轉(zhuǎn)PnAlaAT3基因可提高低氮條件下楊樹上位葉谷氨酰胺合成酶活力

張國壁 馬靜 左壯

摘要：谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶又稱谷丙轉(zhuǎn)氨酶，在植物氮同化中起到關(guān)鍵作用。本試驗(yàn)以小黑楊為試材構(gòu)建pROKⅡ-PnAlaAT3植物表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化小黑楊，獲得轉(zhuǎn)基因植株，發(fā)現(xiàn)5號轉(zhuǎn)基因株系葉片中PnAlaAT3基因表達(dá)量升高，但根中表達(dá)量卻顯著降低。對野生型和PnAlaAT3 5號轉(zhuǎn)基因株系的谷氨酰胺合成酶（GS）和谷氨酰胺-α-酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶（GOGAT）活性檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在低氮條件下，PnAlaAT3轉(zhuǎn)基因株系上位葉GS活LT 較野生型植株有顯著增加。結(jié)果表明，PnAlaAT3基因可以提高小黑楊上位葉中GS活力。

關(guān)鍵詞：谷丙轉(zhuǎn)氨酶基因;楊樹;轉(zhuǎn)基因;氮素同化;谷氨酰胺合成酶活性

中圖分類號： Q785 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）03-0086-04

丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶又稱谷丙轉(zhuǎn)氨酶（Alanine aminotransferase，AlaAT），在磷酸吡哆醛的存在下，該酶可催化丙氨酸和α-酮戊二酸反應(yīng)，生成丙酮酸和谷氨酸[1-2]。在植物中，該酶位于細(xì)胞質(zhì)中，是氮素同化的關(guān)鍵酶[3]。第一個植物AlaAT基因是Muench等從玉米（Zea mays）中分離得到的[4]，之后相繼從擬南芥、大豆、小麥和苜蓿中獲得了多個編碼AlaAT的基因。以擬南芥為例，Igarashi等共鑒定了4個AlaAT基因，分別命名為AOAT1～AOAT4[5]，而大豆[6]和苜蓿[7]也有同樣的家族成員數(shù)量。從功能上來看，在擬南芥中過表達(dá)外源物種的AlaAT基因可以提高擬南芥的氮素利用效率，而過表達(dá)大麥AlaAT基因的水稻（Oryza sativa）和油菜（Brassica nupas）的產(chǎn)量和生物量都發(fā)生了顯著的提高[8-9]。過表達(dá)大麥AlaAT基因的甘蔗也在低氮條件下表現(xiàn)出了提高氮素利用率的現(xiàn)象[10-11]。

林木AlaAT基因研究相對較晚，2017年，Xu等從楊樹中共克隆得到4個成員，分別命名為PnAlaAT1、PnAlaAT2、PnAlaAT3、PnAlaAT4，其中PnAlaAT1和PnAlaAT2主要表達(dá)在葉中，并受日節(jié)律的影響，而PnAlaAT3和PnAlaAT4表達(dá)量在根中相對較多，其中PnAlaAT3在根中表達(dá)量最高，并受外源氮素的調(diào)節(jié)而顯著上調(diào)[12]。但該基因在氮素同化中是否起到關(guān)鍵作用尚不清楚。本研究將PnAlaAT3在楊樹體內(nèi)進(jìn)行過表達(dá)的遺傳轉(zhuǎn)化，并對轉(zhuǎn)化株系在不同濃度氮素下的植株生長狀況進(jìn)行研究，從而推斷該基因在楊樹氮素同化中所起的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

采用小黑楊作為試驗(yàn)材料，取材于東北林業(yè)大學(xué)試驗(yàn)林場。pGEM-T Easy載體和大腸桿菌（Escherichia coli） Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;雙元表達(dá)載體pROKⅡ和根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株EHA105，由筆者實(shí)驗(yàn)室保存;各種限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒，均購自TAKARA公司;引物合成委托哈爾濱博士生物科技有限公司完成。其他所需試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 載體構(gòu)建 根據(jù)楊樹來源的PnAlaAT3（GenBank登錄號：KT768062）設(shè)計(jì)引物PnAlaAT3-F/R：5′-GCTCTAGACCATGGCTCGTGTTTCTCTTG-3′，5′-TCCCCCGGGTCACTCGCGAAACTCCTCC-3′。下劃線分別為XbaⅠ和SmaⅠ的酶切位點(diǎn)。以重組質(zhì)粒pGEM-T Easy-AlaAT3為模板，用KOD plus高保真酶擴(kuò)增目的片段，擴(kuò)增產(chǎn)生的目的基因條帶為 1 446 bp。采用XbaⅠ和SmaⅠ雙酶切將目的片段連接到雙元表達(dá)載體pROKⅡ中，構(gòu)建植物表達(dá)載體pROKⅡ-AlaAT3（圖1-A）。在構(gòu)建的表達(dá)載體中，AlaAT3上游啟動子為組成型強(qiáng)啟動子CaMV 35S，終止子為NOS，卡那霉素抗性基因。采用電擊法將重組表達(dá)載體pROKⅡ-PnAlaAT3轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105中。

1.2.2 遺傳轉(zhuǎn)化 以小黑楊為受體物種，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對其進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。選取長勢好的小黑楊無菌苗的葉片切成邊長為1 cm的正方形小塊，在農(nóng)桿菌中侵染20 min后取出葉片，接種在不含抗生素的MS[13]（Murashige & Skoog）分化培養(yǎng)基上，于25 ℃條件下黑暗培養(yǎng)2 d。之后將葉片接種到含有50 mg/L卡那霉素（Kan）和300 mg/L頭孢霉素（Cef）的篩選培養(yǎng)基中，在25 ℃、16 h光照/8 h黑暗的條件下培養(yǎng)。待分化的不定芽長到1 cm左右時將其切下，轉(zhuǎn)移到含有50 mg/L卡那霉素和 300 mg/L 頭孢霉素的抽莖培養(yǎng)基中，待抗性芽長到2 cm時，將其切下并放入含有25 mg/L卡那霉素和300 mg/L頭孢霉素的生根培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)抗性植株并生根。詳細(xì)培養(yǎng)基配方見表1。

1.2.3 轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測 以轉(zhuǎn)基因小黑楊DNA為模板，用PnAlaAT3基因的特異性引物序列（PnAlaAT3-F，5′-ATGGAAGTCACTGGGTTTGG-3′;PnAlaAT3-R，5′-GAGTAGGCTGCGACAGTAAAAG-3′）進(jìn)行PCR檢測，目的條帶送樣測序。利用實(shí)時熒光定量PCR方法檢測PnAlaAT3基因在轉(zhuǎn)基因小黑楊中的表達(dá)情況，以PtActin基因?yàn)閮?nèi)參基因。PnAlaAT3定量引物序列：F：5′-GTTCCTGGCTCTGGCTTTGGG-3′;R：5′-ACTCCGTGAGACGGGAGACAACA-3′。

1.2.4 不同氮素處理及指標(biāo)檢測 選取健壯的轉(zhuǎn)化植株和野生型無菌苗，移到滅菌的水培培養(yǎng)液（無蔗糖及瓊脂的MS培養(yǎng)液）中，溫室培養(yǎng)一段時間后，將所有試驗(yàn)苗分為4組，分別為野生型正常氮組（2 mmol/L NH4NO3）、轉(zhuǎn)基因正常氮組（2 mmol/L NH4NO3）、野生型低氮組（1 mmol/L NH4NO3）和轉(zhuǎn)基因低氮組（1 mmol/L NH4NO3）。用上述配置好的營養(yǎng)液裝入水培裝置，把小黑楊材料轉(zhuǎn)入水培裝置，處理2 d，處理2 d后用吸水紙吸干根部殘留的營養(yǎng)液，收樣，放入-80 ℃保存。其中葉片收樣分為2個部分：第一部分是從小黑楊第1張完全展開的葉片開始依次向下取3張葉片的混樣;第二部分是最下方3張葉片，分別代表小黑楊的新葉（上位葉）及老葉（下位葉）部分。轉(zhuǎn)氨酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合酶等的活性用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司的試劑盒進(jìn)行檢測。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 20.0軟件對轉(zhuǎn)基因株系與對照在表達(dá)水平及表型性狀的差異顯著性進(jìn)行t檢驗(yàn)（P=0.05）。所有樣品為5棵苗的混合樣本，生物學(xué)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)PnAlaAT3基因的獲得及分子檢測

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將PnAlaAT3基因轉(zhuǎn)入小黑楊中，共獲得17棵轉(zhuǎn)化株系，挑選5、6、7號轉(zhuǎn)化株系（圖1-B中1～3）進(jìn)行DNA及RNA等后續(xù)檢測，以DNA為模板的PCR檢測結(jié)果表明這些條帶的大小約為400 bp（圖1-B），經(jīng)測序確定為 354 bp，擴(kuò)增結(jié)果與預(yù)期相符。這些結(jié)果初步證明PnAlaAT3基因已經(jīng)成功整合到野生型小黑楊的基因組中。將5號轉(zhuǎn)化株系進(jìn)行無性擴(kuò)繁后檢測株高，結(jié)果如圖 1-C和圖2所示，野生型平均株高為15 cm，轉(zhuǎn)化株系平均株高為20 cm，兩者株高差異顯著（P<0.05）。通過熒光定量PCR方法檢測PnAlaAT3基因在該轉(zhuǎn)化株系根和葉中的表達(dá)量，結(jié)果如圖3所示，在葉片中，轉(zhuǎn)基因小黑楊葉片中的基因表達(dá)量高于非轉(zhuǎn)基因的植株;而在根中，轉(zhuǎn)基因小黑楊中PnAlaAT3基因的表達(dá)量顯著低于野生型植株。由此表明，PnAlaAT3基因不僅成功整合到野生型小黑楊的基因組中，并且在小黑楊不同組織中成功表達(dá)。

2.2 轉(zhuǎn)PnAlaAT3基因植株AlaAT酶活變化

為了確定轉(zhuǎn)PnAlaAT3基因的轉(zhuǎn)化株系在酶活水平的變化情況，對野生型及轉(zhuǎn)化株系地上和地下部分酶活進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖4所示，在根中，轉(zhuǎn)基因植株的AlaAT酶活與野生型植株基本一致，但在葉片中轉(zhuǎn)基因植株的AlaAT酶活相對于野生型植株有顯著的提高。

2.3 轉(zhuǎn)PnAlaAT3基因小黑楊對氮同化相關(guān)基因酶活的影響

GS和GOGAT是氮素同化過程中關(guān)鍵的基因，本試驗(yàn)對不同氮素下轉(zhuǎn)PnAlaAT3基因株系的谷氨酰胺合成酶（GS）以及谷氨酰受-α-酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶（GOGAT）活力進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖5所示，在根中以及下位葉中，GS以及GOGAT活力沒有顯著差異，即使在不同氮素處理的條件下也是如此;在上位葉中，轉(zhuǎn)PnAlaAT3基因的轉(zhuǎn)化株系GOGAT活力沒有顯著區(qū)別，但GS活力在低氮條件下相對于野生型植株有明顯的提高，且差異達(dá)到顯著水平。

3 結(jié)論與討論

在植物中，谷丙轉(zhuǎn)氨酶不僅在逆境條件下發(fā)揮一定的作用，在外界氮素發(fā)生變化時，該酶也同時起到提高氮素利用的功能[13]。有研究表明，在小麥中氮素利用率的高低與谷丙轉(zhuǎn)氨酶表達(dá)量成正相關(guān)[14-15]。在油菜中組成型表達(dá)大麥的谷丙轉(zhuǎn)氨酶基因，結(jié)果導(dǎo)致在低氮條件下油菜的氮素利用率提高[9，16]。將大麥AlaAT基因轉(zhuǎn)入水稻，并加以水稻的根部特異性啟動子，結(jié)果導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因水稻分蘗數(shù)明顯增加，根更加稠密[8]。同時，轉(zhuǎn)基因水稻地上

部分的生物量和含氮總量也顯著增加，籽粒產(chǎn)量顯著高于野生型水稻[8]。同時，谷氨酸、谷氨酰胺和天冬氨酸等的含量也發(fā)生相應(yīng)變化[17]。

本研究中將PnAlaAT3基因轉(zhuǎn)入野生型小黑楊，獲得了過表達(dá)株系，在相同生長條件下發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株長勢優(yōu)于野生型植株，株高有顯著增加。且轉(zhuǎn)基因植株葉片中的AlaAT酶活高于野生型植株葉片中的AlaAT酶活。在低氮處理下，轉(zhuǎn)化株系的上位葉片中GS活力顯著高于野生型植株，株高也優(yōu)于野生型植株。GS活力升高會積累更多的谷氨酰胺，以提供給上位葉更多的原材料，從而使轉(zhuǎn)基因植株長勢更好。

參考文獻(xiàn)：

[1]Miyashita Y，Dolferus R，Ismond K P，et al. Alanine aminotransferase catalyses the breakdown of alanine after hypoxia in Arabidopsis thaliana[J]. The Plant Journal，2007，49（6）：1108-1121.

[2]Yonaha K，Suzuki K，Toyama S. Streptomyces beta-alanine：alpha-ketoglutarate aminotransferase，a novel omega-amino acid transaminase. Purification，crystallization，and enzymologic properties[J]. Journal of Biological Chemistry，1985，260：3265-3268.

[3]黃冰艷，高 偉，苗利娟，等. 谷氨酰胺合成酶基因研究進(jìn)展及其在植物氮代謝調(diào)控中的應(yīng)用[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報，2010，26（23）：53-57.

[4]Muench D G，Christopher M E，Good A G. Cloning and expression of a hypoxic and nitrogen inducible maize alanine aminotransferase gene[J]. Physiologia Plantarum，1998，103（4）：503-512.

[5]Igarashi D，Miwa T，Seki M，et al. Identification of photorespiratory glutamate：glyoxylate aminotransferase （GGAT） gene in Arabidopsis[J]. The Plant Journal，2003，33（6）：975-987.

[6]Rocha M，Sodek L，Licausi F，et al. Analysis of alanine aminotransferase in various organs of soybean （Glycine max） and in dependence of different nitrogen fertilisers during hypoxic stress[J]. Amino Acids，2010，39（4）：1043-1053.

[7]Ricoult C，Echeverria L O，Cliquet J B，et al. Characterization of alanine aminotransferase （AlaAT） multigene family and hypoxic response in young seedlings of the model legume Medicago truncatula[J]. Journal of Experimental Botany，2006，57（12）：3079-3089.

[8]Shrawat A K，Carroll R T，DePauw M，et al. Genetic engineering of improved nitrogen use efficiency in rice by the tissue-specific expression of alanine aminotransferase[J]. Plant Biotechnology Journal，2008，6（7）：722-732.

[9]Good A G，Johnson S J，De Pauw M，et al. Engineering nitrogen use efficiency with alanine aminotransferase[J]. Revue Canadienne De Botanique，2007，85：252-262.

[10]Snyman S J，Hajari E，Watt M P，et al. Improved nitrogen use efficiency in transgenic sugarcane：phenotypic assessment in a pot trial under low nitrogen conditions[J]. Plant Cell Reports，2015，34（5）：667-669.

[11]徐紅衛(wèi)，郭桂梅，黃賽華， 等. 兩份大麥純合突變體氮代謝相關(guān)基因于不同生長發(fā)育時期的表達(dá)[J]. 植物生理學(xué)報，2017，53（11）：2031-2036.

[12]Xu Z，Jing M，Qu C，et al. Identification and expression analyses of the alanine aminotransferase（AlaAT） gene family in poplar seedlings[J]. Scientific Reports，2017，7：45933.

[13]Enosawa S，Dozen M，Tada Y，et al. Electron therapy attenuated elevated alanine aminotransferase and oxidative stress values in type 2 diabetes-induced nonalcoholic steatohepatitis of rats[J]. Cell Medicine，2013，6（1/2）：63-73.

[14]Tian H，F(xiàn)u J，Drijber RA，et al. Expression patterns of five genes involved in nitrogen metabolism in two winter wheat（Triticum aestivum L.） genotypes with high and low nitrogen utilization efficiencies[J]. Journal of Cereal Science，2015，61：48-54.

[15]董召娣，易 媛，張明偉，等. 春性和半冬性小麥花后旗葉和籽粒氮代謝關(guān)鍵酶活性的差異[J]. 麥類作物學(xué)報，2015，35（8）：1098-1106.

[16]Mauchline T H，F(xiàn)owler J E，East A K，et al. Mapping the Sinorhizobium meliloti 1021 solute-binding protein-dependent transportome[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2006，103（47）：17933-17938.

[17]Kan C C，Chung T Y，Juo Y A，et al. Glutamine rapidly induces the expression of key transcription factor genes involved in nitrogen and stress responses in rice roots[J]. BMC Genomics，2015，16（1）：731.