水酶法提取冬瓜籽油工藝優(yōu)化及體外抗氧化活性研究

呂秋冰，羅 霜，楊 恒，王 敏，馮友君

(1.四川旅游學(xué)院 食品學(xué)院，成都 610100； 2.四川旅游學(xué)院 信息與工程學(xué)院，成都 610100)

冬瓜(BenincasahispidaCogn)屬葫蘆科一年生草本植物，全國各地均有栽培[1]。冬瓜籽來源豐富，且其中含有維生素B1、皂苷、瓜氨酸、組氨酸、蛇麻脂醇、甘露醇等活性物質(zhì)，冬瓜籽僅少數(shù)用于醫(yī)藥，大部分被丟棄，使冬瓜加工的經(jīng)濟效益降低。冬瓜籽的油脂含量高達32%[2]，冬瓜籽油以不飽和脂肪酸為主，其中亞油酸含量高達48.55%[3]，具有極高的利用價值。

油脂的提取方法主要有超聲波法[3]、物理壓榨法[4]、溶劑浸出法[5]、水酶法等[6]。壓榨法出油率較低[7]；溶劑浸出法存在化學(xué)溶劑殘留[7-8]；超聲波法因投入成本大，生產(chǎn)能力受限[9]。目前，冬瓜籽油的提取工藝研究主要集中在超聲波輔助提取法[3，10-11]上，利用水酶法提取冬瓜籽油尚未有報道。水酶法是通過生物破壁方式提取油脂，條件溫和，有利于保留活性物質(zhì)，且操作和設(shè)備要求簡單，具有高效、綠色、安全的特點。

本研究運用響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化水酶法提取冬瓜籽油工藝，并對冬瓜籽油進行體外抗氧化活性研究，為冬瓜籽油的綜合應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

冬瓜籽，市售，粉碎后備用；α-淀粉酶、葡聚糖酶、纖維素酶、果膠酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶，購于河南慶飛食品配料有限公司；鹽酸、氫氧化鈉、VC、鐵氰化鉀、三氯化鐵、三氯乙酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、過氧化氫(H2O2)、七水合硫酸亞鐵、水楊酸、無水乙醇、1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)，均為分析純。

DF-101S電熱恒溫磁力攪拌器；DFY-C-400粉碎機；H2050R高速離心機；starter3C ST2100 pH計；DGX-9243B-1恒溫干燥箱；FA1104N電子分析天平；UABluestarA紫外可見分光光度計。

1.2 試驗方法

1.2.1 冬瓜籽油的提取

準確稱取冬瓜籽粉10.0 g，按一定料液比加入蒸餾水，用1.0 mol/L的HCl溶液或1.0 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH，加入酶制劑，在一定溫度下酶解一定時間，100℃加熱30 min滅酶，8 500 r/min離心20 min，吸取上層清油，稱重，按下式計算提取率。

提取率=W2/W1×100%

式中：W1為冬瓜籽中油的質(zhì)量；W2為酶解獲得冬瓜籽油的質(zhì)量。

1.2.2 冬瓜籽油體外抗氧化活性研究

1.2.2.1 DPPH自由基清除能力的測定

參照文獻[12]進行冬瓜籽油DPPH自由基清除能力的測定。按下式計算DPPH自由基清除率。

DPPH自由基清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%

式中：A1為樣品溶液+DPPH溶液吸光度；A2為樣品溶液+無水乙醇吸光度；A0為DPPH溶液+樣品溶劑吸光度。

1.2.2.2 羥基自由基清除能力的測定

參照文獻[12]進行冬瓜籽油羥基自由基清除能力的測定。按下式計算羥基自由基清除率。

羥基自由基清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%

式中：A1為樣品溶液+FeSO4溶液+H2O2溶液+水楊酸吸光度；A2為樣品溶液+FeSO4溶液+蒸餾水+水楊酸吸光度；A0為樣品溶劑+FeSO4溶液+H2O2溶液+水楊酸吸光度。

1.2.2.3 總還原力的測定

參照文獻[12]進行冬瓜籽油總還原力的測定。以吸光度表示鐵離子還原力大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 水酶法提取冬瓜籽油單因素試驗

2.1.1 酶種類對冬瓜籽油提取率的影響

稱取10.0 g冬瓜籽粉，按料液比1∶6加蒸餾水，調(diào)節(jié)pH至各酶的最適pH，分別加入3% (以冬瓜籽粉質(zhì)量計，下同)α-淀粉酶、葡聚糖酶、纖維素酶、果膠酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶，在各自最適溫度和最適pH[10](表1)下酶解6 h。酶種類對冬瓜籽油提取率的影響見圖1。

表1 各酶最適溫度及pH

注：1.纖維素酶；2.中性蛋白酶；3.酸性蛋白酶；4.果膠酶；5.堿性蛋白酶；6.α-淀粉酶；7.葡聚糖酶。

圖1 酶種類對冬瓜籽油提取率的影響

由圖1可看出，不同酶對于冬瓜籽油提取率都有一定的影響，其中葡聚糖酶對冬瓜籽油提取率的影響最大，其次是果膠酶和α-淀粉酶，纖維素酶對冬瓜籽油提取的效果甚微。分析原因可能是葡聚糖酶可以使冬瓜籽胚乳細胞壁中的β-葡聚糖分解，細胞壁破裂，使油脂分子很好地被釋放出來。因此，以葡聚糖酶作為后續(xù)試驗用酶。

2.1.2 葡聚糖酶添加量對冬瓜籽油提取率的影響

稱取10.0 g冬瓜籽粉，在料液比1∶6、pH 4.2下，分別加入1%、2%、3%、4%、5%葡聚糖酶，在60℃下酶解6 h，考察葡聚糖酶添加量對冬瓜籽油提取率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 葡聚糖酶添加量對冬瓜籽油提取率的影響

由圖2可看出，葡聚糖酶添加量小于3%時，隨著葡聚糖酶添加量的增加，冬瓜籽油提取率呈明顯上升趨勢，在葡聚糖酶添加量為3%時冬瓜籽油提取率達到最高，為89%，之后隨葡聚糖酶添加量增大，冬瓜籽油提取率下降，可能是由于酶用量過多，使酶本身發(fā)生自溶反應(yīng)。因此，最適的葡聚糖酶添加量為3%。

2.1.3 料液比對冬瓜籽油提取率的影響

稱取10.0 g冬瓜籽粉，分別在料液比1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8，pH 4.2下，加入3%葡聚糖酶，在60℃下酶解6 h，考察料液比對冬瓜籽油提取率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 料液比對冬瓜籽油提取率的影響

由圖3可看出，隨著料液比的增加，冬瓜籽油提取率呈現(xiàn)升高趨勢，當料液比為1∶6時冬瓜籽油提取率最高，之后隨料液比增加，冬瓜籽油提取率降低。料液比較低時，體系黏度大，酶與底物不能完全接觸，反應(yīng)不充分，冬瓜籽油提取率較低；料液比較高時，底物濃度降低，反應(yīng)接觸面積雖有增大，但是酶與底物相互作用的機會降低，使酶的作用效果下降，所以在冬瓜籽油提取過程中料液比為1∶6較適宜。

2.1.4 酶解時間對冬瓜籽油提取率的影響

稱取10.0 g冬瓜籽粉，在料液比1∶6、pH 4.2下加入3%葡聚糖酶，在60℃下分別酶解2、4、6、8 h，考察酶解時間對冬瓜籽油提取率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 酶解時間對冬瓜籽油提取率的影響

由圖4可看出，隨著酶解時間的延長，冬瓜籽油提取率先增大后降低。酶解時間較短，葡聚糖酶與底物接觸時間較短，未能充分反應(yīng)，導(dǎo)致冬瓜籽油提取率較低；隨著酶解時間的延長，酶對冬瓜籽細胞壁成分逐步分解破壞，使油脂分子團充分暴露在環(huán)境中，進而有利于油脂的釋放，所以冬瓜籽油提取率有所提高。但酶解時間過長，葡聚糖酶在長時間反應(yīng)過程中活性降低，水與油脂形成的乳化現(xiàn)象也更加明顯，導(dǎo)致冬瓜籽油提取率反而下降。因此，酶解時間選擇6 h較好。

2.1.5 pH對冬瓜籽油提取率的影響

稱取10.0 g冬瓜籽粉，料液比1∶6，分別調(diào)節(jié)pH為3.2、4.2、5.2、6.2，加入3%葡聚糖酶，在60℃下酶解6 h，考察pH對冬瓜籽油提取率的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 pH對冬瓜籽油提取率的影響

由圖5可知，隨pH增大，冬瓜籽油提取率增大，在pH為4.2時，冬瓜籽油提取率最高，之后隨pH增大，冬瓜籽油提取率降低。由于葡聚糖酶的最適反應(yīng)pH為4.2，此時酶處在高活力狀態(tài)，反應(yīng)速度較快，冬瓜籽油提取率最大。因此，pH選擇4.2為宜。

2.1.6 酶解溫度對冬瓜籽油提取率的影響

稱取10.0 g冬瓜籽粉，在料液比1∶6、pH 4.2下，加入3%葡聚糖酶，分別在40、50、60、70℃下酶解6 h，考察酶解溫度對冬瓜籽油提取率的影響，結(jié)果見圖6。

圖6 酶解溫度對冬瓜籽油提取率的影響

由圖6可知：隨酶解溫度的升高，冬瓜籽油提取率呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，60℃時，冬瓜籽油提取率最大，這是由于葡聚糖酶的最適酶解溫度為60℃左右，酶處在高活力狀態(tài)，反應(yīng)速度提高，冬瓜籽油提取率升高；當酶解溫度超過60℃后葡聚糖酶的活性降低，反應(yīng)速率減弱，導(dǎo)致冬瓜籽油提取率下降。因此，酶解溫度選擇60℃為宜。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

在單因素試驗研究基礎(chǔ)上，固定料液比1∶6，葡聚糖酶添加量3%，以pH(A)、酶解時間(B)、酶解溫度(C)為影響因素，冬瓜籽油提取率(Y)為響應(yīng)值，以Box-Behnken設(shè)計三因素三水平共17個試驗點的響應(yīng)面試驗，優(yōu)化水酶法提取冬瓜籽油的工藝條件，響應(yīng)面試驗因素水平見表2，響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果見表3，方差分析見表4。

表2 響應(yīng)面試驗因素水平

表3 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果

續(xù)表3

試驗號ABC提取率/%1401-170.34151-1072.161600091.3817-10-164.43

用Design-Expert 8.0.3對表3 中的試驗數(shù)據(jù)進行回歸分析后得到響應(yīng)面模型方程：Y=91.09+0.35A+0.47B+0.45C+0.42AB+0.12AC-0.020BC-11.92A2-6.50B2-14.19C2。

表4 響應(yīng)面試驗方差分析

注:**表示P<0.01,差異極顯著；*表示P≤0.05,差異顯著。

通過Design-Expert 8.0.3計算出該模型下理論冬瓜籽油提取率為91.10%，其理論試驗條件為pH 4.22、酶解時間6.07 h、酶解溫度60.15℃。因理論試驗條件不易操控，故修正試驗條件為pH 4.22、酶解時間6.1 h、酶解溫度60℃，在此條件下進行驗證試驗，得到冬瓜籽油提取率為90.67%，驗證值與預(yù)測值相對誤差為0.47%，二者非常接近，說明試驗得到的回歸模型適用于冬瓜籽油水酶法提取條件的預(yù)測。

2.3 冬瓜籽油體外抗氧化活性

2.3.1 DPPH自由基的清除能力

DPPH自由基較為穩(wěn)定，當DPPH自由基與抗氧化劑反應(yīng)時呈現(xiàn)顏色變化，其濃度與顏色深淺成正比，并在波長517 nm處有較好的吸收峰。自由基清除劑可與DPPH自由基的單電子配對，導(dǎo)致其在最大吸收波長處顏色變淺，吸光度也隨之減小。DPPH 自由基清除率越高，表明該物質(zhì)抗氧化能力越大[13]。冬瓜籽油及VC對DPPH自由基的清除能力分別見圖7、圖8。

圖7 冬瓜籽油對DPPH自由基的清除能力

圖8 VC對DPPH自由基的清除能力

由圖7可知，冬瓜籽油有一定的清除DPPH自由基的能力，且隨冬瓜籽油質(zhì)量濃度增大，其對DPPH 自由基清除率增大，但低于VC的(見圖8)。當冬瓜籽油質(zhì)量濃度為10 mg/mL時，其對DPPH自由基清除率僅有49.95%，而VC質(zhì)量濃度為1 mg/mL時，其對DPPH自由基清除率已達93.81%。通過SPSS 22.0計算出冬瓜籽油清除DPPH自由基的IC50為10.23 mg/mL。

2.3.2 羥基自由基的清除能力

在人體中，羥基自由基由于有極強的氧化能力，所以在羥基自由基過量的情況下，額外的羥基自由基首先會對人體細胞中糖類、氨基酸、蛋白質(zhì)等大分子造成傷害，從而使細胞出現(xiàn)死亡或突變的現(xiàn)象，進一步會導(dǎo)致人體出現(xiàn)衰老、產(chǎn)生一系列惡性疾病的狀況，羥基自由基與還原劑反應(yīng)后可在波長510 nm處呈現(xiàn)最高波峰。以VC為對照，冬瓜籽油對羥基自由基的清除能力見圖9。

圖9 VC與冬瓜籽油對羥基自由基的清除能力

由圖9可知，冬瓜籽油對羥基自由基清除能力隨其質(zhì)量濃度的增加而增大，在質(zhì)量濃度小于1.0 mg/mL時，冬瓜籽油對羥基自由基清除率低VC，但在冬瓜籽油質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時，其對羥基自由基清除率達到了98.84%，接近于相同質(zhì)量濃度下VC的。通過SPSS 22.0計算出冬瓜籽油清除羥基自由基的IC50為0.39 mg/mL。比較冬瓜籽油對DPPH自由基與羥基自由基的IC50可以看到，冬瓜籽油對氧化性更強的羥基自由基有更好的清除效果。

2.3.3 總還原力(見圖10、圖11)

圖10 冬瓜籽油總還原力

圖11 VC總還原力

由圖10可知，冬瓜籽油總還原力隨冬瓜籽油質(zhì)量濃度的增加而增大，但低于VC(見圖11)。

3 結(jié) 論

采用單因素試驗和響應(yīng)面試驗對水酶法提取冬瓜籽油工藝進行優(yōu)化，得到最佳的工藝條件為：料液比1∶6，酶解時間6.1 h，葡聚糖酶添加量3%，酶解溫度60℃，pH 4.22。在最佳條件下，冬瓜籽油提取率為90.67%。體外抗氧化活性結(jié)果表明：水酶法提取的冬瓜籽油對DPPH自由基和羥基自由基具有較強的清除能力，對應(yīng)的IC50分別為10.23 mg/mL和0.39 mg/mL，當冬瓜籽油的質(zhì)量濃度達到1.0 mg/mL時，對羥基自由基清除率達到98.84%，清除效果相當于相同質(zhì)量濃度的VC，對Fe3+有一定的還原能力，且還原能力隨冬瓜籽油質(zhì)量濃度增大而增強。