不同產(chǎn)地胡蘆巴標準湯劑制備及UPLC特征圖譜研究

吳 琴，鄭傳奎，李文兵，胡昌江，張彩虹

(四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展有限公司，四川 成都 611900)

胡蘆巴，又名蕓香草、香豆草，為一年生豆科草本植物，為豆科植物胡蘆巴Trigonellafoenum-graecumL.的干燥成熟種子，喜陰、耐寒，在我國分布于東北、西南及河北、陜西、甘肅、新疆、山東、江蘇、安徽、浙江、河南、湖北、廣西等地。胡蘆巴具有溫腎助陽、祛寒止痛的功效，常用于治療腎臟虛冷、小腹冷痛、小腸疝氣、寒濕腳氣等[1-2]。胡蘆巴中含有甾體皂苷類、黃酮類、三萜類、生物堿類、香豆素類、油脂類等[4-9]化合物，具有抗腫瘤[10]、抗氧化應激[11]、補腎壯陽、保護重要器官[12]等作用；同時胡蘆巴中的纖維及甾體皂苷類成分還分別具有降血糖、降血脂作用[13]。

標準湯劑作為衡量中藥配方顆粒與臨床湯劑是否基本一致的基準物質(zhì)，其質(zhì)量控制是中藥配方顆粒質(zhì)量標準建立的重要一環(huán)。在前期文獻[14-15]調(diào)研中發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地胡蘆巴藥材中所含成分種類及活性成分含量都存在著一定差異。這種由于原料差異而導致的藥材質(zhì)量不統(tǒng)一，不僅會間接影響著中藥配方顆粒的質(zhì)量穩(wěn)定，還會對臨床上用藥的準確性造成干擾。因此，為減少藥材產(chǎn)地帶來的質(zhì)量差異，本研究對4個不同產(chǎn)地的24批胡蘆巴飲片進行標準湯劑制備及特征圖譜研究，分析比較各個產(chǎn)地的胡蘆巴質(zhì)量差異，旨在鑒別胡蘆巴產(chǎn)地和更好地控制胡蘆巴標準湯劑及其配方顆粒的質(zhì)量穩(wěn)定，為不同產(chǎn)地胡蘆巴標準湯劑的質(zhì)量標準建立提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters Acquity H-class型超高效液相色譜儀(美國Waters科技有限公司)；Agilent 1260型高效液相色譜(HPLC)儀(美國安捷倫科技有限公司)；電子分析天平ME204E/02、MS205DU、XP26(梅特勒-托利多儀器有限公司)；超純水機細胞型1810A(上海摩勒科學儀器有限公司)；超聲波清洗器KQ5200DB型(600W，40kHz，昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 材料

牡荊素對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：111687-201704，純度：94.9%)；異葒草苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：111974-201401，純度：94.0%)；胡蘆巴堿對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110883-201604，純度：78.4%)；24批胡蘆巴標準湯劑(四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展有限公司)；乙腈、甲醇(色譜純，西格瑪奧德里奇上海貿(mào)易有限公司)；冰乙酸(色譜純，成都市科隆化學試劑有限公司)；甲醇(分析純，成都市科隆化學試劑有限公司)；水為超純水。24批藥材、飲片及標準湯劑信息見表1。

表1 24批胡蘆巴飲片產(chǎn)地信息

2 方法

2.1 標準湯劑制備

取胡蘆巴飲片100 g，加水煎煮2次，一煎加10倍水，浸泡30 min，煮沸，保持微沸煎煮60 min，200目篩網(wǎng)過濾，立即冷卻至室溫；二煎加8倍水，煮沸，保持微沸煎煮40 min，200目篩網(wǎng)過濾，合并兩次水煎液，立即冷卻至室溫，濃縮、冷凍干燥，分裝，即得。

2.2 胡蘆巴堿含量測定

2.2.1 色譜條件 采用Waters Acquity H-class型超高效液相色譜儀，Agilent5 Tc-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以甲醇-0.05%十二烷基磺酸鈉溶液-冰醋酸(20∶80∶0.1)為流動相等度洗脫，檢測波長為265 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫為25 ℃，進樣量為10 μL。

2.2.2 溶液制備 (1)供試品溶液制備：取本品粉末(過三號篩)約0.2 g，精密稱定，精密加入50%甲醇50 mL，密塞，稱定重量，放置1 h，超聲處理(功率300 W，頻率50 kHz)45 min，放冷，密塞，再稱定重量，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

(2)對照品溶液制備：取胡蘆巴堿對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1 mL含60.0 μg胡蘆巴堿的溶液，即得。

2.2.3 方法學考察(1)線性關系：取胡蘆巴堿對照品溶液母液(59.68 μg/mL)，分別精密吸取對照品溶液2 μL、5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、30 μL注入液相色譜儀，分析得到峰面積積分。以進樣量(X，μg)為橫坐標，峰面積積分(Y)為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程為y=2E+06x+29880(R2=0.999)，可知胡蘆巴標準湯劑線性范圍為0.119 4～1.790 4 μg。

(2)精密度。取同一份胡蘆巴堿對照品溶液，按照“2.2.1”項下條件連續(xù)進樣6次，記錄胡蘆巴堿的峰面積，計算RSD值，結(jié)果RSD=0.42%<2.0%，說明該液相色譜儀的精密度良好。

(3)重復性。取供試品(批號：HLBBT180723)0.2 g，精密稱定6份，由同一操作人員按照“2.2.2”項下的方法制成供試品溶液，按照“2.2.1”項下條件進樣，計算6份供試品中胡蘆巴堿的含量，結(jié)果RSD=1.41%<2.0%，表明本方法重復性良好。

(4)穩(wěn)定性實驗。取同一供試品溶液(批號：HLBBT1-80723)，分別于放置0 h、4 h、6 h、10 h、14 h、18 h、24 h后進樣測定胡蘆巴堿的峰面積。結(jié)果表明，在本實驗條件下，胡蘆巴堿峰面積的RSD值為0.97%<2.0%，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

圖1胡蘆巴標準湯劑中胡蘆巴堿色譜

表1 加樣回收試驗結(jié)果

2.2.4 含量測定以24批胡蘆巴標準湯劑凍干粉為供試品，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，并按照“2.2.1”項下條件進樣測定，記錄峰面積，計算胡蘆巴堿的含量，結(jié)果見表3。

2.3 特征圖譜建立

2.3.1 色譜條件 采用ACQUITY UPLC HSS T3(2.1 mm×50 mm)色譜柱，以乙腈-甲醇(3∶1)為流動相A，以0.2%冰乙酸溶液為流動相B，梯度洗脫(0～34 min，A：9.5%→13%；34～55 min，A：13%→30%；55～65 min，A：30%)，檢測波長為339 nm，流速為0.3 mL/min，柱溫為25 ℃，進樣量為1 μL。

2.3.2 溶液制備(1)供試品溶液制備。取本品約0.2 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率600 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

(2)參照物溶液制備。取牡荊素、異葒草苷對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1 mL含牡荊素30.0 μg、異葒草苷15.0 μg的溶液，即得。

2.3.3 方法學考察 (1)精密度。取胡蘆巴標準湯劑(批號：HLBBT180723)凍干粉粉末，按照“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，按照“2.3.1”項下方法連續(xù)進樣6次，計算各特征峰的相對保留時間及相對峰面積。結(jié)果各特征峰相對保留時間的RSD在0.16%～2.16%之間，特征峰相對峰面積的RSD在1.92%～4.92%之間，表明該儀器精密度良好。

(2)重復性。取胡蘆巴標準湯劑(批號：HLBBT180723)凍干粉粉末，按照“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，按照“2.3.1”項下方法進樣測定，計算各特征峰的相對保留時間及相對峰面積。結(jié)果各特征峰相對保留時間的RSD在0.11%～0.60%之間，特征峰相對峰面積的RSD在1.48%～8.07%之間，表明該方法重復性良好。

(3)穩(wěn)定性考察。取胡蘆巴標準湯劑(批號：HLBBT1-80723)凍干粉粉末，按照“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，分別于放置0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、24 h時按照“2.3.1”項下方法進樣測定。結(jié)果相對應的特征峰相對保留時間的RSD在0.24%～2.58%之間，特征峰相對峰面積的RSD為0.81%～9.25%，說明樣品溶液在24 h內(nèi)較穩(wěn)定。

(4)特征圖譜建立及相似度評價。取24批不同產(chǎn)地的胡蘆巴標準湯劑粉末，按照“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，按照“2.3.1”項下方法進樣測定。采用中藥色譜特征圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版)軟件對24批樣品進行特征圖譜分析，計算相對保留時間、相對峰面積比值及相似度。

3 結(jié)果

3.1 含量測定結(jié)果

按擬定的方法對24批胡蘆巴標準湯劑中胡蘆巴堿的含量進行測定，結(jié)果見表3。4個產(chǎn)地胡蘆巴標準湯劑中胡蘆巴堿的含量范圍為1.58%～2.12%，平均含量為1.85%。通過計算不同產(chǎn)地批次胡蘆巴中胡蘆巴堿含量的平均值可知，4個產(chǎn)地胡蘆巴標準湯劑中胡蘆巴堿含量并無明顯差異。

3.2 特征圖譜分析

利用中藥色譜特征圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版)軟件對24批標準湯劑樣品進行匹配，根據(jù)相對保留時間穩(wěn)定及各批次樣品均能檢出峰且該峰相對較高的原則，共標定了10個重復性較好的峰作為特征共有峰，其相似度均大于0.95，結(jié)果見表4、表5。經(jīng)過與對照品進行指認，確認2個峰，即峰10為異葒草苷，峰13為牡荊素，如圖2所示。24批樣品的特征圖譜及其對照圖譜見圖3和圖4，相對保留時間及其相對峰面積見表6和表7。

表3 24批胡蘆巴標準湯劑含量測定結(jié)果

10-異葒草苷；13-牡荊素

圖3 胡蘆巴標準湯劑特征圖譜

圖4 胡蘆巴標準湯劑對照特征圖譜

表4 2批樣品相似度評價結(jié)果

表5 12批樣品相似度評價結(jié)果

續(xù)表5

樣品相似度S13S14S15S16S17S18S19S20S21S22S23S24S180.9910.9900.9910.9921.0001.0001.0000.9991.0001.0001.0001.000S190.9910.9900.9910.9921.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.000S200.9920.9920.9930.9931.0000.9991.0001.0001.0000.9990.9991.000S210.9920.9920.9920.9931.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.000S220.9900.9900.9900.9911.0001.0001.0000.9991.0001.0001.0001.000S230.9890.9890.9890.9901.0001.0001.0000.9991.0001.0001.0001.000S240.9910.9900.9910.9921.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.000R0.9590.9590.9590.9610.9830.9850.9830.9800.9810.9840.9860.984

表6 24批胡蘆巴標準湯劑相對保留時間

表7 24批胡蘆巴標準湯劑相對峰面積

續(xù)表7

批號峰5峰6峰8峰9峰10峰11峰13(s)峰14峰23峰24S230.141.060.611.221.780.531.001.190.470.17S240.131.020.601.191.740.471.001.150.460.15平均值0.110.620.591.081.520.491.001.170.320.12RSD(%)20.2672.8939.3043.8141.9530.09/2.0543.5926.39

通過對不同產(chǎn)地胡蘆巴標準湯劑特征圖譜進行對比分析發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地胡蘆巴藥材制備的對應標準湯劑所含化學成分差異較大，其中四川、安徽產(chǎn)地的胡蘆巴標準湯劑化學成分一致，甘肅、河北產(chǎn)地的胡蘆巴標準湯劑化學成分一致。除標定的峰5、峰6、峰8～峰11及峰13、峰14、峰23、峰24等10個共有峰之外，共計差異性成分峰11個，其中峰1～峰4，峰7、峰12、峰16等7個峰只存在于甘肅、河北產(chǎn)地的胡蘆巴中，而峰15，峰17～峰19等4個峰也僅存在于四川、安徽兩地的胡蘆巴中，且部分峰的峰面積差異較大(如峰20、峰22等)，推測其相應的含量也存在一定差異。這可能與文獻[14]報道的“由于產(chǎn)地的土壤、氣候、海拔、植物生境等條件不同，使胡蘆巴植物次生代謝過程存在一定差異，導致其不同產(chǎn)地胡蘆巴藥材化學成分不一致”的結(jié)果相同。

4 討論

中藥特征圖譜在中藥質(zhì)量控制中占有重要地位，其能較全面地反映胡蘆巴標準湯劑中的化學成分信息，通過對這些信息進行分析，可以對樣本質(zhì)量進行整體評估，該方法已成為研究中藥標準湯劑以及中藥配方顆粒的主要途徑。

在本研究初期，筆者對流動相[甲醇-0.1%甲酸，乙腈-0.1%甲酸，乙腈-甲醇(3∶1)-0.1%甲酸、乙腈-甲醇(3∶1)-0.2%冰乙酸，乙腈-甲醇(3∶1)-0.1%磷酸，乙腈-甲醇(3∶1)-0.1%冰乙酸]，波長(360 nm、280 nm、254 nm、300 nm、339 nm)，柱溫(25、30、35、40 ℃)，流速(0.20 mL/min、0.27 mL/min、0.30 mL/min、0.32 mL/min、0.40 mL/min)等色譜條件進行了考察。結(jié)果表明，以乙腈-甲醇(3∶1)-0.2%冰乙酸為流動相，在波長339 nm、柱溫25 ℃、流速0.3 mL/min的條件下進行梯度洗脫時，供試品中色譜圖的基線較穩(wěn)且色譜峰的峰形、分離度均較好。在同一色譜條件下，對供試品溶液制備中的不同提取溶劑(水、50%甲醇、甲醇)和不同提取方式(超聲、回流)進行考察。結(jié)果表明，50%甲醇作為提取溶劑時，所得色譜圖的峰面積較大，分離度良好；回流和超聲提取效果相差不大，為方便操作，選擇超聲作為胡蘆巴標準湯劑的提取方式。

本文參考2015版《中國藥典》，選擇胡蘆巴堿作為胡蘆巴標準湯劑的指標成分。結(jié)果顯示，不同產(chǎn)區(qū)的胡蘆巴標準湯劑中胡蘆巴堿含量相差不大，范圍在1.58%～2.12%之間。同時，結(jié)合UPLC特征圖譜分析得知，24批次不同產(chǎn)地的胡蘆巴標準湯劑中所含化學成分既有相似性，也有差異性。在同一色譜條件下，共標定共有峰10個，其中四川、安徽兩產(chǎn)地與甘肅、河北產(chǎn)地的胡蘆巴標準湯劑中差異性成分共計11個。通過建立UPLC特征圖譜可快速、直觀、有效地鑒別出胡蘆巴的產(chǎn)區(qū)，結(jié)合指標成分定量研究，為胡蘆巴標準湯劑的內(nèi)在質(zhì)量控制提供了參考依據(jù)，同時為建立胡蘆巴配方顆粒的質(zhì)量標準提供了更加全面的研究思路。然而，為能更系統(tǒng)地辨別不同產(chǎn)區(qū)胡蘆巴的質(zhì)量差異，還需對其差異性成分峰進行進一步的指認和含量測定研究。