魚(yú)類(lèi)水霉病病原菌LY04對(duì)環(huán)境及營(yíng)養(yǎng)的適應(yīng)性

段魏魏 申慧 魏冬梅

摘要：以標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 26116為對(duì)照組，采用單因素試驗(yàn)方法分別探討菌株LY04對(duì)溫度、pH值、鹽度的環(huán)境適應(yīng)性以及對(duì)碳源、氮源的營(yíng)養(yǎng)適應(yīng)性。結(jié)果顯示，菌株LY04與對(duì)照株在10～30 ℃的溫度范圍、5～9的pH值范圍內(nèi)均可生長(zhǎng)，但二者在相同環(huán)境條件下生長(zhǎng)速率差異顯著，LY04較對(duì)照株對(duì)溫度、pH值的適應(yīng)性差，鹽度適應(yīng)性?xún)?yōu)于對(duì)照株;二株菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)的要求差異顯著，在相同營(yíng)養(yǎng)條件下，LY04菌株生長(zhǎng)速率顯著快于對(duì)照株，試驗(yàn)株對(duì)寡營(yíng)養(yǎng)適應(yīng)性?xún)?yōu)于對(duì)照株;NH+4-N在質(zhì)量濃度0.1%～0.3%范圍內(nèi)對(duì)二株菌生長(zhǎng)均有促進(jìn)作用，NO3-N對(duì)菌株LY04的生長(zhǎng)有抑制作用，在0.1%質(zhì)量濃度下可以促進(jìn)對(duì)照株的生長(zhǎng)，其余濃度也表現(xiàn)出明顯的抑制作用。綜上，菌株LY04具有很好的環(huán)境適應(yīng)性和營(yíng)養(yǎng)適應(yīng)性，這些適應(yīng)性都與新疆獨(dú)特的水域環(huán)境相適應(yīng)。

關(guān)鍵詞：水霉;病原菌;環(huán)境;營(yíng)養(yǎng);適應(yīng)性

中圖分類(lèi)號(hào)： S941.43+1 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2020）03-0190-04

水霉病是各種水產(chǎn)養(yǎng)殖中廣泛存在的一種寄生性疾病，是防治難度最大的魚(yú)類(lèi)病害之一，每年給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。由于其特效防治藥物孔雀石綠的禁用，其危害更加普遍和嚴(yán)重[3-4]。目前，硫酸銅、臭氧、福爾馬林、重氫硫酸鹽等各種化學(xué)試劑及各種中草藥、微生物抗菌劑廣泛用于水霉病防治，但大多只起到預(yù)防作用[5-11]。在尋找水霉病防治的有效途徑時(shí)，了解其病原是必須的。研究認(rèn)為，水霉病的病原常見(jiàn)的有水霉、綿霉和腐霉[12-13]，具有多樣性，對(duì)寄主無(wú)嚴(yán)格選擇性。

國(guó)內(nèi)外大量學(xué)者對(duì)水霉病病原菌生理特性的研究表明，其環(huán)境適應(yīng)范圍廣，5～32 ℃溫度范圍[14-16]、4～11的pH值范圍[17-18]、3.5%以?xún)?nèi)的氯化鈉[14，19-21]含量條件下均可生長(zhǎng)。新疆獨(dú)特的氣候特點(diǎn)使魚(yú)類(lèi)在歷經(jīng)嚴(yán)冬后的初春易患水霉病，魚(yú)類(lèi)水霉病的病情較我國(guó)其他地區(qū)更為嚴(yán)峻，而目前未見(jiàn)相關(guān)研究見(jiàn)諸于眾。本研究對(duì)新疆五家渠地區(qū)水霉病病原菌的環(huán)境適應(yīng)性進(jìn)行探討，以期為了解病原進(jìn)而找到合適的防治水霉病藥物提供數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種 菌種：LY04，從五家渠患水霉病鰱魚(yú)肌肉及體表分離獲得，根據(jù)形態(tài)學(xué)及生理學(xué)特征鑒定為水霉目、水霉科、水霉屬[22];標(biāo)準(zhǔn)菌株，多子水霉（saprolegnia fex）ATCC 26116，購(gòu)自美國(guó)典型微生物菌種保藏中心（ATCC）。

1.1.2 培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（pH值 7.0），用于水霉的培養(yǎng)及環(huán)境適應(yīng)性試驗(yàn);沙堡氏瓊脂培養(yǎng)基（葡萄糖40 g，蛋白胨10 g，瓊脂15 g，純凈水1 000 mL，pH值5.6±0.2），用于營(yíng)養(yǎng)適應(yīng)性試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 環(huán)境適應(yīng)性試驗(yàn)方法

1.2.1.1 溫度對(duì)水霉菌生長(zhǎng)的影響 用微生物平板打孔器在培養(yǎng)有水霉菌的PDA培養(yǎng)基上，輕輕打取長(zhǎng)勢(shì)較旺的水霉菌菌落后重新接種在新的PDA培養(yǎng)基中央。然后分別置于10、15、20、25、30 ℃下恒溫培養(yǎng)72 h，用十字交叉法測(cè)量菌落直徑（mm），計(jì)算生長(zhǎng)率（%）。每組重復(fù)3次，用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.1.2 pH值對(duì)水霉菌生長(zhǎng)的影響 配制PDA培養(yǎng)基，常規(guī)滅菌后，用3 mol/L HCl和3 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值分別為5、6、7、8、9。采用微生物平板打孔器在培養(yǎng)有水霉菌的PDA培養(yǎng)基上，輕輕打取長(zhǎng)勢(shì)較旺的水霉菌菌落后重新接種在滅過(guò)菌的不同pH值的PDA培養(yǎng)基中央。然后置于25 ℃下恒溫培養(yǎng)72 h。用十字交叉法測(cè)量菌落直徑（mm），計(jì)算生長(zhǎng)率（%）。每組重復(fù)3次。用GraphPad Prism軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.1.3 鹽度對(duì)水霉菌生長(zhǎng)的影響 用微生物平板打孔器在培養(yǎng)有水霉菌PDA培養(yǎng)基上，輕輕打取長(zhǎng)勢(shì)較旺的水霉菌菌落后，分別接種于含NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的PDA平板中央，然后置于25 ℃恒溫培養(yǎng)48 h后，用十字交叉法測(cè)量菌落直徑（mm），計(jì)算生長(zhǎng)率（%）。每組重復(fù)三次，用GraphPad Prism軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.2 營(yíng)養(yǎng)條件適應(yīng)性試驗(yàn)方法

1.2.2.1 葡萄糖對(duì)水霉菌株生長(zhǎng)的影響 采用滅過(guò)菌的微生物平板打孔器在培養(yǎng)有水霉菌的PDA培養(yǎng)基上，輕輕打取長(zhǎng)勢(shì)較旺較一致的水霉菌菌落后，接種在葡萄糖質(zhì)量濃度為0.0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的沙堡氏瓊脂培養(yǎng)基（去掉了葡萄糖組分）中央。然后置于25 ℃溫度條件下恒溫培養(yǎng)，分別觀察24、48、72 h的生長(zhǎng)情況并用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，每組3個(gè)平行。

1.2.2.2 蛋白胨對(duì)水霉菌株生長(zhǎng)的影響 采用滅過(guò)菌的微生物平板打孔器在培養(yǎng)有水霉菌的PDA培養(yǎng)基上，輕輕打取長(zhǎng)勢(shì)較旺較一致的水霉菌菌落后，接種在蛋白胨質(zhì)量濃度為0.0%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%的沙堡氏瓊脂培養(yǎng)基（去掉了蛋白胨組分）中央。然后置于25 ℃下恒溫培養(yǎng)，分別觀察24、48、72 h的生長(zhǎng)情況并用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，每組3個(gè)平行。

1.2.2.3 硫酸銨對(duì)水霉菌株生長(zhǎng)的影響 采用滅過(guò)菌的微生物平板打孔器在培養(yǎng)有水霉菌的PDA培養(yǎng)基上，輕輕打取長(zhǎng)勢(shì)較旺較一致的水霉菌菌落后，接種在含硫酸銨質(zhì)量濃度為0.0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的沙堡氏瓊脂培養(yǎng)基中央，后置于25 ℃下恒溫培養(yǎng)，分別觀察24、48、72 h的生長(zhǎng)情況并用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，每組3個(gè)平行。

1.2.2.4 硝酸鉀對(duì)水霉菌株生長(zhǎng)的影響 采用滅過(guò)菌的微生物平板打孔器在培養(yǎng)有水霉菌的PDA培養(yǎng)基上，輕輕打取長(zhǎng)勢(shì)較旺較一致的水霉菌菌落后，接種在含硝酸鉀質(zhì)量濃度為0.0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的沙堡氏瓊脂培養(yǎng)基中央。然后置于25 ℃下恒溫培養(yǎng)，分別觀察24、48、72 h的生長(zhǎng)情況并用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，每組3個(gè)平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 環(huán)境適應(yīng)性結(jié)果

2.1.1 溫度對(duì)水霉菌生長(zhǎng)的影響 微生物的生長(zhǎng)繁殖有其適宜的溫度范圍，培養(yǎng)溫度過(guò)高或過(guò)低，都會(huì)造成微生物生長(zhǎng)緩慢，甚至導(dǎo)致微生物的死亡。溫度對(duì)2株水霉菌株生長(zhǎng)的影響見(jiàn)圖1。由圖1可知，菌株LY04及標(biāo)準(zhǔn)菌在10～30 ℃范圍內(nèi)均可生長(zhǎng)。菌株LY04在為25 ℃達(dá)到最大生長(zhǎng)速率，標(biāo)準(zhǔn)菌株在20 ℃和25 ℃時(shí)生長(zhǎng)最好且其生長(zhǎng)速率在同溫度下高于菌株LY04。

2.1.2 pH值對(duì)水霉菌生長(zhǎng)的影響 pH值對(duì)微生物的影響是多方面的，它不僅可以影響微生物對(duì)物質(zhì)的吸收能力，還可以影響酶的活性。過(guò)酸或過(guò)堿的環(huán)境會(huì)導(dǎo)致微生物生長(zhǎng)緩慢甚至導(dǎo)致微生物死亡。pH值對(duì)2株水霉菌株生長(zhǎng)的影響見(jiàn)圖2。由圖2可知，菌株LY04和標(biāo)準(zhǔn)菌在pH值5～9范圍內(nèi)均可生長(zhǎng)，對(duì)于酸堿環(huán)境的適應(yīng)性較強(qiáng)，菌株LY04在pH值=7時(shí)生長(zhǎng)最好，標(biāo)準(zhǔn)菌在pH值=6時(shí)生長(zhǎng)最好。在相同pH值條件下，標(biāo)準(zhǔn)菌株的生長(zhǎng)速率高于菌株LY04;但試驗(yàn)菌株對(duì)酸堿變化更敏感。

2.1.3 鹽度對(duì)水霉菌生長(zhǎng)的影響 海水中魚(yú)類(lèi)水霉病的發(fā)生率很低，如受水霉菌感染的鱒魚(yú)，當(dāng)回到海水時(shí)，水霉病癥狀逐漸消失，說(shuō)明水霉病原菌對(duì)鹽度敏感。鹽濃度對(duì)2株水霉菌株生長(zhǎng)的影響，由圖3可知，菌株LY04在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%時(shí)生長(zhǎng)被促進(jìn)，而在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%時(shí)生長(zhǎng)被抑制，最適NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%; 標(biāo)準(zhǔn)菌株在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%～2.0%范圍內(nèi)生長(zhǎng)幾乎不受影響，當(dāng)鹽度達(dá)2.5%時(shí)生長(zhǎng)顯著被抑制。在相同鹽度條件下，試驗(yàn)株的生長(zhǎng)速率顯著高于對(duì)照株。

2.2 營(yíng)養(yǎng)條件適應(yīng)性試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 葡萄糖對(duì)水霉菌生長(zhǎng)的影響 葡萄糖不僅為生物的生長(zhǎng)提供細(xì)胞的碳架，還提供細(xì)胞生命活動(dòng)所需要的能量。在微生物的培養(yǎng)基中一般都過(guò)量添加葡萄糖，但過(guò)量的葡萄糖對(duì)微生物的生長(zhǎng)是有影響。葡萄糖對(duì)2株水霉菌株生長(zhǎng)的影響見(jiàn)圖4。由圖4可知，在不添加葡萄糖時(shí)蛋白胨中的碳源就可使2個(gè)株菌生長(zhǎng)，在有蛋白胨的培養(yǎng)基中只需添加少量葡萄糖即可使水霉菌生長(zhǎng)旺盛（0.5%與對(duì)照相比 P<0.05）。在相同條件的同一葡萄糖濃度下，菌株LY04的生長(zhǎng)較標(biāo)準(zhǔn)菌株旺盛。

2.2.2 蛋白胨對(duì)水霉菌生長(zhǎng)的影響 氮是微生物必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之一，蛋白胨主要作為氮源用于微生物的培養(yǎng)。蛋白胨對(duì)2株水霉菌生長(zhǎng)的影響見(jiàn)圖5。由圖5可知，2株菌在不添加蛋白胨時(shí)均不生長(zhǎng);菌株LY04在0.5%的蛋白胨下，生長(zhǎng)速率顯著提高，0.8% 時(shí)達(dá)到飽和;標(biāo)準(zhǔn)菌在0.7%的蛋白胨下，生長(zhǎng)速率顯著提高，0.8%時(shí)達(dá)到飽和。在相同條件的同一低濃度蛋白胨下，菌株LY04生長(zhǎng)較標(biāo)準(zhǔn)菌旺盛。

2.2.3 硫酸銨對(duì)水霉菌生長(zhǎng)的影響 眾多研究表明，真菌生長(zhǎng)時(shí)對(duì)不同形態(tài)的氮鹽利用效率不同。NH+4-N以還原態(tài)形式存在，添加在培養(yǎng)基中主要增加還原態(tài)的氮。硫酸銨對(duì)2株水霉菌生長(zhǎng)的影響見(jiàn)圖6。由圖6可知，0.1%～0.3%濃度范圍的硫酸銨對(duì)2株菌的生長(zhǎng)起促進(jìn)作用，硫酸銨濃度高于 0.5% 時(shí)開(kāi)始抑制菌株生長(zhǎng)，即2株菌在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)銨態(tài)氮有偏好。相同條件同一濃度硫酸銨條件下，2株菌生長(zhǎng)差異不明顯。

2.2.4 硝酸鉀對(duì)水霉菌生長(zhǎng)的影響 硝態(tài)氮是氮元素的另外一種存在形式，為氧化態(tài)氮。在培養(yǎng)基中添加硝酸鉀，主要增加氧化態(tài)的氮。硝酸鉀對(duì)2株水霉菌生長(zhǎng)的影響見(jiàn)圖7。由圖7可知，添加硝酸鉀菌株LY04的生長(zhǎng)受到抑制;標(biāo)準(zhǔn)菌株僅在0.1%的硝酸鉀條件下生長(zhǎng)稍有促進(jìn)，增加濃度其生長(zhǎng)被抑制菌。

3 討論

3.1 水霉病原菌的環(huán)境適應(yīng)性

試驗(yàn)菌株LY04在10～30 ℃溫度范圍、5～9的pH值范圍內(nèi)均可生長(zhǎng)，對(duì)溫度和pH值的適應(yīng)性較廣。與標(biāo)準(zhǔn)菌株相比，溫度、pH值對(duì)試驗(yàn)菌株LY04影響更大，在相同的溫度、pH值條件下，試驗(yàn)菌株的生長(zhǎng)速率要慢于標(biāo)準(zhǔn)株，當(dāng)溫度達(dá)到適溫時(shí)，試驗(yàn)菌株生長(zhǎng)迅速增快，這與魚(yú)類(lèi)水霉病的發(fā)生有對(duì)應(yīng)關(guān)系，說(shuō)明試驗(yàn)菌株對(duì)新疆獨(dú)特的水域環(huán)境有高度的適應(yīng)性。在初春時(shí)節(jié)，魚(yú)類(lèi)由于越冬時(shí)的凍傷易感水霉病，但病情發(fā)展緩慢，這與此時(shí)溫度較低，水霉菌生長(zhǎng)緩慢相關(guān);初夏時(shí)節(jié)，在魚(yú)類(lèi)繁殖期，水霉菌大量侵襲魚(yú)卵，造成水霉病暴發(fā)，此時(shí)池塘水溫恰與水霉菌最適生長(zhǎng)溫度一致。在相同的外界條件下，菌株LY04對(duì)鹽度較標(biāo)準(zhǔn)菌有更好的忍耐性，生長(zhǎng)速率均好于標(biāo)準(zhǔn)株，說(shuō)明試驗(yàn)菌株對(duì)鹽度也有更好的適應(yīng)性。新疆的氣候條件導(dǎo)致新疆水域環(huán)境較高的鹽堿度，從分離獲得的菌株來(lái)看，新疆水霉病原菌都具有良好的鹽堿抵抗力，因而在新疆魚(yú)類(lèi)水霉病的防治難度更大。

3.2 水霉病原菌的營(yíng)養(yǎng)適應(yīng)性

水域環(huán)境條件對(duì)于微生物生長(zhǎng)來(lái)講應(yīng)該屬于貧營(yíng)養(yǎng)，通過(guò)營(yíng)養(yǎng)條件適應(yīng)性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，水霉病原菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)條件的要求確實(shí)較低，2株菌在不存在任何形式的糖時(shí)仍可生長(zhǎng);對(duì)氮源的要求也很低，低濃度的蛋白胨就可以使2株菌迅速生長(zhǎng)，說(shuō)明2株菌對(duì)貧營(yíng)養(yǎng)的適應(yīng)性都較好，相對(duì)而言，試驗(yàn)菌株LY04在相同營(yíng)養(yǎng)條件下生長(zhǎng)速率明顯高于標(biāo)準(zhǔn)菌株，說(shuō)明試驗(yàn)菌株在貧營(yíng)養(yǎng)環(huán)境中更易生長(zhǎng)。新疆水域由于鹽堿度較大，生物豐富度相對(duì)小，因此水域的營(yíng)養(yǎng)條件相對(duì)貧瘠，試驗(yàn)菌株對(duì)貧營(yíng)養(yǎng)的耐受恰好與此吻合。

3.3 不同形式氮源的存在對(duì)水霉病原菌的影響

氮作為地球上存在最多的元素，可以氧化態(tài)、還原態(tài)、氧化-還原態(tài)多種形式存在。許多研究都表明，生物可以利用不同形式的氮源。對(duì)于水霉病病原菌而言，尚未見(jiàn)此方面的研究報(bào)道。本研究在添加了蛋白胨的培養(yǎng)基中分別添加硫酸銨、硝酸鉀，以便探討試驗(yàn)菌株對(duì)不同形式的氮的利用情況。由結(jié)果可知，2株菌都表現(xiàn)出了對(duì)銨態(tài)氮的更好利用，硝態(tài)氮?jiǎng)t表現(xiàn)出了抑制作用。水域環(huán)境由于溶解氧的限制，一般處于還原狀態(tài)，2株菌都能更好地利用還原態(tài)氮——銨態(tài)氮，也說(shuō)明水霉病原菌對(duì)水環(huán)境的良好適應(yīng)性。

綜上所述，發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)菌株具有很好的環(huán)境適應(yīng)性和營(yíng)養(yǎng)適應(yīng)性，這些適應(yīng)性都與新疆獨(dú)特的水域環(huán)境相適應(yīng);對(duì)照菌株也表現(xiàn)出了較強(qiáng)的適應(yīng)性，這也許是魚(yú)類(lèi)水霉病廣泛發(fā)生的主要原因。

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