葛根素對人肺癌A549細(xì)胞株遷移與侵襲的作用及分子機(jī)制研究

徐正馨，白靜慧

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽 110000；2.遼寧省腫瘤醫(yī)院，遼寧 沈陽 110000)

在全球范圍內(nèi)，肺癌是各種癌癥類型中發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤[1]。即使有各種醫(yī)治方法不斷涌現(xiàn)，肺癌的總體生存率表現(xiàn)仍不樂觀[1-2]。常規(guī)放化療和靶向治療等會不可避免地導(dǎo)致毒副反應(yīng)和耐藥性等一系列問題，此時毒副作用小的天然中藥抗腫瘤成分成功吸引了人們的關(guān)注。葛根素是一種從中藥材野葛根中提取出來的異黃酮類化合物，具有降壓、降糖、抗骨質(zhì)疏松、抗氧化、抗炎、抗癌等多種活性[3]。大量實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)葛根素對多種癌癥均有一定治療效果。有研究[4-6]指出葛根素對人肺癌A549細(xì)胞的增殖和凋亡有明顯抑制效果，但其對人肺癌A549細(xì)胞的遷移及侵襲作用尚未有研究。因此本研究將初步探索葛根素對人肺癌A549細(xì)胞遷移和侵襲力的影響，以期為葛根素對肺癌的治療作用提供更多依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

人肺癌A549細(xì)胞株由遼寧省腫瘤醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室惠贈；胎牛血清(FBS)、青霉素、鏈霉素及RPMI1640培養(yǎng)基購于美國Gibco公司；CCK-8試劑購于蘇州宇恒生物科技有限公司；ELISA、Transwell試劑盒購于美國Corning公司；葛根素購于美國Sigma公司，DMSO溶解，制備成100 mmol/L的葛根素原液，無血清培養(yǎng)基稀釋成實(shí)驗(yàn)所需濃度，過濾，-20 ℃儲存。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

采用含10% FBS、100 U/mL青霉素和100 g/L鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基，在37 ℃恒溫孵箱中培養(yǎng)A549細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞處于對數(shù)生長期時，胰酶消化，傳代，繼續(xù)培養(yǎng)。設(shè)置陰性對照組，僅為細(xì)胞混懸液，不加葛根素處理。葛根素組加入不同濃度(5、10、20 μmol/L)的葛根素溶液，每組設(shè)5個復(fù)孔。

1.3 CCk-8檢測葛根素對人肺癌A549細(xì)胞增殖活力的影響

將5×104個/mL人肺癌A549單細(xì)胞混懸液以100 μL/孔的濃度均勻接種于96孔板，24 h后細(xì)胞貼壁，加入不同劑量的葛根素溶液(5、10、20 μmol/L)，分別處理24 h、48 h及72 h。培養(yǎng)結(jié)束后，陰性對照及葛根素組每孔加入100 μL含0.1%血清的RPMI1640培養(yǎng)基稀釋后的CCK-8溶液，終濃度為10%，37 ℃條件下避光反應(yīng)1.5 h后，在酶標(biāo)儀450 nm處測其OD值，采用細(xì)胞增殖抑制率公式：(陰性對照組OD值-加藥組OD值)/(陰性對照組OD值-空白對照組OD值)×100%，計算細(xì)胞增殖情況。

1.4 Transwell法檢測葛根素對人肺癌A549細(xì)胞遷移能力的影響

常規(guī)培養(yǎng)A549細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后，棄舊培養(yǎng)基，加葛根素溶液(5、10、20 μmol/L)，處理24 h，胰酶消化，用不含血清的培養(yǎng)基重懸成的(1×105個/mL)單細(xì)胞懸液，接種于上層小室，200 μL/孔，小室下層加含胎牛血清的600 μL完全培養(yǎng)基，37 ℃下培養(yǎng)24 h。甲醛固定15 min，HE染色15 min，采用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞遷移情況，計算細(xì)胞遷移率，遷移率=實(shí)驗(yàn)組/對照組×100%，結(jié)果以細(xì)胞遷移率(%)表示。

1.5 Transwell檢測葛根素對人肺癌A549細(xì)胞侵襲能力的影響

準(zhǔn)備包被好Matrigel基質(zhì)膠的transwell小室，在貼壁細(xì)胞中，分別加5、10、20 μmol/L葛根素溶液，干預(yù)24 h，胰酶消化，用不含血清的培養(yǎng)基制備A549單細(xì)胞懸液，3×105個/mL，200μL/孔加入上層小室，下層小室為600 μL含血清的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，用棉簽輕輕擦去上室聚碳酸酯膜內(nèi)側(cè)面細(xì)胞，用PBS清洗2次，甲醛固定15 min，HE染色，倒置顯微鏡觀察侵襲情況，侵襲率=實(shí)驗(yàn)組/對照組×100%(%)。

1.6 ELISA法檢測葛根素對人肺癌A549細(xì)胞炎性因子表達(dá)水平的影響

收集侵襲實(shí)驗(yàn)中小室上層的細(xì)胞上清液，按照ELISA試劑盒說明，對人肺癌A549細(xì)胞炎性細(xì)胞因子IL-6、TNF-α與炎癥趨化因子MCP-1、TGF-β的表達(dá)情況進(jìn)行檢測。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 葛根素對人肺癌A549細(xì)胞增殖活力的影響

采用CCK-8法檢測不同濃度葛根素溶液(5、10、20μmol/L)處理A549細(xì)胞24、48、72 h后人肺癌A549細(xì)胞的增殖活力。結(jié)果顯示葛根素抑制了人肺癌A549細(xì)胞的增殖，在時間和劑量上存在交互作用，F(xiàn)=28.620，P<0.05。劑量和時間的F值分別為F=603.605，P<0.05；F=461.129，P<0.05。結(jié)果見表1和圖1。為觀察葛根素對人肺癌A549細(xì)胞遷移和侵襲力的影響，選用24 h，濃度為0、5、10、20 μmol/L的葛根素對人肺癌A549細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)。

組別24h48h72h陰性對照組000葛根素5μmol /L組8.86±1.06①15.78±1.72①26.18±1.79①葛根素10μmol /L組15.10±1.62①②27.68±2.10②③44.06±2.92②③葛根素20μmol /L組23.74±2.2①②③44.36±3.42①②65.06±5.46①②

注：①與對照組比較，②與葛根素5 μmol/L組比較，③與10 μmol/L組比較，P<0.05。

圖1葛根素對人肺癌A549細(xì)胞增殖抑制率的影響

2.2 葛根素對人肺癌A549細(xì)胞遷移率的影響

細(xì)胞遷移是腫瘤進(jìn)展的重要原因，通過細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)，本研究發(fā)現(xiàn)不同濃度葛根素(5、10、20 μmol/L)干預(yù)24 h后，與陰性對照組比較，明顯降低了人肺癌A549細(xì)胞的遷移率(P<0.05)，并呈現(xiàn)劑量依賴性，見圖2。

2.3 葛根素對人肺癌A549細(xì)胞侵襲力的影響

為了進(jìn)一步觀察葛根素對人肺癌A549細(xì)胞侵襲能力的影響，采用transwell法進(jìn)行侵襲實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示葛根素(5、10、20 μmol /L)干預(yù)24 h后，與陰性對照組(0 μmol /L)比較，顯著抑制了人肺癌A549細(xì)胞侵襲率(P<0.05)，見圖3。

2.4 葛根素對人肺癌A549細(xì)胞炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響

采用ELISA法檢測不同濃度葛根素(5、10、20 μmol/L)干預(yù)人肺癌A549細(xì)胞24 h后細(xì)胞炎性因子的表達(dá)情況。結(jié)果表明，與對照組比較，不同濃度葛根素作用的肺癌A549細(xì)胞炎性細(xì)胞因子IL-6、TNF-α與炎癥趨化因子MCP-1、TGF-β的表達(dá)情況均明顯下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

注：與陰性對照組比較，**P圖3葛根素對人肺癌A549細(xì)胞侵襲的影響

組別TGF-βMCP-1 TNF-αIL-6陰性對照組85.23±9.1471.26±8.71364.78±18.56231.24±13.72 葛根素5μmol /L組75.46±8.27①60.53±6.57① 315.16±14.21①190.31±10.14①葛根素10μmol /L組58.62±6.37①②47.48±5.19①②253.36±10.34①②109.64±7.35①②葛根素20μmol /L組36.74±3.75①②③23.14±2.85①②③164.17±5.36①②③52.87±3.47①②③

注：①與對照組比較，②與葛根素5 μmol/L組比較，③與10 μmol/L組比較，P<0.05。

3 討論

傳統(tǒng)中草藥中含有多種有效成分[8-9]，其在臨床治療疾病的過程中起著極為重要的作用。黃酮類化合物是多種中藥的有效成分之一，具有多種生物學(xué)活性[10]。葛根素即是從干燥野葛根中提取出來的一種天然黃酮類化合物，臨床廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病、糖尿病、骨質(zhì)疏松癥及癌癥等多種疾病的治療[11-13]。本研究結(jié)果表明，葛根素可以抑制人肺癌A549細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲。炎癥與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，慢性炎癥可促進(jìn)癌癥的進(jìn)展[14-15]。大量研究[16-19]發(fā)現(xiàn)葛根素具有顯著抗炎活性，可通過降低炎性細(xì)胞因子、抑制炎癥趨化因子等表達(dá)治療多種疾病。炎癥相關(guān)因子在腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用[20]，為此本實(shí)驗(yàn)檢測了葛根素干預(yù)后人肺癌A549細(xì)胞炎癥相關(guān)因子的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)葛根素能顯著降低人肺癌A549細(xì)胞IL-6、TNF-α、MCP-1、TGF-β的表達(dá)水平，表明其對人肺癌A549細(xì)胞增殖、遷移與侵襲的抑制作用可能與下調(diào)炎癥相關(guān)因子表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)初步闡明葛根素可以通過其抗炎作用下調(diào)炎癥相關(guān)因子表達(dá)，進(jìn)而抑制人肺癌A549細(xì)胞的增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移。為了更深層次地探究葛根素對人肺癌A549細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移的抑制作用，今后將從基因-蛋白組學(xué)水平探究葛根素對人肺癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移及炎癥等相關(guān)基因、蛋白信號通路的影響，使其應(yīng)用于肺癌臨床治療的前景更加廣闊。