一例仔豬藍(lán)耳病檢測報(bào)告

莫云鋒 李劍靜 林德強(qiáng)

（1，廣西岑溪市馬路鎮(zhèn)水產(chǎn)畜牧獸醫(yī)站 543202；2，廣西岑溪市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 543200）

豬藍(lán)耳病又稱豬繁殖與呼吸綜合癥 （PRRS），是有豬繁殖與呼吸綜合癥病毒 （PRRSV） 引起的一種高度接觸性傳染性疾病[1]。PRRSV 屬于套式病毒目、動(dòng)脈病毒科、動(dòng)脈病毒屬的成員，其基因組全長為15kb 的單股正鏈RNA 病毒[2]。感染該病的妊娠母豬主要表現(xiàn)為早產(chǎn)、流產(chǎn)、死胎等癥狀，公豬表現(xiàn)為咳嗽、精神沉郁、食欲不振、呼吸急促和運(yùn)動(dòng)障礙等癥狀；肥育豬和斷奶仔豬主要表現(xiàn)為咳嗽、厭食、呼吸困難等，哺乳期仔豬表現(xiàn)為精神不振、呼吸困難、氣喘、耳朵發(fā)紺等癥狀，該病的死亡率較高。本病僅根據(jù)臨床癥狀常不能確診，由于PRRS 會(huì)與其他疾病 （如偽狂犬病等） 存在類似的臨床癥狀，因此，確診該病需要借助實(shí)驗(yàn)室技術(shù)。

2019 年2 月，廣西某養(yǎng)殖戶送檢一份豬病料。本實(shí)驗(yàn)室通過對該病料進(jìn)行剖檢和實(shí)驗(yàn)室診斷，最終確定該病例是由PRRSV 引起的，具體的診斷方法和報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器和試劑

PCR 儀、凝膠成像系統(tǒng)，購自 Bio-rad 公司；血平板，購自北京路橋技術(shù)有限責(zé)任公司；病毒DNA/RNA 提取試劑盒、2×Taq MasterMix、DM2000、HiFi-Script cDNA 第一鏈合成試劑盒等，均購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.1.2 病料來源

2019 年2 月20 日，根據(jù)養(yǎng)殖戶介紹，該養(yǎng)殖場工飼養(yǎng)90頭仔豬，飼養(yǎng)過程已免疫豬繁殖與呼吸綜合癥、豬瘟等疫苗。剛發(fā)現(xiàn)時(shí)部分病豬表現(xiàn)為不好動(dòng)、被毛沒有光澤。經(jīng)過5d 的治療沒見起效，且發(fā)病仔豬和死亡數(shù)量增多，表現(xiàn)為精神沉郁、呼吸困難、體溫高達(dá)42℃，病豬眼結(jié)膜發(fā)紅、部分耳尖成藍(lán)色。該養(yǎng)殖戶立即拿病料送我單位進(jìn)行確診。

剖檢發(fā)現(xiàn)，肺臟有出血點(diǎn)、水腫；腸系膜淋巴結(jié)腫大；脾臟腫大、質(zhì)地較脆。采集其肺臟、淋巴結(jié)和脾臟組織-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 引物設(shè)計(jì)

參考文獻(xiàn)[3,4]，將豬繁殖與呼吸綜合癥病毒 （PPRSV）、偽狂犬病毒 （PRV） 的引物序列由蘇州金唯智生物科技有限公司合成，引物序列信息如附表。

1.2 診斷方法

1.2.1 細(xì)菌分離和鑒定

用接種環(huán)取淋巴結(jié)、脾臟和肺臟樣品，采用平板劃線法，接種在血瓊脂培養(yǎng)基平板上，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)18～24h 后觀察，并進(jìn)行細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察及鑒定。

1.2.2 病原檢測

1.2.2.1 病料RNA/DNA 的提取

將病死豬脾臟、肺臟、淋巴結(jié)等病料樣品放入研磨器中混合研磨，加入適量的滅菌生理鹽水，反復(fù)凍融 3 次，取上清液，按病毒DNA/RNA 提取試劑盒說明進(jìn)行組織樣品RNA/DNA提取。提取的病毒核酸-80℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2 RT-PCR/PCR

按照HiFi-Script cDNA 第一鏈合成試劑盒說明書將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。分別以cDNA 和DNA 為模板進(jìn)行PCR。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離結(jié)果

血平板上未見有細(xì)菌生長。

2.2 PCR 結(jié)果

采用針對 PRRSV ORF5-F/ORF5-R 引物和 PRV N1/N2 引物對送檢的病料樣品進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果PRRSV 擴(kuò)增出與目的片段相符合的條帶，而PRV 未擴(kuò)增出目的條帶，結(jié)果見附圖。

3 討論

本次所檢測的病例經(jīng)細(xì)菌分離和PCR 鑒定，最終確定該病例是由PRRSV 引起仔豬發(fā)病和死亡的。

20 世紀(jì)80 年代，美國首先報(bào)道了一種在豬群中發(fā)生的新災(zāi)難性疾病，主要表現(xiàn)為母豬嚴(yán)重的繁殖障礙，斷奶豬普遍發(fā)生肺炎、生長遲緩和死亡率增加的癥狀，當(dāng)時(shí)將該病稱為" 神秘病"[4]。后來該病傳到歐洲，因患病豬表現(xiàn)為耳朵青紫或藍(lán)紅色而稱之為 “藍(lán)耳病”，并被命名為豬繁殖呼吸綜合癥，該名稱已沿用至今。我國PRRSV 的首次分離是由郭寶清等在20世紀(jì)90 年代末從PRRS 血清抗體陽性的豬群中分離到的，從而證實(shí)我國也有此病。我國將該病列為二類傳染病?，F(xiàn)藍(lán)耳病已遍布全球，該病的流行給養(yǎng)豬行業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失，已成為嚴(yán)重威脅養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的重要傳染病之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，由PRRSV導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失，育種豬約為6675 萬美元，成長豬約為4.36億美元。該病得以流行主要是與其傳播特點(diǎn)有關(guān)。其主要感染途徑為呼吸道，主要傳播方式為空氣傳播、接觸傳播、精液傳播和垂直傳播等，傳染源為病豬、帶毒豬和患病母豬所產(chǎn)的仔豬以及被污染的環(huán)境、用具等。因此，當(dāng)健康豬與病豬接觸、豬場衛(wèi)生條件差、氣候惡劣、飼養(yǎng)密度大等均可促進(jìn)豬繁殖與呼吸綜合癥的流行。

附表

該養(yǎng)殖場得以發(fā)生PRRS，有以下幾點(diǎn)因素。第一，該豬場車輛和裝車人員消毒不嚴(yán)格，引起豬發(fā)病。第二，廣西連續(xù)處在陰雨天多天，致使豬舍潮濕，極易引發(fā)疾病。第三，該豬場飼養(yǎng)密度較大，且環(huán)境衛(wèi)生條件差。因此，這個(gè)時(shí)候PRRSV極易有機(jī)會(huì)感染健康仔豬，對仔豬的健康產(chǎn)生嚴(yán)重影響。

因此，要預(yù)防該病的發(fā)生，需采取以下措施。第一，發(fā)生該病時(shí)要及時(shí)隔離和淘汰病死豬，防止各種病毒和細(xì)菌大量繁殖而引起的繼發(fā)感染。第二，養(yǎng)豬場應(yīng)采取自繁自養(yǎng)的模式，確實(shí)需要引種的應(yīng)嚴(yán)格把關(guān)，引種前了解該引種地的豬病流行情況，必須對要引進(jìn)的豬進(jìn)行檢測；引種后進(jìn)行隔離飼養(yǎng)，病原和抗體檢測為陰性后方可混群飼養(yǎng)。第三，制定科學(xué)的免疫程序并嚴(yán)格實(shí)行。目前，養(yǎng)豬場一般使用豬繁殖與呼吸綜合癥弱毒苗和面活疫苗來預(yù)防該病。為確保疫苗免疫效果，豬場應(yīng)及時(shí)檢測豬群的PRRSV 抗體水平，以便了解豬群保護(hù)情況。第四，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理。豬舍環(huán)境衛(wèi)生應(yīng)保持清潔、飼養(yǎng)密度不宜過大，豬飼料應(yīng)添加營養(yǎng)物質(zhì)以提高豬群抵抗力。第五，對疫情處理要及時(shí)。若豬場出現(xiàn)疫情要立即隔離病豬，并上報(bào)有關(guān)部門，根據(jù)相關(guān)工作人員的指導(dǎo)正確處理病死豬。