miR-195通過抑制小膠質(zhì)細胞自噬促進神經(jīng)術(shù)后持續(xù)性疼痛的研究

范宗峙，馬剛，史國棟，閆廷飛

(1.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第988醫(yī)院骨科，河南 鄭州 450042；2.第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院骨科，上海 200003)

神經(jīng)疼痛廣泛發(fā)生于神經(jīng)損傷過程中，多由背根神經(jīng)節(jié)的軸突損傷和異位/自發(fā)活動的損傷放電引起[1]。該病發(fā)病率較高，在普通人群中的發(fā)生率約為7%，中國約有1 600萬人罹患神經(jīng)疼痛并且療效有限。已有的證據(jù)顯示中樞神經(jīng)系統(tǒng)小膠質(zhì)細胞的激活在神經(jīng)疼痛形成和維持中起到重要作用[2]，同時小膠質(zhì)細胞的自噬過程參與其免疫炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)[3]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-195在脊髓神經(jīng)損傷模型中表達上調(diào)[4]?；诒掣窠?jīng)節(jié)小膠質(zhì)細胞與中樞神經(jīng)系統(tǒng)小膠質(zhì)細胞功能相似[5]，我們檢查了脊髓神經(jīng)結(jié)扎模型(spinal nerve ligature model，SNL)術(shù)后脊髓小膠質(zhì)細胞miR-195及自噬水平，以及miR-195模擬物對小膠質(zhì)細胞的自噬過程及炎癥因子的影響，以初步探究在miR-195大鼠術(shù)后持續(xù)性疼痛中發(fā)揮的作用。

1 資料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 成年雄性SD大鼠購于中國科學(xué)院(上海)，年齡3～4個月，體重(260±10)g。根據(jù)實驗動物研究標準的規(guī)定，在恒溫24℃、晝夜交替環(huán)境中飼養(yǎng)，自由攝食、飲水。按隨機數(shù)字表分成2組(n=18)：脊髓神經(jīng)結(jié)扎模型組(SNL組)和假手術(shù)組(Sham組)。

1.1.2 主要試劑與儀器 兔源抗LC3多克隆抗體、兔抗大鼠p62多克隆抗體、HRP標記的山羊抗兔IgG(法國Fermentas公司)；SYBR Green PCR試劑盒、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京天根生化科技公司)；Percoll細胞分離液(北京索萊寶科技有限公司)；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(廣州捷倍斯生物科技有限公司)；RIPA細胞裂解液、Trypsin-EDTA細胞消化液，DMEM-H基礎(chǔ)培養(yǎng)基，胎牛血清(美國Gibco公司)；牛血清白蛋白，TRIzol reagent(美國Invitrogen公司)；異氟醚，miR-195模擬物。細胞濾網(wǎng)(BD Biosciences，Alphen aan de Rijn，The Netherlands)、EPPENDORF低溫高速離心機；iQ5 Bio-Rad iCycler實時檢測系統(tǒng)；TANON凝膠成像分析儀，自動的動態(tài)足部觸覺測量器(Ugo Basile model 37400，Milan，Italy)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠脊髓神經(jīng)結(jié)扎模型制作 實驗動物給予異氟醚(2.5%)麻醉后，暴露背部脊柱橫截移除左側(cè)L6。分離出L5段神經(jīng)，用4-0的絲線緊密結(jié)扎背根神經(jīng)節(jié)的遠端，縫合切口。術(shù)后3 d后肌肉注射青霉素預(yù)防感染。假手術(shù)組模型給予相同的手術(shù)處理但是不結(jié)扎神經(jīng)。

1.2.2 脊髓小膠質(zhì)細胞的分離 術(shù)后第1天、第3天、第5天、第10天隨機處死4只大鼠，分離腰部膨大部位。將脊髓在4 mL預(yù)冷的Hanks’液中磨碎，采用70 μm的細胞濾網(wǎng)過濾并在400 g離心7 min，轉(zhuǎn)移上清獲得細胞懸液。15 mL離心管中分別緩慢加入3 mL的75% Percoll、3 mL的50% Percoll，3 mL的5% Percoll及2 mL的PBS。緩慢將細胞懸液加入分離液，10°C條件下1 000 g離心20 min，在50%和75%分界處的細胞即為小膠質(zhì)細胞。收集后用預(yù)冷的PBS清洗，以含有1% BSA的PBS重懸備用。

1.2.3 實時定量逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測miR-195水平 取部分上述小膠質(zhì)細胞，嚴格按照說明書要求采用TRIzol reagent提取細胞總核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄。以U6和β-actin分別作為miR-195和mRNAs的內(nèi)參，使用SYBR Green PCR試劑盒和Rotor-Gene RG-3000A進行實時定量PCR反應(yīng)，2-ΔΔCt法進行基因表達水平的定量分析。每個樣本分析3次。

1.2.4 Western blot檢測LC3與p62蛋白的表達 取部分1.2.2所述方法獲得的小膠質(zhì)細胞，以β-actin為內(nèi)參進行Western blot檢測。PBS洗滌后加入細胞裂解液于冰上渦旋裂解30 min。15 000 r/min離心裂解物15 min后收集上清液，取30 μL上述樣本分別加入4×SDS-PAGE上樣緩沖液煮沸5 min，上樣至120 g/L SDS-PAGE膠電泳。結(jié)束后，將凝膠上的蛋白電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，以含50 g/L脫脂奶粉的磷酸鹽吐溫緩沖液(phosphate buffered saline tween-20，PBST)封閉3 h。根據(jù)分子量標記剪下LC3與p62對應(yīng)位置的PVDF膜，分別轉(zhuǎn)移至兔源抗LC3多克隆抗體與兔抗大鼠p62多克隆抗體(1︰1 000)，37℃孵育2 h，PBST清洗3次，加入HRP標記的山羊抗兔IgG(1︰4 000)，37℃孵育1 h，PBST清洗3次，增強化學(xué)發(fā)光法(enhanceed chemi-luminescence，ECL)化學(xué)發(fā)光法顯色曝光。

1.2.5 鞘內(nèi)給藥與效應(yīng)分析 如1.2.1所述方法進行分組手術(shù)后經(jīng)腰椎穿刺進行鞘內(nèi)給藥。將32號的探針插入脊柱的L5和L6之間，手術(shù)當天到術(shù)后4 d隔日給予大鼠miR-195模擬物以及2-O-甲基化修飾的miR-195抑制劑3 μg。采用自動的動態(tài)足部觸覺測量器測試機械刺激縮足反應(yīng)閾值。最大值為50 g，達到最大值會自動斷開。每個爪子的閾值為3次連續(xù)測量的平均值，每次測量的時間間隔至少為10 min。對觸摸痛進行檢測時給予大鼠后爪足底部50 μL丙酮。每個后爪交替給予2次，每次連續(xù)給藥的間隔為5 min。丙酮給予2 min后檢測反應(yīng)。連續(xù)檢測3 d后處死大鼠，Percoll密度梯度離心法分離脊髓小膠質(zhì)細胞，Western Blot檢測LC3、p62及促炎因子白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)。

2 結(jié) 果

2.1 脊髓神經(jīng)結(jié)扎引起小膠質(zhì)細胞miR-195表達升高 為探究脊髓神經(jīng)結(jié)扎對大鼠脊髓小膠質(zhì)細胞miR-195表達的影響，我們建立了大鼠脊髓神經(jīng)結(jié)扎模型，并通過Percoll密度梯度離心法分離脊髓小膠質(zhì)細胞，采用逆轉(zhuǎn)錄實時定量PCR檢測miR-195的表達水平。結(jié)果表明在術(shù)后第1天、第3天、第5天、第10天時SNL組miR-195的表達水平均高于Sham組，并且SNL組內(nèi)miR-195的表達水平呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，表明脊髓神經(jīng)結(jié)扎是脊髓小膠質(zhì)細胞miR-195表達的刺激因素(見圖1)。

注：*代表與sham組(對照組)相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義

2.2 脊髓神經(jīng)結(jié)扎引起小膠質(zhì)細胞自噬水平降低 為探究脊髓神經(jīng)結(jié)扎對大鼠脊髓小膠質(zhì)細胞自噬水平的影響，我們檢測了自噬體膜標記蛋白LC3以及多功能泛素結(jié)合蛋白p62。LC3Ⅰ酯化為LC3BⅡ后才能錨定于自噬體膜上，故而LC3BⅡ的表達升高是自噬功能活化的標志之一；而p62通過連接LC3和泛素介導(dǎo)蛋白降解，其表達量與自噬水平呈負相關(guān)。SNL后的第1天、第3天、第5天、第10天時LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表達下調(diào)，同時p62表達水平升高，提示SNL后小膠質(zhì)細胞自噬過程受到抑制(見圖2)。

a 自噬體膜標記蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達比值

b 多功能泛素結(jié)合蛋白p62表達水平

2.3 miR-195的模擬物對大鼠行為的影響 為明確miR-195在脊髓神經(jīng)結(jié)扎引起大鼠神經(jīng)痛中的作用，我們于在體條件下給予miR-195的模擬物，觀察其對大鼠行為學(xué)水平的影響。結(jié)果顯示鞘內(nèi)給予miR-195的模擬物可縮短機械刺激縮足閾值并對熱刺激敏感，且這種效應(yīng)維持在注射后至少3 d(見圖3)。

2.4 miR-195模擬物引起小膠質(zhì)細胞炎癥因子增加與自噬抑制 兩組大鼠鞘內(nèi)給予miR-195的模擬物后，我們采用Western Blot法檢測脊髓小膠質(zhì)細胞炎癥因子IL-1β，TNF-α和iNOS表達水平及自噬標記蛋白LC3、p62表達水平。結(jié)果表明鞘內(nèi)給予miR-195模擬物誘使大鼠脊髓背角小膠質(zhì)細胞的炎癥因子表達增加，與此同時LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表達下調(diào)而p62表達水平升高，提示miR-195模擬物抑制小膠質(zhì)細胞自噬(見圖4)。

a 機械刺激縮足閾值 b 熱刺激縮足閾值

a 炎癥因子表達水平 b 脊髓小膠質(zhì)細胞的自噬水平

注：*代表與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義

圖4 miR-195的模擬物引起小膠質(zhì)細胞炎癥因子表達增加與自噬抑制

3 討 論

小膠質(zhì)細胞是定位于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的巨噬細胞，是脊髓水平炎癥因子的主要來源，而這些促炎因子在神經(jīng)疼痛的形成和維持中發(fā)揮著重要作用[6]。在坐骨神經(jīng)炎性病變、慢性壓迫性神經(jīng)損傷、部分坐骨神經(jīng)結(jié)扎和脊神經(jīng)結(jié)扎等各種慢性神經(jīng)疼痛模型中，痛覺過敏的出現(xiàn)均伴有小膠質(zhì)細胞的顯著活化[7]。尹顯和等[8]建立的術(shù)后持續(xù)性疼痛大鼠模型中，脊髓小膠質(zhì)細胞活化水平于術(shù)后3～7 d明顯升高，術(shù)后12 d恢復(fù)到術(shù)前水平。因此我們利用大鼠建立了脊髓神經(jīng)結(jié)扎模型，著力探究脊髓小膠質(zhì)細胞在持續(xù)性疼痛中的分子機制。

近年來的研究表明，miRNAs可能是神經(jīng)免疫和神經(jīng)疼痛的重要調(diào)節(jié)因子[9、10]。Aldrich等[11]發(fā)現(xiàn)miR-96，miR-182，miR-183在成年大鼠的背根神經(jīng)節(jié)中高表達，脊髓神經(jīng)結(jié)扎后這些miRNAs的表達大幅度下調(diào)，認為它們可能通過轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)疼痛相關(guān)基因的表達導(dǎo)致慢性疼痛。Favereaux等[12]則觀察到神經(jīng)疼痛動物中miR-103表達下降，鞘內(nèi)給予miR-103可成功的緩解疼痛，提示miRNAs可能成為治療慢性疼痛的新靶點。而我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，大鼠脊髓神經(jīng)結(jié)扎模型中后脊髓背角miR-195的表達增加，且增加的峰值及持續(xù)時間與術(shù)后痛覺過敏程度保持一致，提示miR-195可能參與術(shù)后持續(xù)性疼痛[4]。據(jù)此，我們分離了結(jié)扎后脊髓小膠質(zhì)細胞并檢測其miR-195表達水平，結(jié)果顯示術(shù)后2～14 d miR-195表達水平均顯著高于假手術(shù)組并且持續(xù)升高，證明脊髓背角miR-195表達的增加主要來源于小膠質(zhì)細胞。

Zhou等[13]發(fā)現(xiàn)缺血腦損傷后通過激活小膠質(zhì)細胞自噬可抑制免疫炎癥反應(yīng)，抑制小膠質(zhì)細胞自噬可增加損傷后炎癥反應(yīng)。Ma等[14]認為小膠質(zhì)細胞的自噬有助于其活化和隨后的炎癥反應(yīng)，然而具體機制仍不明確?；诩毎允蓪τ诿庖哐装Y反應(yīng)的調(diào)節(jié)功能，我們采用LC3與p62兩個自噬標志分子作為指標，檢測了脊髓結(jié)扎術(shù)后小膠質(zhì)細胞的自噬水平。本研究中，L5脊髓神經(jīng)結(jié)扎后脊髓背角中小膠質(zhì)細胞自噬水平明顯下降，且持續(xù)至術(shù)后至少10 d，與miR-195的表達水平呈負相關(guān)。為探究miR-195表達升高與自噬抑制的關(guān)系，我們采用了miR-195模擬物對術(shù)后大鼠進行鞘內(nèi)注射，并檢測炎癥因子與自噬水平，以及大鼠行為學(xué)的變化以衡量神經(jīng)疼痛程度。有趣的是，miR-195模擬物顯著抑制自噬水平并且促進炎癥因子的表達，與此同時大鼠械刺激縮足閾值降低并對熱刺激敏感，表明miR-195可能通過抑制細胞自噬，從而促進了炎癥因子的表達，參與術(shù)后神經(jīng)疼痛的產(chǎn)生和維持。

總之，本研究初步證明miR-195通過調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞的自噬過程影響其炎癥反應(yīng)，在神經(jīng)損傷后持續(xù)性疼痛中發(fā)揮重要作用，這為研究臨床術(shù)后持續(xù)性疼痛的治療提供了新的思路和藥物作用靶點。此后，我們將進一步探究miR-195抑制小膠質(zhì)細胞自噬的機制，以更深入的闡明神經(jīng)損傷后持續(xù)性疼痛的分子機制。