根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的真菌遺傳轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展

李俊香 古勤生

摘要：根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化是近20年來真菌研究的主要技術(shù)之一。農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化（ATMT）技術(shù)已廣泛應(yīng)用于隨機(jī)突變試驗(yàn)中，以確定哪些基因是真菌與昆蟲、植物、哺乳動物甚至其他真菌的致病相關(guān)基因。該技術(shù)廣泛地應(yīng)用于正向和反向遺傳學(xué)，使得許多真菌基因功能得以闡明。盡管ATMT技術(shù)影響深遠(yuǎn)，但該技術(shù)作為一種轉(zhuǎn)化工具在真菌中的應(yīng)用并不均衡。本文綜述了ATMT技術(shù)在發(fā)掘真菌功能基因方面的最新進(jìn)展，以及它的優(yōu)點(diǎn)和局限性。

關(guān)鍵詞：根癌農(nóng)桿菌;絲狀真菌;遺傳轉(zhuǎn)化;ATMT技術(shù)

中圖分類號： Q949.32;S182 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）03-0043-06

1998年，Dunn-Coleman等在《Nature Biotechnology》雜志上發(fā)表了一個(gè)評論，介紹了真菌上應(yīng)用的一個(gè)新的轉(zhuǎn)化技術(shù)，即利用根癌農(nóng)桿菌將外源的DNA轉(zhuǎn)入到絲狀真菌中[1]。當(dāng)外源DNA轉(zhuǎn)入真菌進(jìn)而整合到真菌基因組的過程中有可能破壞一個(gè)關(guān)鍵的基因而引起性狀的改變，據(jù)此可以了解有關(guān)真菌基因或多或少的信息。將根癌農(nóng)桿菌應(yīng)用于真菌的遺傳轉(zhuǎn)化，這一非凡創(chuàng)舉早在1995年于模式生物釀酒酵母中首次被證實(shí)[2]，1996年利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化了酵母[3]，1998年將這一植物病原細(xì)菌成功應(yīng)用于子囊菌和擔(dān)子菌等7種絲狀真菌的轉(zhuǎn)化中[4]。從1995年第一次報(bào)道根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)真菌遺傳轉(zhuǎn)化到2005年，10年間，該技術(shù)已成功應(yīng)用于50余種真菌[5]。此后10年，根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化在真菌中的應(yīng)用不斷擴(kuò)大，在許多真菌中甚至作為一種標(biāo)準(zhǔn)的試驗(yàn)技術(shù)進(jìn)行基因操作。有些真菌，農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化（ATMT）技術(shù)是最容易甚至是唯一的一種引入外源DNA的試驗(yàn)技術(shù)。在其他真菌種類中，ATMT成為一種強(qiáng)大的正向遺傳學(xué)技術(shù)，用于構(gòu)建攜帶 T-DNA隨機(jī)插入標(biāo)簽的突變體庫并用于基因分析，抑或用于反向遺傳學(xué)構(gòu)建特定靶基因替代的突變體，還可操控基因的表達(dá)以取得生物工程方面的效益。了解這項(xiàng)技術(shù)是如何應(yīng)用的能夠指導(dǎo)或預(yù)測未來技術(shù)在真菌中的應(yīng)用，從而推進(jìn)真菌方面的研究。

1 根癌農(nóng)桿菌及其介導(dǎo)的真菌遺傳轉(zhuǎn)化

根癌農(nóng)桿菌是一種植物病原菌，屬于α-變形菌，是自然界中一種天然的能創(chuàng)造轉(zhuǎn)基因生物的介體。在這個(gè)過程中，根癌農(nóng)桿菌將質(zhì)粒的一個(gè)DNA片段插入到宿主植物細(xì)胞核基因組中，自然界里，這段細(xì)菌的DNA能夠編碼蛋白質(zhì)用于改變植物的生長而利于自己的繁殖[6]。在大多情況下，這會導(dǎo)致植物形成非增生性的癭或瘤，被改變的受體基因組通常不會遺傳給后代植株。然而，甘薯基因組分析表明，在很稀有的情況下，這些轉(zhuǎn)化事件能夠更永久地融合進(jìn)受體植物基因組并遺傳下去[7]。農(nóng)桿菌屬細(xì)菌屬于根瘤菌科，更接近于能與植物形成共生關(guān)系固定空氣中氮素的根瘤菌屬細(xì)菌。根癌農(nóng)桿菌又被命名為放射型根瘤菌[8]，但真菌轉(zhuǎn)化領(lǐng)域使用該物種作為轉(zhuǎn)化介體時(shí)依舊使用根癌農(nóng)桿菌這個(gè)名字。

在基因組測序工程發(fā)展以前，唯一已知的基因水平轉(zhuǎn)移的例子，便是根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因從細(xì)菌轉(zhuǎn)化整合到真核生物基因組中[9]。根癌農(nóng)桿菌天然地存在于自然環(huán)境中，這些細(xì)菌周圍存在很多寄主，其中包括很可能恰好出現(xiàn)在植物傷口附近的真菌，受傷的植物能夠誘導(dǎo)T-DNA從細(xì)菌到真菌的轉(zhuǎn)移。Knight等先在植物材料上共培養(yǎng)了植物病原真菌黃萎病病菌和含有質(zhì)粒的能潛在轉(zhuǎn)化真菌的根癌農(nóng)桿菌，然后在植物細(xì)胞中觀察被轉(zhuǎn)化的真菌，研究證明，這樣的基因轉(zhuǎn)化事件在自然環(huán)境中發(fā)生是完全可能的[10]。當(dāng)然，自然界中，這樣將有益的DNA片段轉(zhuǎn)化到真菌里的事件發(fā)生的概率是很小的，所以這樣的轉(zhuǎn)化事件很可能不具備選擇優(yōu)勢，但有趣的是可以在進(jìn)化的時(shí)間尺度上計(jì)算這種事件發(fā)生的頻率。實(shí)際上，除了植物[7]，基因組測序發(fā)現(xiàn)，一些真菌基因組，如米曲霉菌基因組序列信息上發(fā)現(xiàn)了根癌農(nóng)桿菌類似DNA序列[11]。

植物分子生物學(xué)家將野生型根癌農(nóng)桿菌改造成自己喜好的菌株。細(xì)菌菌株和遺傳物質(zhì)被修改，一方面阻止寄主植物根瘤的形成，另一方面將質(zhì)粒上可以被轉(zhuǎn)化到植物基因組上T-DNA的左右邊界各添加25 bp的重復(fù)序列。從細(xì)菌遺傳學(xué)角度，而不是能更精確描述T-DNA從細(xì)菌到真核寄主基因組轉(zhuǎn)移的這種轉(zhuǎn)化整合方法的角度看，這種基因整合機(jī)制可以在不同的物種間發(fā)生。根癌農(nóng)桿菌寄主的多樣性，能夠使其應(yīng)用到模式物種擬南芥以外的許多不同的真核物種當(dāng)中，如真菌就是最好的例子[9]。

笨拙的載體系統(tǒng)是根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的真菌遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)發(fā)展中最初的限制因素之一。一些根癌農(nóng)桿菌載體非常難操作，因?yàn)檫@些載體是針對介導(dǎo)植物遺傳轉(zhuǎn)化開發(fā)的，其上攜帶傳統(tǒng)克隆技術(shù)需要的有限的限制性酶切位點(diǎn)，這些限制性酶切位點(diǎn)便于預(yù)先設(shè)置植物轉(zhuǎn)化上特殊需要的調(diào)節(jié)因子。幸運(yùn)的是一些適用于植物遺傳轉(zhuǎn)化的載體中也包含一些小的載體，這些載體便于操作，因?yàn)樗鼈兒形丛薷牡腡-DNA區(qū)域。一些改進(jìn)的載體構(gòu)建方法，如釀酒酵母中的酵母重組[12-14]，Gateway系統(tǒng)[15]和Golden Gate組裝技術(shù)[16]，使載體構(gòu)建和改造變得既簡單又高通量。

根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的真菌遺傳轉(zhuǎn)化的另外一個(gè)限制因素是早期使用的那些載體能夠插入的DNA長度有限，這對于大基因片段的互補(bǔ)是一個(gè)很大的技術(shù)限制。這個(gè)問題的解決辦法之一是使用雙元細(xì)菌人工染色體（BIBAC）技術(shù)系統(tǒng)，這個(gè)技術(shù)系統(tǒng)能夠?qū)⑷魏我粋€(gè)含有真菌DNA大片段序列的人造細(xì)菌染色體修改成含有左右邊界序列的大片段，從而實(shí)現(xiàn)真菌的直接轉(zhuǎn)化。例如，使用這種方法成功地將75 kb的大DNA片段轉(zhuǎn)化整合到黃瓜尖孢鐮刀菌基因組中[17]。一個(gè)相似的系統(tǒng)，即將人造細(xì)菌染色體轉(zhuǎn)變成適用于玉蜀黍黑粉菌遺傳轉(zhuǎn)化的載體系統(tǒng)也被開發(fā)[18]。

2 ATMT相對于其他轉(zhuǎn)化技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)

早在ATMT技術(shù)應(yīng)用于真菌之前，真菌中使用其他轉(zhuǎn)化方法，例如聚乙二醇或陽離子聚乙二醇介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化[19-20]。然而，ATMT技術(shù)相對于這些轉(zhuǎn)化技術(shù)改進(jìn)了許多，這也解釋了在許多真菌中為什么選擇ATMT作為轉(zhuǎn)化工具。

首先，ATMT技術(shù)不需要去除真菌細(xì)胞壁制備原生質(zhì)體。然而，在一些真菌種類中，當(dāng)其他轉(zhuǎn)化方法難以實(shí)現(xiàn)或者不穩(wěn)定時(shí)，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化依然是一個(gè)備選方案。不同的真菌有不同的細(xì)胞壁，并且在真菌的不同生長和發(fā)展階段細(xì)胞壁也不同。這也解釋了為什么在不同的真菌種類中，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化容易成功，但是這對于解決尋找合適細(xì)胞壁降解酶困難方面并沒有什么幫助。相反，雖然根癌農(nóng)桿菌對細(xì)胞類型有偏好性，但是，農(nóng)桿菌可以轉(zhuǎn)化的細(xì)胞種類很多，包括哺乳動物細(xì)胞[21]、卵菌細(xì)胞[22]，以及許多真菌不同組織和類型的細(xì)胞。

ATMT技術(shù)優(yōu)于其他轉(zhuǎn)化方法的第二個(gè)突出特點(diǎn)是，T-DNA可以隨機(jī)地插入到基因組中。因此，ATMT技術(shù)的主要影響源自其為隨機(jī)突變能為正向遺傳篩選提供資源。除了ATMT技術(shù)，REMI技術(shù)也引起插入突變。但是REMI技術(shù)，在DNA轉(zhuǎn)入原生質(zhì)體細(xì)胞這個(gè)階段需要限制性內(nèi)切酶。另外，REMI技術(shù)在應(yīng)用中存在許多問題，例如，突變與插入的DNA片段沒有關(guān)系，而是因?yàn)橄拗菩詢?nèi)切酶引起了DNA損傷。其他的插入突變技術(shù)包括轉(zhuǎn)座子插入，但是這個(gè)方法往往需要根據(jù)不同的物種設(shè)計(jì)特殊的結(jié)構(gòu)。在真菌隨機(jī)插入突變轉(zhuǎn)化方法上，ATMT技術(shù)在很大程度上取代了REMI技術(shù)[5]。因?yàn)樵贏TMT技術(shù)中，T-DNA通常以單拷貝插入的形式整合到基因組中，所以，任何一個(gè)表型改變的突變體都很可能是由于插入引起的。通過篩選 T-DNA 插入突變體庫，獲得表型突變體，然后采用不同的方法通常是PCR技術(shù)獲得T-DNA插入位點(diǎn)左右側(cè)翼序列，來辨別受影響的基因。T-DNA插入引起的突變，基因功能鑒定程序通常是：如果突變沒有影響性周期，則連鎖分析T-DNA突變體和對應(yīng)交配型菌株的后代;根據(jù)研究機(jī)體選擇合適的轉(zhuǎn)化技術(shù)對靶標(biāo)基因進(jìn)行等位替代;用一個(gè)野生型基因進(jìn)行互補(bǔ)試驗(yàn)。

ATMT技術(shù)還可以采用反向遺傳學(xué)的方法刪除或破壞目的基因。這不同于隨機(jī)插入突變，因?yàn)檗D(zhuǎn)化載體上添加了DNA序列，這些序列含有受體基因組的特異位點(diǎn)，可以調(diào)節(jié)外源同源互補(bǔ)序列。因此，ATMT技術(shù)可以在所需要的基因組區(qū)域尤其是在一個(gè)假定的開放閱讀框處進(jìn)行基因替換。ATMT常常發(fā)生在非同源末端連接的DNA修復(fù)過程[23]。這個(gè)過程產(chǎn)生的突變增加了基因替換轉(zhuǎn)化子的比例。在過去的10年里，迅速增加的公共的可以利用的真菌基因組序列[24]，使得通過分析目標(biāo)基因的刪除來鑒定單個(gè)或基因家族相對容易。同一時(shí)期，出現(xiàn)了許多新的分子研究技術(shù)，其中包括誘導(dǎo)型啟動子系統(tǒng)[25]、可回收標(biāo)記[23]，以及最新的CRISPR-Cas基因編輯[26]。這些技術(shù)使得基因組功能分析達(dá)到高通量水平，使產(chǎn)業(yè)得以馴化，疾病發(fā)生關(guān)鍵過程以及許多真菌假定藥物靶點(diǎn)的分析進(jìn)入系統(tǒng)水平[27]。因此，使用ATMT技術(shù)對真菌基因組進(jìn)行針對性的操作是一個(gè)非常關(guān)鍵的技術(shù)，這將利于實(shí)現(xiàn)更多近期的突破。

最后，這個(gè)容易轉(zhuǎn)化的方法，對基因功能的發(fā)掘?qū)崿F(xiàn)了公平競爭，而不是由模式生物主導(dǎo)的分子生物學(xué)試驗(yàn)。對于非傳統(tǒng)物種，一旦基因組序列可用，這種技術(shù)將變得非常實(shí)用。

3 ATMT技術(shù)在真菌中的研究趨勢

2005年，Michielse等在發(fā)表的一篇綜述里描述了ATMT技術(shù)的轉(zhuǎn)化特點(diǎn)[5]，然而，接下來的10年，一些研究趨勢還在繼續(xù)，更多焦點(diǎn)還是共培養(yǎng)條件對轉(zhuǎn)化效率的影響，例如，細(xì)菌和真菌細(xì)胞濃度，共培養(yǎng)時(shí)間和溫度以及受傷植物根釋放的可以促進(jìn)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的代謝產(chǎn)物乙酰丁香酮的濃度。專注于轉(zhuǎn)化效率主要是為了與原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和其他轉(zhuǎn)化方法作比較，因此努力優(yōu)化轉(zhuǎn)化條件以求獲得最高的轉(zhuǎn)化效率。然而，這并不重要，因?yàn)锳TMT轉(zhuǎn)化過程簡單，如果需要更多的轉(zhuǎn)化株，可以增加轉(zhuǎn)化次數(shù)。相反地，ATMT方法是一個(gè)理想的轉(zhuǎn)化方法，因?yàn)椴捎迷摷夹g(shù)做轉(zhuǎn)化能夠快速獲得一個(gè)單拷貝插入突變體庫，并且感興趣的突變體表型與基因突變相關(guān)，但是很少有研究表明，獲得的轉(zhuǎn)化子數(shù)量是否與單個(gè)轉(zhuǎn)化子的T-DNA插入次數(shù)相關(guān)。目前更多的刊物趨向于報(bào)道在某個(gè)物種中首次成功使用ATMT轉(zhuǎn)化技術(shù)，而很少有出版物報(bào)道如何合理地實(shí)施該技術(shù)以獲得基因突變或者用于其他目的?？紤]到ATMT技術(shù)成功轉(zhuǎn)化的真菌只是種類繁多的真菌中的一小部分，所以仍舊有很多的未開發(fā)的資源等待發(fā)掘。

4 ATMT技術(shù)存在的問題和局限

前面突出強(qiáng)調(diào)了ATMT轉(zhuǎn)化技術(shù)的使用給真菌領(lǐng)域帶來的新的大的進(jìn)步。然而，這個(gè)轉(zhuǎn)化技術(shù)也不盡完美，研究者在使用該技術(shù)設(shè)計(jì)正向遺傳學(xué)試驗(yàn)，替換靶標(biāo)基因或分析從突變菌株獲得的解釋數(shù)據(jù)時(shí)應(yīng)該考慮到這個(gè)技術(shù)的局限性。

考慮到產(chǎn)生成千上萬個(gè)突變體是功能基因組研究的先決條件，所以要從幾個(gè)方面對ATMT轉(zhuǎn)化技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)以克服重大試驗(yàn)的局限性，并確保這一技術(shù)非常高通量。然而在一些情況下，技術(shù)挑戰(zhàn)是不可避免的。例如，雖然96孔板的應(yīng)用促使醋酸鋰或聚乙二醇介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化變得高通量化[28]，但是，采用ATMT技術(shù)進(jìn)行相似地轉(zhuǎn)化試驗(yàn)時(shí)，卻不能使用96孔板模式。其中的技術(shù)挑戰(zhàn)可能是微型化培養(yǎng)的根癌農(nóng)桿菌不能使其在轉(zhuǎn)化之前達(dá)到最佳的生長階段。然而，在減少用于ATMT轉(zhuǎn)化技術(shù)試驗(yàn)的根癌農(nóng)桿菌密集型克隆負(fù)擔(dān)方面已經(jīng)取得了許多進(jìn)步，這多虧于根癌農(nóng)桿菌兼容質(zhì)粒的出現(xiàn)。與醋酸鋰或聚乙二醇介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化相比，這樣的克隆更具挑戰(zhàn)性，因?yàn)椋谀抢锞€型DNA片段可以通過簡單的PCR階段進(jìn)行組裝[29]。研究者已經(jīng)獲得了與Invitrogen公司的Gateway克隆技術(shù)兼容的根癌農(nóng)桿菌質(zhì)粒，例如，能超高通量產(chǎn)生一代Zymoseptoria tritici的過度表達(dá)菌株[30]。又如，通過釀酒酵母中的酵母重組技術(shù)或Golden Gate組裝技術(shù)構(gòu)建根癌農(nóng)桿菌兼容載體，使得高通量載體構(gòu)建獲得了相應(yīng)提高[12-14]。這些研究強(qiáng)調(diào)了一些重要技術(shù)挑戰(zhàn)是如何被攻破的，另外，最近研究證明ATMT技術(shù)能夠用于真菌高通量功能基因組分析[30]。更確切地說，在真菌功能基因組大數(shù)據(jù)時(shí)代，如果同時(shí)考慮ATMT轉(zhuǎn)化技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)，那么該技術(shù)依舊是一個(gè)非常有用的技術(shù)并將繼續(xù)在真菌研究中扮演重要角色。針對存在的問題和局限，筆者有以下4點(diǎn)建議：

首先，一個(gè)理想的插入突變方法應(yīng)該有能力擊中每一個(gè)基因，但是T-DNA對真菌基因組插入存在非隨機(jī)插入模式。例如，新型隱球菌黑色素生物合成LAC1基因插入突變體分析研究表明，在 1 kb 啟動子區(qū)域有5個(gè)T-DNA插入，而2.8 kb的編碼區(qū)沒有T-DNA插入，所以T-DNA對這個(gè)單基因的插入是非隨機(jī)的[31-33]。又如，對數(shù)以萬計(jì)的植物致病性子囊菌T-DNA插入突變體分析表明，T-DNA插入也存在偏好性，不是隨機(jī)的。這也許是想要使用ATMT轉(zhuǎn)化技術(shù)構(gòu)建一個(gè)擁有每個(gè)基因都有T-DNA插入的突變體庫的最大限制因素。盡管如此，T-DNA傾向于插入到基因外部的插入模式最近已經(jīng)轉(zhuǎn)變成了一個(gè)鑒定必需基因的有利條件[14]。如，在緊鄰T-DNA的右邊界克隆上GAL7基因的調(diào)節(jié)序列，并通過ATMT技術(shù)轉(zhuǎn)入擔(dān)子菌類新生隱球菌。轉(zhuǎn)化和篩選都在含有半乳糖的介體中進(jìn)行以確保插入位點(diǎn)附近的任何基因都能表達(dá)，然后在含有能抑制GAL7基因表達(dá)的葡萄糖的介體中對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行生長測試。在葡萄糖存在的情況下，大約1%的轉(zhuǎn)化子不能生長。分析T-DNA在新型隱球菌（Crypyococcus neoformans）基因組中的插入位點(diǎn)，表明這些位點(diǎn)位于子囊菌必需功能基因中。

其次，理想情況下，T-DNA的插入應(yīng)包括完整的左右邊界，隨后獲得的突變體若表現(xiàn)出有趣的性狀，通過左右邊界序列就可以快速鑒定出插入點(diǎn)附近的基因。鑒定這些被刪除或破壞的基因可以通過交錯(cuò)式熱不對稱PCR（TAIL-PCR），反向PCR或其他的方法實(shí)現(xiàn)。然而，這種基因鑒定程序可能會遇到瓶頸，或者最終得到幾種可能性結(jié)論。T-DNA 的不同插入方式可能為后續(xù)基因鑒定帶來巨大挑戰(zhàn)，例如，斷裂式插入，攜帶超越左右邊界的額外的質(zhì)粒DNA片段插入，或者多拷貝串聯(lián)插入，抑或多拷貝分散插入。插入也可能伴隨著基因刪除和基因組染色體重排。若T-DNA傾向于插入到基因間隔區(qū)，那么須要解決的問題是確定2個(gè)基因中的哪一個(gè)受插入的影響，有時(shí)對2個(gè)基因都進(jìn)行qPCR試驗(yàn)可以鑒定出被影響的基因。大多情況下假設(shè)T-DNA的插入減弱了相鄰基因的表達(dá)。然而，有些情況下，如在Leptosphaeria maculans菌中 T-DNA 的插入會加強(qiáng)相鄰基因的表達(dá)[34]。

再者，對于有些物種，ATMT技術(shù)并不能比其他轉(zhuǎn)化方法提供更多有價(jià)值的信息。對很多真菌來說，ATMT技術(shù)并不能使我們更了解基因功能。這包括在真菌上首次應(yīng)用該轉(zhuǎn)化技術(shù)的釀酒酵母[2]。這也是可以理解的，因?yàn)槠渌霓D(zhuǎn)化技術(shù)可以應(yīng)用到釀酒酵母上，可以使用化學(xué)誘變?nèi)缓笸ㄟ^互補(bǔ)克隆基因，可以構(gòu)建和使用含有刪除所有基因的整套的基因缺失庫，還可以利用基因組水平的資源。有這么多的技術(shù)可以分離突變體，鑒定被影響的基因，或表型篩選基因缺失庫，所以使用ATMT技術(shù)作為另外一種轉(zhuǎn)化方法幾乎沒有帶來什么額外的益處。正如上面提到的，類似的情況也存在于絲狀真菌模式物種粗糙脈孢菌（Neurospora crassa），該真菌雖然是首次使用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的絲狀真菌物種之一[4]，但是此后再沒使用該技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。第3個(gè)例子是關(guān)于粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe），該菌是揭示細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制的模式物種，而細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制曾是2001年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)的主題，事實(shí)上，這個(gè)菌及所在的外囊菌亞門的所有物種似乎都沒有使用過ATMT技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。

最后，ATMT轉(zhuǎn)化技術(shù)通常情況下是質(zhì)粒將 T-DNA插入到基因組，然而在一些真菌中，例如轉(zhuǎn)化玉米黑粉菌（Ustilago maydis）或曲霉菌屬（Aspergillus spp.）使用含AMA1序列的質(zhì)粒，那么質(zhì)粒將會進(jìn)行自主復(fù)制[35-36]。這些質(zhì)?？梢匀菀椎赝ㄟ^互補(bǔ)克隆被營救回大腸桿菌，也可以通過反向選擇被蓄意丟失。

5 展望

ATMT轉(zhuǎn)化技術(shù)是一種可以應(yīng)用于植物和真菌分子生物學(xué)的工具，但是我們對轉(zhuǎn)化寄主方面的了解甚少。例如，研究表明一組含129個(gè)擬南芥突變體庫中的所有突變體對轉(zhuǎn)化是有抵抗作用的[37]。然而，就分子工具和全基因組范圍內(nèi)可供研究的資源而言，真菌超過了其他所有的真核生物，因此可以作為理想的寄主用于研究真核細(xì)胞與細(xì)菌相互作用中寄主方面的角色。最近研究進(jìn)展已經(jīng)描述了T-DNA轉(zhuǎn)移和插入過程[38]。選擇真菌作為寄主能夠洞察提高轉(zhuǎn)化效率的方法以及T-DNA的插入機(jī)制。釀酒酵母突變體曾被用于鑒定那些影響轉(zhuǎn)化效率的因素[39-44]，有一個(gè)發(fā)現(xiàn)是嘌呤濃度和生物合成也與植物上的轉(zhuǎn)化效率有關(guān)[45]。因此，研究其他物種基因缺失庫，例如，S. pombe或正在進(jìn)行的N. crassa或C. neoformans研究項(xiàng)目，都是為了尋找抗轉(zhuǎn)化菌株。在多個(gè)物種中探索轉(zhuǎn)化需要的真核基因是因?yàn)椴煌恼婢嬖诿黠@的差別，如在C. neoformans中采用ATMT技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)化是不可能的，而在其他擔(dān)子菌中則可以，又如釀酒酵母中嘌呤對轉(zhuǎn)化效率的影響同時(shí)依賴于嘌呤合成基因以及酵母菌株[45]。如果這些信息可以借鑒到植物上用于解釋為什么有的植物種類采用這種方法很難轉(zhuǎn)化，那么這個(gè)研究方向?qū)⒖赡墚a(chǎn)生廣泛影響。與轉(zhuǎn)化相關(guān)的另一因素是根癌農(nóng)桿菌本身，當(dāng)前研究表明不同根癌農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)化效率不同。然而，很少有人在T-DNA插入偏好性以及基因靶向效應(yīng)方面對菌株進(jìn)行一一研究。

目前，鑒定T-DNA插入的基因依舊是個(gè)限速步驟。在鑒定插入基因方面，基因組測序比PCR或其他方法成本更高。實(shí)際上，下一代測序已經(jīng)被應(yīng)用于鑒定突變的基因。對L. maculans而言，識別插入基因很困難，對4個(gè)菌株分別進(jìn)行測序以鑒別 T-DNA插入位點(diǎn)[46]。另一種方法被應(yīng)用于C. neoformans突變體插入基因的鑒定，即對突變體DNA池同時(shí)測序，然后單個(gè)菌株中被影響的基因采用特異PCRs進(jìn)行鑒定[47-48]。將來結(jié)合標(biāo)簽、條形碼、非對稱限制性內(nèi)切酶及可利用的下一代測序能力，對插入基因的鑒定將變得更加容易。

植物中有許多報(bào)道稱共轉(zhuǎn)化可同時(shí)引入多種 T-DNA的插入[49]，然而在真菌中這個(gè)轉(zhuǎn)化方法并不常見[50]。這種方法允許轉(zhuǎn)化各自不同的 T-DNA 片段，與曾在真菌中應(yīng)用的非常成功的雙向的或split-marker的能增強(qiáng)靶標(biāo)基因敲除的方法相似[29]。將來對其進(jìn)一步改進(jìn)可能會加強(qiáng)真菌中靶標(biāo)基因敲除的能力[51-52]。

生物研究領(lǐng)域新興的一個(gè)激動人心的研究技術(shù)是CRISPR/Cas基因編輯系統(tǒng)，正如ATMT技術(shù)在過去20年中的角色一樣，這種技術(shù)將革命性地改變真菌生物學(xué)研究。如同應(yīng)用于釀酒酵母的ATMT技術(shù)，行之有效的真菌CRISPR/Cas技術(shù)將很可能革命性地降低這些物種帶來的挑戰(zhàn)，特別是低拷貝物種中的基因敲除。值得提出的是，ATMT技術(shù)將依舊是許多真菌用于轉(zhuǎn)化CRISPR/Cas結(jié)構(gòu)的輔助工具。真菌中還沒有開發(fā)的ATMT技術(shù)的另一個(gè)應(yīng)用是瞬時(shí)轉(zhuǎn)化。植物中有一種常規(guī)的方法可以引入CRISPR/Cas結(jié)構(gòu)，如病毒侵染性克隆[53]，但是目前對真菌病毒操作困難，也許將來可以在真菌中使用類似的方法。也可以開發(fā)瞬時(shí)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)用于其他目的，如CRISPR/Cas，這就可以規(guī)避將 T-DNA 整合到基因組以及引起脫靶突變的可能。目前，已經(jīng)通過使用不穩(wěn)定的自主質(zhì)粒將CRISPR/Cas系統(tǒng)成功地轉(zhuǎn)入子囊菌和U. maydis的原生質(zhì)體[54-56]。很顯然，存在一種可能，即未來可以繼續(xù)開發(fā)利用ATMT技術(shù)，但可能須要修改那些促使 T-DNA 插入真菌基因組的原件。

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