感染病料的細胞培養(yǎng)物F3 代，常規(guī)方法提取模板DNA，經(jīng)PCR 檢測，證明該細胞培養(yǎng)物為水貂細小病毒陽性。紅細胞凝集譜測定結(jié)果顯示，該細胞毒只可凝集豬紅細胞，其余紅細胞均不發(fā)生凝集反應(yīng)。應(yīng)用對流免疫電泳測定結(jié)果顯示，細胞培養(yǎng)物、水貂細小病毒陽性對照與水貂細小病毒陽性血清均出現(xiàn)沉淀線，進一步證明細胞培養(yǎng)物為水貂細小病毒。

2.3 分離病毒毒力的測定

盲傳三代后，TCID50檢測結(jié)果顯示，該細胞毒TCID50為10-5.68/0.1ml；HA 效價測定結(jié)果顯示，該分離病毒的血凝價為 1：256。

2.4 水貂感染性試驗

將細胞培養(yǎng)物接種健康易感水貂4 只，隔離觀察，接種后4d，水貂出現(xiàn)減食、排稀便現(xiàn)象；接種后 5～7d，4 只水貂均出現(xiàn)厭食甚至廢食、體溫升高、脫水、套管樣糞便與血便；對照組正常，無任何不良癥狀。將4 只發(fā)病水貂進行剖檢，可見尸體消瘦、腸道黏膜變薄、充血、出血，腸道內(nèi)混有紅色血狀物。

3 討論

水貂細小病毒屬于細小病毒科，細小病毒屬。其中肉食獸細小病毒主要包括貂細小病毒、犬細小病毒、貉細小病毒和藍狐細小病毒等[7,8]。細小病毒在自然界分布極為廣泛，且對外界因素具有強大的抵抗力[9]。水貂細小病毒在加拿大安大略省威廉堡地區(qū)1947 年首次發(fā)生，而該病在我國于1974 年才首次報道，此后逐漸蔓延至全國，給水貂養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[10]。目前，在我國水貂細小病毒的預(yù)防主要是免疫接種，但近年來疫苗免疫失敗的現(xiàn)象屢有發(fā)生。在本研究中，由于該養(yǎng)殖場一段時間內(nèi)應(yīng)用毛蛋等不良飼料原料，導(dǎo)致水貂抵抗力降低，且輕度腹瀉，也因此錯過了水貂細小病毒的最佳免疫時間，最終導(dǎo)致該病的發(fā)生。

水貂細小病毒病的特點為病程短、病情極易惡化。目前，水貂細小病毒尚無有效的藥物與治療方法，其治療原則主要是切斷傳播途徑，中和病毒，對癥治療，防止繼發(fā)感染[11]。在該養(yǎng)殖場，首先停用不良飼料原料，并對籠舍、場地等進行嚴格的消毒工作，對死亡的水貂采取無害化處理；其次隔離病貂，并肌肉注射高免血清與抗生素，同時全場應(yīng)用葡萄糖及多種維生素飲水；最后應(yīng)用水貂腸炎滅活疫苗進行緊急接種，小于3月齡的仔貂 3 頭份/只，3 月齡以上的貂 5 頭份/只。經(jīng)過一段時間的處理，該病得到良好的控制。