遼寧絨山羊絨肉兼用品系ZBED6基因克隆、分子特征分析

趙艷嬌 李豐田 張曉鷹 郭丹 白文林

摘 要 本研究以遼寧絨山羊為研究對象，利用分子生物學(xué)技術(shù)，克隆ZBED6基因進行序列測定，分析基因的5′調(diào)控區(qū)、編碼區(qū)。借助生物信息學(xué)分析軟件，將遼寧絨山羊ZBED6基因與其他物種基因序列進行比對，并預(yù)測其CpG島，為遼寧絨山羊的分子育種研究奠定理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 ZBED6基因；克??；遼寧絨山羊

遼寧絨山羊原產(chǎn)于遼寧省東南部山區(qū)是我國絨山羊品種中產(chǎn)絨量最高的優(yōu)良品種，屬絨肉兼用型品種。遼寧省畜牧科學(xué)研究院新培育的遼寧絨山羊“絨肉兼用”新品系種羊具有體格高大，遺傳性能穩(wěn)定，生長速度快等優(yōu)勢。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，對參與肌肉生長發(fā)育過程基因的研究也越來越深入。鋅指蛋白（ZBED）是IGF2基因的內(nèi)含子3突變區(qū)域中存在的一個抑制因子，大量研究表明，ZBED作為轉(zhuǎn)錄因子在哺乳動物的生長發(fā)育甚至是細胞的增殖分化的過程中有重要的調(diào)節(jié)作用[3]。本文從分子生物學(xué)的角度闡述了ZBED6對遼寧絨山羊肌肉生長發(fā)育的調(diào)節(jié)，為遼寧絨山羊“絨肉兼用”品系分子育種工作提供理論依據(jù)。

1 試驗材料

1.1 試驗動物

本實驗所采用的實驗動物均來自于遼寧省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)基地建設(shè)工程中心畜牧業(yè)部的健康遼寧絨山羊，選取成年公羊13只。

1.2 試驗藥品

DEPC、DNA聚合酶、MgCl2（25mM）、10×TAE、6×DNA Loading Buffer、引物等均采自上海生工生物有限公司；DM2000 Marker、RT-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑、TaqDNA聚合酶、dNTP Mixture、總RNA提取試劑盒采自大連TaKaRa生物有限公司；氯仿、無乙水醇、異丙醇1、丙三醇等采自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；去離子水為實驗室提供。

2 試驗方法

2.1 總RNA的提取

對遼寧絨山羊的七種不同組織的總RNA的提取，采用TRIzol法對總RNA進行提取，提取后的RNA的濃度和純度使用Thermo Scientific核酸測定儀和瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

2.2 總RNA的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

用PrimeScrimeTM RT Reagent Kit（TaKaRa，大連）反轉(zhuǎn)錄成cDNA，，第一步先去除樣品中殘留的基因組RNA反應(yīng)，完成后將離心管取出，繼續(xù)進行反轉(zhuǎn)錄試驗，PCR儀設(shè)置成：37℃，15min；85℃，5s；4℃。將配制好的共40μl的反應(yīng)液，充分混勻后放置于PCR儀內(nèi)進行反應(yīng)，反應(yīng)完成后將合成的cDNA于-20℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 PCR反應(yīng)

設(shè)計特異性引物對遼寧絨山羊的IGF2基因5′調(diào)控區(qū)和編碼區(qū)進行擴增，再進行反轉(zhuǎn)錄的cDNA，建立25μlPCR反應(yīng)體系進行擴增。擴增后的產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，并將擴增產(chǎn)物送至生物公司進行測序。

3 結(jié)果與分析

3.1 ZBED6突變位點及位置

經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn)，通過特異性設(shè)計引物擴增出遼寧絨山羊的ZBED6基因序列長度為4851bp，包括5′調(diào)控區(qū)、編碼區(qū)，編碼區(qū)長度為2943bp。將克隆出的遼寧絨山羊序列與山羊的序列進行對比發(fā)現(xiàn)，第838bp處發(fā)生A/G突變；第944bp處發(fā)生A/G突變；第1799bp處發(fā)生C/T突變；2276bp處發(fā)生A/G突變；2323bp處發(fā)生C/T突變；2333bp處發(fā)生G/T突變；2397bp處發(fā)生A/G突變；2480bp處發(fā)生A/G突變。

3.2 不同物種的ZBED6基因分子進化關(guān)系

將克隆出的遼寧絨山羊的ZBED6序列與其他動物的ZBED6序列進行對比分析，遼寧絨山羊與和山羊的同源性高達99.8%，與其它物種相比，ZBED6的同源性分別是：綿羊99%，藏羚羊99%，牦牛98%，水牛98%，豬91%，馬90%。通過以上動物之間的比對發(fā)現(xiàn)，ZBED6作為調(diào)控肌肉生長發(fā)育的基因在部分偶蹄目動物和奇蹄目動物中不僅是在物種內(nèi)高度保守，在種間也同樣高度保守，在進化過程中趨于穩(wěn)定。

3.3 ZBED6蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和生物信息學(xué)特征

對遼寧絨山羊ZBED6編碼區(qū)總長度進行開放閱讀框的分析，遵循Kozak法則（起始密碼子為ATG結(jié)構(gòu)），通過軟件分析發(fā)現(xiàn)，根據(jù)軟件預(yù)測，其體外半衰期為30小時，不穩(wěn)定系數(shù)為50.72（該值大于40為不穩(wěn)定蛋白），脂肪族氨基酸指數(shù)為83.06，其蛋白質(zhì)氨基酸殘基親疏水性總和為-0.281，說明遼寧絨山羊ZBED6的編碼蛋白質(zhì)疏水性較弱且不穩(wěn)定。

4 討論

ZBED6作為一種調(diào)控基因其特點主要是IGF2的抑制因子，通過生物學(xué)信息分析發(fā)現(xiàn)，其mRNA有較高的化學(xué)能，作為一種抑制因子，該特點使基因有較高的穩(wěn)定性，通過保守區(qū)和二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測發(fā)現(xiàn)其具有較高的保守性。隨著基因的分子進化，構(gòu)成蛋白質(zhì)序列的所有氨基酸的種類并不是共同進化的，一些重要的氨基酸序列依然是具有非常高的保守性，這就導(dǎo)致了在蛋白質(zhì)家族成員中有一些相同的核心的保守區(qū)，所以可以通過對保守區(qū)的對比，推測某種未知蛋白的潛在功能。

5 小結(jié)

（1）遼寧絨山羊ZBED6的基因編碼區(qū)，發(fā)現(xiàn)ZBED6基因編碼區(qū)序列總長度為2943bp，編碼980個氨基酸?？寺〕龅男蛄兄?，第838bp處發(fā)生A/G突變；第944bp處發(fā)生A/G突變；第1799bp處發(fā)生C/T突變；2276bp處發(fā)生A/G突變；2323bp處發(fā)生C/C突變；2333bp處發(fā)生G/G突變；2397bp處發(fā)生A/A突變；2480bp處發(fā)生A/G突變。（2）通過不同物種之間的親緣關(guān)系進化樹分析發(fā)現(xiàn)ZBED6基因在物種之間是比較保守的，不同目之間的也有80%以上的相似度。（3）對ZBED6的啟動子序列和CpG島進行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)ZBED6有三個TATA-box，四個CpG島，并對預(yù)測其mRNA的二級結(jié)構(gòu)的化學(xué)性質(zhì)。（4）利用軟件對ZBED6的信號肽和蛋白質(zhì)親水性進行分析發(fā)現(xiàn)，ZBED6沒有信號肽序列，兩者均是親水性蛋白質(zhì)。（5）ZBED6編碼980個氨基酸，相對分子質(zhì)量是109518.38，對其二級結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域進行預(yù)測發(fā)現(xiàn)其固定的結(jié)構(gòu)域具有高度保守的特點，并預(yù)測其三維結(jié)構(gòu)。

參考文獻

[1]姜懷志等.遼寧絨山羊的若干種質(zhì)特性[ J]，中國草食動物，2011.（06）：72-75.

[2]孫亞波等. 遼寧絨山羊羔羊肉用性能和羊肉品質(zhì)研究[ J].現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2014.（09）：14-18.

作者簡介：趙艷嬌（1979-），女，漢族，碩士，高級畜牧師，研究方向：絨山羊育種管理。

通訊作者簡介：郭丹（1981-），女，漢族，碩士，研究員級高級畜牧師，研究方向：絨山羊育種。

基金項目：國家絨毛用羊產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系飼料資源開發(fā)崗位（CARS-39-10）、農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)項目（2017202005）