復(fù)合方法抑制整粒大豆中脂氧合酶的活性

黃雨婷，蔣肇樣，賈冬英，遲原龍，鄧 莎，姚 開

(四川大學(xué) 輕工科學(xué)與工程學(xué)院，成都 610065)

大豆制品豆腥味的產(chǎn)生主要是由于大豆加工過程中伴隨組織結(jié)構(gòu)的破壞和分子氧的存在，其中的不飽和脂肪酸發(fā)生酶促氧化降解反應(yīng)，生成了帶有異味的醇、醛、酮等小分子物質(zhì)[1]，該反應(yīng)的關(guān)鍵酶是脂氧合酶。脂氧合酶是一種含非血紅素鐵的加雙氧酶，可以催化含至少一個順,順-1,4-戊二烯結(jié)構(gòu)的多不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化反應(yīng)[2]，而大豆組織中的脂氧合酶是不會與底物發(fā)生接觸的，因此在大豆組織破碎前抑制脂氧合酶活性是避免大豆加工過程中豆腥味產(chǎn)生的有效途徑之一。

目前，抑制整粒大豆脂氧合酶活性主要采用熱處理法，如紅外法[3]、連續(xù)漂燙和超高溫處理法[4]等，但其易使大豆蛋白過度變性，嚴(yán)重影響其溶解度[5]。Kudre等[6]發(fā)現(xiàn)，60℃、氯仿和甲醇混合溶液浸泡花生粉，其脂氧合酶活性降低61.4%。單純采用有機試劑處理不能完全抑制大豆中脂氧合酶活性，加之存在水分含量升高、試劑殘留等問題，還需要對其進行干燥。相比于傳統(tǒng)的干燥方式，微波干燥的效率高，其熱效應(yīng)可進一步抑制脂氧合酶活性[7]。本文采用有機試劑蒸氣處理與微波干燥相結(jié)合的方法對整粒大豆脂氧合酶進行滅活，并評價處理后的大豆豆腥味和質(zhì)構(gòu)特性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料與試劑

大豆，黑龍江拜泉縣；亞油酸，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；考馬斯亮藍G250，成都市科龍化工試劑廠；牛血清白蛋白，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；對二氯苯(色譜純)，山東西亞化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

UV-6000PC紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國安捷倫公司；TA.XTplus物性測試儀，北京微訊超技儀器技術(shù)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 有機試劑蒸氣處理整粒大豆

分別將適量的體積分?jǐn)?shù)50%甲醇溶液、50%異丙醇溶液、5%乳酸溶液、0.1 mol/L檸檬酸溶液、氯仿-乙醇(體積比1∶1)溶液、正己烷-乙醇(體積比1∶1)溶液、乙酸乙酯-乙醇(體積比1∶1)溶液裝入容器中，將定量的整粒大豆置于上層篩網(wǎng)，加蓋并安裝冷凝管，加熱，使蒸氣通過物料，收集冷凝液，蒸氣持續(xù)處理整粒大豆30 min。

1.2.2 復(fù)合方法處理整粒大豆

將經(jīng)有機試劑蒸氣處理30 min的整粒大豆，在160 W下微波干燥4 min。

1.2.3 脂氧合酶活性測定

粗酶液制備：將20 g大豆與200 mL去離子水置于冰水浴中磨漿，100目雙層濾布過濾，4℃、8 000 r/min離心30 min，上清液即為粗酶液。

底物溶液配制：將0.1 mL亞油酸和0.1 mL吐溫20加入0.2 mol/L硼酸緩沖溶液(pH 9.0)中，定容至100 mL。

脂氧合酶活性測定[8]：用0.2 mol/L硼酸緩沖溶液(pH 9.0)稀釋底物溶液5倍。將2.0 mL底物稀釋液、0.9 mL 0.2 mol/L的硼酸緩沖溶液(pH 9.0)與0.1 mL稀釋適當(dāng)倍數(shù)的粗酶液混勻，間隔10 s測其234 nm的吸光度(A234)。將1 min內(nèi)A234增加0.001定義為一個酶活力單位(U)。按下式計算脂氧合酶相對活力。

相對活力=處理后的大豆脂氧合酶活力/未處理的大豆脂氧合酶活力×100%

1.2.4 蛋白質(zhì)溶解度測定

參照SN/T 3926—2014的考馬斯亮藍法測定大豆試樣中可溶性蛋白質(zhì)含量。參照GB 5009.5—2016中凱氏定氮法測定大豆試樣中總蛋白質(zhì)含量(蛋白質(zhì)折算系數(shù)為5.71)。按下式計算大豆試樣的蛋白質(zhì)溶解度。

蛋白質(zhì)溶解度=大豆中可溶性蛋白質(zhì)含量/大豆中總蛋白質(zhì)含量×100%

1.2.5 豆腥味成分測定

采用HS-SPME-GC-MS測定豆腥味成分。大豆試樣粉碎，過40目篩，得到大豆粉。將2 g大豆粉和3 mL去離子水置于頂空瓶中，加入10 μL質(zhì)量濃度為0.12 mg/mL的對二氯苯-甲醇溶液(內(nèi)標(biāo)物)，混勻，50℃水浴30 min，萃取頭吸附40 min，250℃解吸5 min。GC條件： SH-Rxi-5SiL MS色譜柱；升溫程序為50℃保持1 min，以10℃/min升至150℃，保持3 min，以8℃/min升至290℃，保持2 min；進樣口溫度250℃；氦氣為載氣，流速1.0 mL/min；采用不分流的進樣方式。MS條件：采用電子轟擊離子源；電離方式EI；電離電壓70 eV；電子源溫度200℃；燈絲電流150 μA；掃描質(zhì)量范圍(m/z)45～500；掃描方式為Scan。實驗結(jié)果與NIST14/NIST14s數(shù)據(jù)庫比對，并參考Lü等[9]研究結(jié)果對豆腥味成分進行確認，將其中相似程度大于80%的化合物認定為大豆試樣的豆腥味成分。

1.2.6 大豆主要化學(xué)成分測定

水分含量，參照GB 5009.3—2016的直接干燥法測定；粗蛋白含量，參照GB 5009.5—2016的凱氏定氮法測定；粗脂肪含量，參照GB 5009.6—2016的索氏抽提法測定。

1.2.7 大豆內(nèi)部空隙率測定[8]

隨機取200粒大豆，準(zhǔn)確稱其質(zhì)量。采用正己烷排積法測其體積，即將100 mL正己烷倒入量筒中，加入試樣，靜置20 s，記錄總體積。以大豆試樣的體積質(zhì)量比表征內(nèi)部空隙率。按下式計算空隙率。

空隙率=(總體積-100)/試樣質(zhì)量

1.2.8 大豆籽粒硬度測定

采用P-2N型探頭，測試前、中、后速度分別為2.0、0.5、2.0 mm/s。大豆籽粒硬度以應(yīng)力曲線最大的峰值表示。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理

采用OriginPro 2017軟件繪制圖形，使用SPSS Statistics 23.0軟件統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)，采用Duncan test進行顯著性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 有機試劑蒸氣處理對大豆脂氧合酶活性和蛋白質(zhì)溶解度的影響

熱蒸氣具有穿透力強、物料升溫快、滅酶效果好等特點。為避免大豆中蛋白質(zhì)過度變性導(dǎo)致其溶解度下降，選用低沸點的不同有機試劑對整粒大豆進行蒸氣處理，結(jié)果如圖1所示。

注：1.50%甲醇溶液；2.50%異丙醇溶液；3.5%乳酸溶液；4.0.1 mol/L檸檬酸溶液；5.氯仿-乙醇(體積比1∶1)；6.正己烷-乙醇(體積比1∶1)；7.乙酸乙酯-乙醇(體積比1∶1)。

圖1 有機試劑蒸氣處理對大豆脂氧合酶活性
和蛋白質(zhì)溶解度的影響

由圖1可見，50%甲醇或50%異丙醇溶液蒸氣處理的大豆脂氧合酶相對活力分別為36.2%和45.2%，酶活降低明顯，而氯仿-乙醇、正己烷-乙醇或乙酸乙酯-乙醇溶液蒸氣處理的大豆脂氧合酶相對活力仍然較高，均在90%以上，可以認為溶液的極性是影響酶活性的重要因素，極性較強的甲醇和異丙醇會使酶失去結(jié)合水，而弱極性的氯仿、正己烷和乙酸乙酯的影響較小[10]。5%乳酸或0.1 mol/L 檸檬酸溶液蒸氣處理的大豆脂氧合酶相對活力分別為47.6%和35.7%，其作用機理主要是改變酶活性中心的構(gòu)象或相關(guān)基團的解離狀態(tài)[11]。與空白(未處理的大豆蛋白質(zhì)溶解度為32.2%)相比，50%甲醇、50%異丙醇、5%乳酸或0.1 mol/L檸檬酸溶液蒸氣處理大豆的蛋白質(zhì)溶解度分別降低了12.4%、18.0%、15.5%和20.8%，而氯仿-乙醇、正己烷-乙醇或乙酸乙酯-乙醇溶液蒸氣處理大豆蛋白質(zhì)溶解度無顯著差異(P>0.05)?；谥鹾厦笢缁钚Ч偷鞍踪|(zhì)溶解度，選擇體積分?jǐn)?shù)50%甲醇溶液、50%異丙醇溶液、5%乳酸溶液和0.1 mol/L檸檬酸溶液進行后續(xù)研究。

2.2 復(fù)合方法處理對大豆脂氧合酶活性和蛋白質(zhì)溶解度的影響

50%甲醇、50%異丙醇、5%乳酸和0.1 mol/L檸檬酸溶液4種有機試劑溶液蒸氣處理分別與微波干燥相結(jié)合的復(fù)合法(1～4)處理結(jié)果如圖2所示。

圖2 復(fù)合方法處理對大豆脂氧合酶活性和蛋白質(zhì)溶解度的影響

由圖2可見：4種復(fù)合方法處理的大豆脂氧合酶活力降低明顯，相對活力降低98%以上；大豆蛋白質(zhì)溶解度仍可分別保留54.3%、59.3%、58.4%和66.1%。結(jié)果表明，有機試劑蒸氣處理結(jié)合微波干燥的復(fù)合處理方法對整粒大豆中脂氧合酶滅活效果明顯好于單獨有機試劑蒸氣處理。

2.3 復(fù)合方法處理對豆腥味成分的影響

豆腥味是大豆加工過程中產(chǎn)生的特殊氣味，由不飽和脂肪酸氧化降解產(chǎn)生的醇、醛、酮等物質(zhì)組成，其中己醛含量決定了大豆制品的豆腥味程度[12]。復(fù)合方法處理的大豆豆腥味成分及含量如表1所示。

表1 復(fù)合方法處理的大豆豆腥味成分及含量 μg/kg

風(fēng)味物質(zhì)氣味特征空白復(fù)合法1復(fù)合法2復(fù)合法3復(fù)合法4己醛青草味4 785.9685.8911.3392.0330.3反式-2-己烯醛青葉味219.56.213.2ndnd1-辛烯-3-醇蘑菇味1 611.1nd695.3363.1nd正己醇青葉味1 586.6198.9530.5105.4366.3正戊醇青豆味34.132.819.3nd10.7乙酸醋酸味nd4.1nd6.271.9苯甲醛苦杏仁味6.43.3nd4.46.9總計-8 243.6931.12 169.6871.1786.1

注：nd表示未檢出。

由表1可以看出，與空白相比，4種復(fù)合方法處理的大豆豆腥味成分總量顯著降低(P<0.05)，分別下降88.7%、73.7%、89.4%和90.5%，其中己醛含量極顯著降低(P<0.01)。

2.4 復(fù)合方法處理對大豆主要化學(xué)成分的影響(見表2)

大豆的安全儲藏水分含量通常控制在13%以內(nèi)[13]。由表2可以看出：4種復(fù)合方法處理的大豆水分含量均低于安全值，適宜長期儲藏；粗蛋白和粗脂肪含量略有降低。

表2 復(fù)合方法處理的大豆主要化學(xué)成分含量 %

注：同一列小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

2.5 復(fù)合方法處理對大豆質(zhì)構(gòu)特性的影響

2.5.1 大豆內(nèi)部空隙率(見圖3)

圖3 復(fù)合方法處理對大豆內(nèi)部空隙率的影響

由圖3可以看出，4種復(fù)合方法處理的大豆內(nèi)部空隙率較空白略有增加，表明復(fù)合方法處理的大豆內(nèi)部并未出現(xiàn)較大空隙，不會由于氧的進入加速其油脂氧化而影響儲藏期。

2.5.2 大豆籽粒硬度(見圖4)

圖4 復(fù)合方法處理對大豆硬度的影響

由圖4可以看出，4種復(fù)合方法處理的大豆籽粒硬度較之空白顯著下降(P<0.05)，原因是蒸氣處理過程中水分的進入導(dǎo)致了淀粉和蛋白質(zhì)的凝膠化[14]。大豆硬度的降低有利于改善大豆的加工性能，增強其吸水性，減少粉碎或磨漿過程的能量消耗和機械損傷[3]。

3 結(jié) 論

50%甲醇、50%異丙醇、5%乳酸或0.1 mol/L檸檬酸溶液蒸氣處理對整粒大豆中脂氧合酶活性均有不同程度的抑制作用，結(jié)合微波干燥可使脂氧合酶活性進一步降低98%以上。復(fù)合方法處理的大豆豆腥味成分總量降低了73%以上，其中己醛含量極顯著降低；經(jīng)復(fù)合方法處理，大豆蛋白質(zhì)溶解度仍可保留54%以上，粗蛋白和粗脂肪含量及內(nèi)部空隙率變化較小，水分含量低于安全儲藏標(biāo)準(zhǔn)，籽粒硬度顯著降低。綜合比較，0.1 mol/L檸檬酸溶液蒸氣處理與微波干燥相結(jié)合是抑制整粒大豆中脂氧合酶活性的適宜方法。