正交試驗(yàn)優(yōu)化黑果腺肋花楸果實(shí)中綠原酸提取工藝研究

吳 鵬，史 銳，鄒長(zhǎng)鑫，劉苗苗

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110000)

黑果腺肋花楸(Aroniamelanocarpa)，又稱(chēng)野櫻莓、不老莓，屬于薔薇科腺肋花楸屬植物，果實(shí)為紫黑色圓形小漿果，富含蛋白質(zhì)、糖類(lèi)、有機(jī)酸、微量元素、多酚類(lèi)化合物等，其中黃酮，花青素、原花青素和酚酸等多酚類(lèi)物質(zhì)發(fā)揮著最主要的生理活性[1]，具有極強(qiáng)的清除自由基的能力，此外還可以調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，有效預(yù)防和治療糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化等[2-3]。

綠原酸屬于酚類(lèi)化合物，具有抗菌、抗病毒、保肝利膽等多種藥理作用[4]，被稱(chēng)為第七大營(yíng)養(yǎng)素[5]。因綠原酸所具有的獨(dú)特生物活性，其已經(jīng)廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域[6-7]。但國(guó)內(nèi)對(duì)黑果腺肋花楸中綠原酸含量的相關(guān)研究較少，且關(guān)于其含量測(cè)定方法的介紹并不詳細(xì)。本實(shí)驗(yàn)采用超聲法提取黑果腺肋花楸果實(shí)中的綠原酸，并在料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、提取溫度單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化其提取工藝，為黑果腺肋花楸果實(shí)的開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

黑果腺肋花楸果實(shí)(遼寧華嵿農(nóng)業(yè)科技有限公司)；綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品(北京索萊寶試劑有限公司)；甲醇、無(wú)水乙醇、鹽酸均為國(guó)產(chǎn)分析純。

UV5100紫外可見(jiàn)-分光光度計(jì)；KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器；精密分析天平；FW100高速萬(wàn)能粉碎機(jī)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 原料前處理

于-80 ℃冰箱中取出黑果腺肋花楸果實(shí)，蒸餾水解凍過(guò)夜，45 ℃烘干，打粉過(guò)五號(hào)篩備用。

2.2 黑果腺肋花楸果實(shí)中綠原酸樣品制備

精密稱(chēng)取黑果腺肋花楸果實(shí)粗粉1 g，精密加入25 mL 60%乙醇-鹽酸溶液，稱(chēng)重，45 ℃條件下超聲提取60 min，放冷，加相應(yīng)溶劑補(bǔ)足重量，搖勻抽濾，得待測(cè)樣品粗提液。

2.3 黑果腺肋花楸果實(shí)中綠原酸含量測(cè)定

2.3.1 波長(zhǎng)掃描 精密吸取一定量待測(cè)樣品提取液，采用紫外分光光度計(jì)在200～800 nm范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，確定綠原酸的最大吸收波長(zhǎng)為297 nm。

2.3.2 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制精密稱(chēng)取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品0.003 g，采用甲醇-鹽酸溶液定容至100 mL容量瓶中，分別精密吸取0、0.06、0.12、0.18、0.24、0.30、0.36、0.42 mL母液定容至10 mL容量瓶。在波長(zhǎng)297 nm處測(cè)定不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度(A)值，以綠原酸質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3.3 綠原酸含量測(cè)定 移液槍吸取一定量待測(cè)液，用對(duì)應(yīng)溶劑定容至10 mL容量瓶，在297 nm處測(cè)定待測(cè)液吸光度，根據(jù)回歸方程求出提取液中的綠原酸質(zhì)量濃度(μg/mL)。

2.3.4 綠原酸提取率計(jì)算

綠原酸提取率=(V·C·D×10-6)/M×100%

(1)

式中V：提取液定容體積，mL；C：標(biāo)曲求得綠原酸濃度，μg/mL；D：提取液稀釋倍數(shù)；M：黑果腺肋花楸果實(shí)樣品質(zhì)量，g。

2.4 黑果腺肋花楸果實(shí)中綠原酸提取率的單因素考察

精密稱(chēng)取1.0 g黑果腺肋花楸果實(shí)粉末，對(duì)提取溶劑、乙醇分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時(shí)間、料液比進(jìn)行考察，按照“2.3.3”“2.3.4”項(xiàng)下方法計(jì)算綠原酸含量及提取率，確定最佳提取條件。

3 結(jié)果與分析

3.1 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

線性回歸方程為y=0.08x-0.011(r=0.999 6)，其中x為綠原酸質(zhì)量濃度，y為吸光度值，由圖1可知綠原酸在1.8～12.6 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與其吸光度值具有良好的線性關(guān)系。

圖1綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.2 單因素對(duì)黑果腺肋花楸果實(shí)中綠原酸提取率的影響

3.2.1 溶劑對(duì)綠原酸提取率的影響圖2顯示，與水提法相比，乙醇提取法對(duì)黑果腺肋花楸果實(shí)中綠原酸提取率影響顯著，綠原酸提取率從0.448%提高到0.592%。這是由于綠原酸在酸性介質(zhì)中表現(xiàn)出較強(qiáng)的穩(wěn)定性，然而酸性過(guò)高會(huì)導(dǎo)致其他雜質(zhì)有機(jī)鹽被酸化溶出，故本實(shí)驗(yàn)在2種溶劑中分別加入0.2 mol/L鹽酸溶液。此外，初期對(duì)不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶劑進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇對(duì)綠原酸提取率較大影響。因此需要進(jìn)一步對(duì)不同乙醇體積分?jǐn)?shù)進(jìn)行考察。

圖2不同提取溶劑對(duì)綠原酸得率的影響

3.2.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)綠原酸提取率的影響 圖3顯示，乙醇體積分?jǐn)?shù)越高，綠原酸提取率越高，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，綠原酸提取率達(dá)到最大，為0.938%，而后出現(xiàn)下降現(xiàn)象。這是由于綠原酸的極性偏大，高濃度的乙醇不易使其溶解，致使過(guò)多脂溶性雜質(zhì)溶出，影響綠原酸提取率。

圖3乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)綠原酸提取率的影響

3.2.3 料液比對(duì)黑果腺肋花楸果實(shí)中綠原酸提取率的影響 圖4顯示，隨著料液比的增加，綠原酸提取率逐漸從0.837%提高至0.908%，在1∶45(g/mL)達(dá)到最大，而后隨著料液比的增加，綠原酸提取率下降至0.769%。這是由于在一定范圍內(nèi)溶劑越多，樣品與原料接觸更充分，傳質(zhì)作用越強(qiáng)，綠原酸提取率增大，但溶劑過(guò)多會(huì)致使醇溶性蛋白等雜質(zhì)溶出，影響綠原酸提取率。

3.2.4 提取溫度對(duì)綠原酸提取率的影響圖5顯示，隨著溫度的升高，綠原酸提取率逐漸升高，在55 ℃時(shí)達(dá)到最大，為1.064%。當(dāng)溫度達(dá)到60 ℃時(shí)，綠原酸提取率有所下降。因這是由于溫度升高會(huì)發(fā)生分子的熱運(yùn)動(dòng)現(xiàn)象，分子的動(dòng)能增加，可促進(jìn)分子運(yùn)動(dòng)與物質(zhì)交換。但溫度過(guò)高會(huì)致使綠原酸部分分解，影響綠原酸提取率。

圖4料液比對(duì)綠原酸提取率的影響

圖5提取溫度對(duì)綠原酸提取率的影響

3.2.5 提取時(shí)間對(duì)綠原酸提取率的影響圖6顯示，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，黑果腺肋花楸果實(shí)中綠原酸提取率從0.890%逐漸提高到0.981%，但提取時(shí)間達(dá)到75 min后，提取率有所下降。這是由于超聲時(shí)間短，綠原酸未完全溶出，而超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，脂溶性雜質(zhì)溶出增多，可吸附些許綠原酸，此外還可能發(fā)生熱效應(yīng)，致使部分綠原酸分解，影響提取率。

圖6提取時(shí)間對(duì)綠原酸提取率的影響

3.3 黑果腺肋花楸果實(shí)中綠原酸提取工藝條件的優(yōu)化

3.3.1 提取各因素水平的建立 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定乙醇濃度、溫度、料液比及超聲時(shí)間為主要的影響因素，每個(gè)因素設(shè)置3個(gè)水平。以黑果腺肋花楸綠原酸提取率為指標(biāo)，采用L9(34)正交試驗(yàn)篩選最佳的提取工藝，設(shè)計(jì)的正交試驗(yàn)各因素水平范圍見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)各因素水平設(shè)計(jì)

3.3.2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析 按照上述設(shè)計(jì)的因素水平依次進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果表中R值顯示，影響黑果腺肋花楸果實(shí)中綠原酸提取率的因素順序?yàn)橐掖挤謹(jǐn)?shù)>提取溫度>提取時(shí)間>料液比。K值顯示，提取最優(yōu)組合為A2B1C1D2，即乙醇分?jǐn)?shù)60%，料液比1∶40(g/mL)，提取溫度55 ℃，提取時(shí)間60 min。進(jìn)行3次驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，測(cè)得綠原酸平均含量為12.13 mg/g，平均提取率為1.187%，RSD為0.07%，與正交表內(nèi)結(jié)果相比，可確定此工藝為最優(yōu)提取工藝，且重復(fù)性好，穩(wěn)定性高。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)確定的黑果腺肋花楸果實(shí)中綠原酸的最佳提取工藝為乙醇分?jǐn)?shù)60%，料液比1∶40(g/mL)，提取溫度55 ℃，提取時(shí)間60 min，在此提取工藝下進(jìn)行3次驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，測(cè)得綠原酸平均含量為12.13 mg/g，平均提取率為1.187%，相較王鵬等[8]報(bào)道的綠原酸含量有明顯升高。本研究結(jié)果表明，以60%乙醇加酸性介質(zhì)為溶劑，運(yùn)用超聲法提取能有效提高黑果腺肋花楸果實(shí)中綠原酸的提取率，為黑果腺肋花楸的進(jìn)一步研究與開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。