篩查RET融合基因在鼻咽癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)情況

趙東，何磊，張麗平，何靜波

（1.包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 包頭 014000；2.包頭醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014000）

研究發(fā)現(xiàn)，RET基因移位的細(xì)胞系對RET抑制劑敏感，其可能為治療RET活化腫瘤提供新的選擇。本次研究主要探討RET融合基因在鼻咽癌組織、細(xì)胞系中的表達(dá)情況，從而為發(fā)現(xiàn)新的治療方式與靶點(diǎn)提供參考，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 對2016年6月-2019年6月期間收治鼻咽癌患者60例進(jìn)行研究，其中包括男性54例、女性6例，年齡為20-74歲、中位年齡46.5歲，組織病理分期為II型11例、III型54例，其中不包括遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本處理 標(biāo)本為經(jīng)過福爾馬林固定的石蠟標(biāo)本，經(jīng)病理專家重新確認(rèn)。組織芯片儀進(jìn)行組織芯片的構(gòu)建，供體石蠟標(biāo)本進(jìn)行切薄片，HE染色，選取供體蠟塊標(biāo)本典型腫瘤區(qū)域穿孔2個(gè)，進(jìn)行芯片構(gòu)建。芯片上的標(biāo)本參數(shù)為：直徑1 mm，間距0.1 mm。于3塊組織芯片上構(gòu)建所有標(biāo)本，每個(gè)腫瘤均有對應(yīng)位點(diǎn)共2個(gè)。構(gòu)建完畢受體石蠟塊后，4

μm連續(xù)切片并放在載玻片上。鼻咽癌細(xì)胞系為S26、S18、

HONE-1、CNE-1、CNE-2以及SUNE-1，均保存于重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，細(xì)胞系鋪板，秋水仙堿（0.05 g/mL）作用4 h以阻滯細(xì)胞周期，多聚甲醛（10%）固定，梯度乙醇脫水。陽性對照物為有KIF5B/RET融合基因的肺癌組織。

1.2.2 FISH檢測 56oC烤片上處理石蠟切片，過夜。脫蠟處理后，二甲苯中處理玻片3次，10 min/次，之后將玻片放置于乙醇（100%）中3次，10 min/次。80oC條件下，玻片在預(yù)處理溶液中處理10 min，蛋白酶溶液消化15 min后梯度乙醇脫水并自然干燥。2×SSC緩沖液對細(xì)胞滴片進(jìn)行沖洗，持續(xù)30 min，乙酸（70%）預(yù)處理10 s后，胃蛋白酶（0.008%）消化30 min，甲醛（1%）固定60 s。經(jīng)處理后的組織標(biāo)本、細(xì)胞系上滴加10 μL探針混合液并將蓋玻片蓋上，香蕉水泥封片。雜交儀中79oC下變性6 min，37oC條件下雜交過夜。翌日將標(biāo)本取出，75.5oC條件下，洗脫液快速洗滌2 min，室溫下洗滌2次，二脒基苯基吲哚對比染色，熒光顯微鏡下4oC避光，30 min內(nèi)評分。HE染色切片上尋找癌細(xì)胞區(qū)域，物鏡下觀察FISH標(biāo)本，尋找HE染色切片同一視野，對信號仔細(xì)觀察。綠色熒光標(biāo)記RET基因3’端，紅色熒光標(biāo)記5’端，RET基因融合時(shí)，二者重疊，此時(shí)染色信號疊加，或表現(xiàn)為黃色，10%以上腫瘤細(xì)胞的紅綠探針分離則提示RET基因斷裂，對每例標(biāo)本均計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞。

1.5 RT-PCR 試劑盒提取細(xì)胞系總RNA，DNA酶將殘留DNA去除，對完成的cDNA轉(zhuǎn)錄10 ng，進(jìn)行PCR反應(yīng)，總反應(yīng)體系25 μL，其中包括相應(yīng)緩沖液、1.5 μL dNTP、0.05 mL DNA聚合酶以及上下游引物分別1 μl。95oC下反應(yīng)1.5 min，94oC下反應(yīng)30 s，64oC下反應(yīng)30 s，72oC下反應(yīng)40 s，共30個(gè)循環(huán)，72oC下10 min延申。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂凝膠電泳，掃描電泳條帶的密度。

2 結(jié)果

60例組織標(biāo)本、6株細(xì)胞系中未見探針分離現(xiàn)象。6個(gè)鼻咽癌細(xì)胞系中，PCR產(chǎn)物核酸電泳見溴化銀顯色，未見擴(kuò)增條帶。

3 討論

當(dāng)前對RET基因進(jìn)行檢測時(shí)，免疫組化、FISH、PTPCR都是比較常用的方法[1-3]。FISH檢測時(shí)，僅需要石蠟切片即可進(jìn)行檢測，其具有簡單、快捷的優(yōu)勢，結(jié)果明確、直觀，比較適合于不容易獲得新鮮標(biāo)本的病例；PT-PCR的優(yōu)勢在于可靠、敏感，其能夠獲知基因融合類型，但是其對標(biāo)本要求比較高，要求為新鮮組織，過程比較繁瑣。進(jìn)行RET基因狀態(tài)檢測時(shí)，應(yīng)結(jié)合病情需要來制定決策。

鼻咽癌患者無論是復(fù)發(fā)還是初診都常見表皮生長因子受體（EGFR）過度表達(dá)，EGFR過度激活造成下游信號被激活，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖；EB病毒的感染使得EGFR核內(nèi)轉(zhuǎn)移以及內(nèi)化，這說明EGFR在鼻咽癌的發(fā)生與發(fā)展過程中的作用。但是對EGFR信號通路進(jìn)行抑制，并未對鼻咽癌細(xì)胞的增殖造成影響，這說明可能還有其他信號通路參與了病理生理過程。血管生長因子、缺氧相關(guān)蛋白碳酸酐酶-9以及缺氧誘導(dǎo)因子1也都在鼻咽癌組織中高表達(dá)，其都提示著預(yù)后不良。但是當(dāng)前仍然缺乏鼻咽癌轉(zhuǎn)移、進(jìn)展、復(fù)發(fā)的分子機(jī)制。從本次研究的結(jié)果上看來，RET基因斷裂融合現(xiàn)象并未見于鼻咽癌組織、細(xì)胞系中，這說明鼻咽癌發(fā)生RET基因融合的可能性較低。

綜上所述，鼻咽癌的發(fā)生與發(fā)展過程中，RET基因并未參與其中。