毒蕈堿型乙酰膽堿受體M3對(duì)膽管癌神經(jīng)浸潤(rùn)的影響

張宏偉，王彩茹，繆國(guó)東，張化玉，高福洋，劉海英

（承德市中心醫(yī)院，河北 承德 067000）

膽管癌是一類(lèi)侵襲性腫瘤，惡性程度較高，病情具有隱匿性特征，該病診斷率低、病死率高。治療最有效的方法是手術(shù)切除，術(shù)后復(fù)發(fā)率較低，對(duì)放療與化療不敏感，預(yù)后情況較差。有醫(yī)學(xué)研究表示：膽管系統(tǒng)中的自主神經(jīng)較為活躍，腹腔神經(jīng)叢距離膽管惡性腫瘤較近，周?chē)窠?jīng)叢容易受到腫瘤的侵襲，導(dǎo)致神經(jīng)浸潤(rùn)[1]。多次實(shí)踐研究得出：膽管癌經(jīng)由膽管癌周?chē)窠?jīng)遞質(zhì)分泌誘發(fā)膽管癌神經(jīng)浸潤(rùn)所導(dǎo)致。周?chē)窠?jīng)遞質(zhì)主要依靠激活毒蕈堿型乙酰膽堿受體M3（ChRM3）而發(fā)揮的作用，會(huì)對(duì)膽管癌神經(jīng)浸潤(rùn)產(chǎn)生較強(qiáng)的抑制。本研究主要針對(duì)激動(dòng)劑匹羅卡品、抗結(jié)劑阿托品對(duì)ChRM3的作用，研究膽管癌神經(jīng)浸潤(rùn)能力所受的影響，下面是研究報(bào)道。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 篩選經(jīng)外科手術(shù)切除的膽管病理組織標(biāo)本90例展開(kāi)研究，標(biāo)本均用石蠟包埋，重新篩選腺癌組織標(biāo)本60例，正產(chǎn)膽管組織標(biāo)本30例。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞系與所選試劑 膽管癌（RBE細(xì)胞系）從上海細(xì)胞庫(kù)購(gòu)買(mǎi)，美國(guó)提供胎牛血清（FBS）、培養(yǎng)基RPIM1640、匹羅卡品，武漢昌恒生物醫(yī)藥制品研究所提供硫酸阿托品，青島市藥檢所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供昆明種純系胚胎小鼠。

1.2.2 培養(yǎng)細(xì)胞 膽管癌細(xì)胞（RBE）系運(yùn)用的培養(yǎng)液：胎牛血清RPMI1640（體積分?jǐn)?shù)0.10），溫度處于37oC，運(yùn)用CO2恒溫養(yǎng)箱體積分?jǐn)?shù)0.05進(jìn)行培養(yǎng)，定期更換培養(yǎng)液，等細(xì)胞融合80%-90%后，使用于含有2.5 g/L EDTA的胰酶消化，配置為細(xì)胞懸液，于培養(yǎng)瓶上接種，取出對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞使用胰酶2.5 g/L EDTA消化待用，每天采用顯微倒置觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，在規(guī)定時(shí)間內(nèi)將其拍照記錄。

1.2.3 構(gòu)建體外膽管癌神經(jīng)浸潤(rùn)模型 將本研究小鼠 DRGRBE 細(xì)胞共培養(yǎng)模型培養(yǎng)液分為4組，甲組（僅加含血清培養(yǎng)基RPMI1640）、乙組（含有血清培養(yǎng)基RPMI1640＋匹羅卡品1 mmol/L）、丙組（含血清培養(yǎng)基RPMI1640＋阿托品0.1 mmol/L＋匹羅卡品1 mmol/L）、丁組（含有血清培養(yǎng)基RPMI1640＋阿托品0.1 mmol/L）。取出RBE膽管癌細(xì)胞（對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)）候用，消化以2.5 g/L胰酶進(jìn)行，離心后運(yùn)用胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液處理RBE膽管癌細(xì)胞并計(jì)數(shù)，細(xì)胞密度調(diào)整在1.0×108個(gè)L待用。操作期間應(yīng)選取整潔干凈的工作平臺(tái)，脫頸將小鼠處死，于顯微鏡下對(duì)小鼠的背根神經(jīng)節(jié)進(jìn)行修剪，然后將其放在生理鹽水中清洗。于孔板上各小孔放上1 cm×1 cm消毒蓋玻片預(yù)冷，于蓋玻片中央放置DRG，覆蓋50 μL Matrigel，在培養(yǎng)箱中放置6孔板，溫度保持在37oC，固化時(shí)間達(dá)30 min，將準(zhǔn)備好的細(xì)胞懸液分別加入其中，覆蓋Matrigel和DRG ，選取培養(yǎng)箱（體積分?jǐn)?shù)0.05）CO2培養(yǎng)，每隔4 h在顯微鏡下觀察神經(jīng)纖維黏附狀況、RBE細(xì)胞，詳細(xì)記錄細(xì)胞變化。36 h后選取中性甲醛溶液（40 g/L）將其固定，利用Nissl染色后運(yùn)用顯微鏡觀察，計(jì)數(shù)采用高倍鏡，將高倍鏡調(diào)節(jié)為5進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算平均數(shù)值。

1.3 觀察指標(biāo) 觀察DRG-RBE細(xì)胞共培養(yǎng)模型培養(yǎng)36 h后添加不同試劑的浸潤(rùn)細(xì)胞數(shù)目。

2 結(jié)果

在DRG-RBE細(xì)胞共培養(yǎng)模型培養(yǎng)36 h后，浸潤(rùn)細(xì)胞數(shù)目為18.0±0.71；添加匹羅卡品后，浸潤(rùn)細(xì)胞數(shù)目31.60±0.93，差異顯著（P＜0.05）；添加匹羅卡品拮抗劑阿托品后，浸潤(rùn)細(xì)胞數(shù)目為20.0±0.71，單獨(dú)添加阿托品后，浸潤(rùn)細(xì)胞數(shù)目為20.20±0.86，差異顯著（P＜0.05）。

3 討論

本研究加入匹羅卡品、阿托品后，ChRM3激動(dòng)劑匹羅卡品能夠明顯增強(qiáng)RBE細(xì)胞浸潤(rùn)能力，阿托品可以削弱匹羅卡品產(chǎn)生的促浸潤(rùn)作用[2]。阿托可結(jié)合匹羅卡品ChRM3，實(shí)現(xiàn)對(duì)匹羅卡品的抗擊，阿托品從原則上來(lái)說(shuō)無(wú)法與ChRM3結(jié)合，效果的發(fā)揮存在難度，若單獨(dú)應(yīng)用阿托品，難以制約RBE細(xì)胞的神經(jīng)浸潤(rùn)。

總體來(lái)說(shuō)，匹羅卡品能夠增強(qiáng)膽管癌細(xì)胞的神經(jīng)浸潤(rùn)功能，阿托品會(huì)削弱匹羅卡品浸潤(rùn)能力，可改善ChRM3的活性，可以為抑制膽管癌的神經(jīng)浸潤(rùn)提供新的治療靶點(diǎn)。