金龍膠囊對耐紫杉醇及卡鉑卵巢癌H08910細胞的逆轉(zhuǎn)及增敏作用

王小毛 黃晶 石峰

摘要：目的 ?探討金龍膠囊在耐紫杉醇及卡鉑卵巢癌H08910細胞的逆轉(zhuǎn)作用及對H08910的致敏活性。方法 ?測定兩種耐藥細胞（卵巢癌H08910/Paclitaxel、卵巢癌H08910/Carboplatin）及相應(yīng)親本卵巢癌H08910細胞的IC50，并將其與化療藥物組合的無毒濃度的金龍膠囊聯(lián)用，以XR9576（XR9576為P-gp抑制劑）為陽性對照藥，評估不同濃度（80、160、320 μg/ml）的金龍膠囊對耐紫杉醇的卵巢癌細胞、耐卡鉑的卵巢癌細胞及交叉耐藥的HO8910細胞的逆轉(zhuǎn)活性及增敏作用。結(jié)果 ?金龍膠囊在80、160、320 μg/ml無毒濃度對HO8910/Paclitaxel細胞對紫杉醇的耐藥RF倍數(shù)分別為1.89、2.48和4.08，但活性弱于陽性對照藥;金龍膠囊在80、160、320 μg/ml無毒濃度對HO8910/Paclitaxel細胞對卡鉑的交叉耐藥有逆轉(zhuǎn)作用。金龍膠囊在80、160、320 μg/ml無毒濃度對HO8910/Carboplatin細胞對紫杉醇的耐藥RF倍數(shù)分別為1.96、2.16和4.11，但活性弱于陽性對照藥;金龍膠囊在80、160、320 μg/ml無毒濃度對HO8910/Carboplatin細胞對卡鉑的交叉耐藥也有逆轉(zhuǎn)作用。金龍膠囊在80、160、320 μg/ml無毒濃度對HO8910細胞有增敏作用，對Paclitaxel及陽性對照藥表現(xiàn)一定量效關(guān)系。結(jié)論 ?金龍膠囊對聯(lián)合化療的耐藥細胞具有耐藥逆轉(zhuǎn)的作用，并且對化療藥物具有一定的增敏作用。

關(guān)鍵詞：金龍膠囊;紫杉醇;卡鉑;卵巢癌H08910細胞;逆轉(zhuǎn);增敏

中圖分類號：R737.31 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.04.028

文章編號：1006-1959（2020）04-0094-03

Abstract：Objective ?To explore the reversal effect of Jinlong capsule on paclitaxel and carboplatin-resistant ovarian cancer H08910 cells and its sensitization activity to H08910.Methods ?The IC50 of two kinds of drug-resistant cells （ovarian cancer H08910/Paclitaxel， ovarian cancer H08910/Carboplatin） and corresponding parental ovarian cancer H08910 cells were measured， Combined with the non-toxic concentration of Jinlong capsules combined with chemotherapy drugs， XR9576 （XR9576 is a P-gp inhibitor） was used as a positive control drug， and Jinlong capsules of different concentrations （80，160，320 μg/ml） were evaluated. Reversal activity and sensitization of paclitaxel-resistant ovarian cancer cells， carboplatin-resistant ovarian cancer cells， and cross-resistant HO8910 cells.Results ?Jinlong capsules at 80， 160， and 320 μg/ml non-toxic concentrations of HO8910/Paclitaxel cells resistant to paclitaxel RF folds were 1.89， 2.48， and 4.08， respectively， but the activity was weaker than the positive control drug;Jinlong capsules at 80，160，320 μg/ml non-toxic concentrations can reverse the cross-resistance of HO8910/Paclitaxel cells to carboplatin. Jinlong capsules at 80，160，320 μg/ml non-toxic concentrations of HO8910/Carboplatin cells resistant to paclitaxel RF multiples of 1.96，2.16 and 4.11， respectively， but the activity is weaker than the positive control drug;Jinlong capsule also reversed the cross-resistance of HO8910/Carboplatin cells to carboplatin at non-toxic concentrations of 80， 160 and 320 μg/ml.Jinlong Capsules had a sensitizing effect on HO8910 cells at non-toxic concentrations of 80， 160 and 320 μg/ml， and showed a dose-effect relationship on Paclitaxel and positive control drugs.Conclusion ?Jinlong Capsule has the effect of reversing drug resistance of drug-resistant cells combined with chemotherapy， and has certain sensitizing effect on chemotherapy drugs.

Key words：Jinlong capsule;Paclitaxel;Carboplatin;Ovarian cancer H08910 cells;Reversal;Sensitization

卵巢（ovary）是女性器官中最容易發(fā)生癌癥的器官，據(jù)統(tǒng)計[1]，我國每年卵巢癌死亡人數(shù)高達11.4萬，由于缺乏早期癥狀及篩查手段，大多數(shù)患者確診時已是中晚期，預(yù)后較差。目前，卵巢癌的主要療法包括手術(shù)、聯(lián)合化療、靶向治療、激素治療等，其中化療藥物中通常以紫杉醇聯(lián)合鉑類藥物為主。雖然化療藥物治療可起到一定效果，然而多藥耐藥、化療引發(fā)的不良反應(yīng)等問題往往使化療達不到預(yù)期效果[2]，成為困擾腫瘤化療的關(guān)鍵難題。因此，尋找減毒、增效、多靶點抑制多藥耐藥的輔助治療方案迫在眉睫。金龍膠囊是一種新型廣譜抗癌中成藥，是多種中藥有效成分的提取物，最主要的成分來自鮮金錢白花蛇、鮮蘄蛇和鮮守宮，經(jīng)現(xiàn)代制劑工藝加工而成。研究表明[3，4]，金龍膠囊與化療藥物聯(lián)合治療多種器官癌癥，如鼻咽癌、胃癌、大腸癌、卵巢癌、肝癌等均有顯著效果。本研究通過建立體外不同耐藥細胞模型，給予金龍膠囊介入，評價不同濃度金龍膠囊對耐紫杉醇及卡鉑卵巢癌H08910細胞的逆轉(zhuǎn)作用和細胞增敏作用，現(xiàn)報道如下。

1材料與方法

1.1材料 ?金龍膠囊（北京建生藥業(yè)有限公司，批號：161121-019，規(guī)格：0.25 g/粒），細胞培養(yǎng)液溶解，0.22 μmol/L濾膜過濾，現(xiàn)用現(xiàn)配;注射用卡鉑（山東齊魯制藥有限公司，批號：20160801，規(guī)格：0.1 g/支）;紫杉醇注射液（揚子江藥業(yè)有限公司，批號：20160729，規(guī)格：16.7 ml∶100 mg）;他立喹達（Cayman Chemical，純度≥95%）、卵巢癌耐紫杉醇耐藥細胞（H08910/Paclitaxel）、卵巢癌耐卡鉑耐藥細胞（H08910/Carboplatin）及其親本細胞卵巢癌H08910細胞購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所;高糖DMEM（GIBCO公司）;胰蛋白酶（GIBCO公司）;胎牛血清（杭州四季青公司）;四甲基偶氮唑鹽（MTT）、二甲基亞楓（DMSO）、鏈霉素（100 U/ml）、青霉素（100 U/ml）、PBS液、磷酸溶液購自美國Sigma公司。

1.2方法 ?耐紫杉醇耐藥細胞H08910/Paclitaxel，耐卡鉑耐藥細胞H08910/Carboplatin及其親本細胞卵巢癌H08910細胞株接種于含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中，加入青霉素100 IU/ml、鏈霉素100 μg/ml，培養(yǎng)箱條件為37℃、5%CO2，每48 h更換培養(yǎng)液1次，觀察細胞生長情況，當細胞滿80%～90%后，以1∶3的比例傳代。耐藥株細胞H08910/Paclitaxel、H08910/Carboplatin在25 nmol/L 紫杉醇、10 nmol/L 卡鉑的培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，維持耐藥細胞的耐藥性，進行試驗前一周轉(zhuǎn)移耐藥細胞至正常培養(yǎng)液中[5]。采用MTT方法測定金龍膠囊對上述細胞的細胞毒性及其腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)活性。取對數(shù)生長期的敏感及耐藥株腫瘤細胞胰酶消化，接種于96孔細胞培養(yǎng)板中。24 h后，加入不同濃度（80、160、320 μg/ml）的金龍膠囊（取膠囊總填充物計算金龍膠囊濃度，膠囊總填充物中輔料占比68.8%）或抗腫瘤藥物，以他立喹達（XR9576，非競爭性P-glycoprotein抑制劑，作用于MDR細胞系，可逆轉(zhuǎn)耐藥性）為陽性對照藥，每個濃度設(shè)3個平行孔。培養(yǎng)72 h，棄原培養(yǎng)液，每孔加入0.5 mg/ml MTT液100 μl。繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去MTT液，每孔加入DMSO 150 μl，混合振蕩器振蕩，于酶標儀570 nm波長處測定吸收度（A）。上述實驗重復(fù)3次。細胞存活率（%）=100×給藥組/陽性對照藥。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 ?利用GraphpadPrism 8.0軟件計算IC50值，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)（RF）=IC50（抗腫瘤藥物）/IC50（抗腫瘤藥物+逆轉(zhuǎn)劑）。計量資料以（x±s）進行描述。

2結(jié)果

2.1金龍膠囊對卵巢癌HO8910細胞生長的影響 ?金龍膠囊作用72 h后，對所用到的兩對卵巢癌細胞都表現(xiàn)一定的抑制作用，IC50值在1.3～8.6 mg/ml水平。兩種耐藥細胞在不同金龍膠囊的作用下具有不同的敏感性，根據(jù)實際實驗情況進行濃度選擇。

2.2金龍膠囊對H08910/Paclitaxel及H08910細胞的作用 ?金龍膠囊在80、160、320 μg/ml無毒濃度對HO8910/Paclitaxel細胞對紫杉醇的耐藥RF弱于陽性對照藥。金龍膠囊對HO8910/Paclitaxel細胞對卡鉑的交叉耐藥有逆轉(zhuǎn)作用，見表1。

2.3金龍膠囊對H08910/Carboplatin細胞的作用 ?金龍膠囊在80、160、320 μg/ml無毒濃度對HO8910/Carboplatin細胞對紫杉醇的耐藥RF弱于陽性對照藥。金龍膠囊在80、160、320 μg/ml無毒濃度對HO8910/Carboplatin細胞對卡鉑的交叉耐藥也有逆轉(zhuǎn)作用，見表2。

2.4金龍膠囊對HO8910細胞的敏感度影響 ?金龍膠囊在80、160、320 μg/ml無毒濃度時對HO8910細胞有增敏作用，使H08910細胞對紫杉醇及卡鉑更敏感，而對Paclitaxel及XR9576表現(xiàn)一定量效關(guān)系，見表3。

3討論

卵巢癌是嚴重危害婦女的惡性腫瘤之一，臨床治療主要以手術(shù)為主，化療為輔，但隨著化療的進行，在一定程度上產(chǎn)生耐藥，致使化療失敗，從而影響了藥物的臨床療效[6]。與藥物和功能限制具有單個靶標的化療藥物相比，中國傳統(tǒng)藥物具有一定的優(yōu)勢，這主要是由于：①復(fù)雜的中藥成分，可以組合多個靶目標的效果;②能夠使心血管系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)在化療過程中發(fā)生更少的不良反應(yīng);③有些中藥的有效成分具有抗癌作用，這為尋找MDR逆轉(zhuǎn)劑提供了來源[7]。

目前國內(nèi)對金龍膠囊在卵巢癌輔助化療中的相關(guān)研究較少，本研究中建立不同的卵巢癌耐藥細胞模型，研究了金龍膠囊對耐紫杉醇及卡鉑卵巢癌H08910細胞在不同的藥物濃度下的逆轉(zhuǎn)作用和細胞增敏作用，結(jié)果表明金龍膠囊在80、160、320 μg/ml無毒濃度對HO8910/Paclitaxel細胞對紫杉醇的耐藥RF值分別為1.89、2.48和4.08，但活性弱于陽性對照藥XR9576。金龍膠囊在80、160、320 μg/ml無毒濃度對HO8910/Paclitaxel細胞對卡鉑的耐藥有逆轉(zhuǎn)作用;金龍膠囊在80、160、320 μg/ml無毒濃度對HO8910細胞有增敏作用，對Paclitaxel及陽性對照藥表現(xiàn)一定量效關(guān)系;金龍膠囊在80、160、320 μg/ml無毒濃度對HO8910/Carboplatin細胞對紫杉醇的耐藥RF值分別為1.96、2.16和4.11，但活性弱于陽性對照藥XR9576;金龍膠囊在80、160、320 μg/ml無毒濃度對HO8910/Carboplatin細胞對卡鉑的交叉耐藥也有逆轉(zhuǎn)作用。分析原因可能為金龍膠囊是由鮮守宮、鮮金錢白花蛇和鮮蘄蛇組成，藥方中鮮守宮為君藥，破瘀解毒散結(jié)、通經(jīng)活絡(luò)而止痛。鮮金錢、白花蛇為臣藥，具有搜風(fēng)通絡(luò)、降痰解毒、活血止痛的作用，輔助君藥可加強破瘀散結(jié)、解郁通絡(luò)之功。鮮蘄蛇為佐使藥，具有搜風(fēng)定痛、通經(jīng)達絡(luò)的作用，既可加強君藥滋陰破瘀散結(jié)功效，又可加強臣藥的通絡(luò)解郁散結(jié)力量。全方配伍精當、藥性平和，已證實用于治療多種腫瘤。該藥是由現(xiàn)代低溫冷凍生化分離提取，既保持了各有效成分的最大生物活性，又具有安全性好、易消化吸收、劑量小且療效顯著等的臨床應(yīng)用優(yōu)勢和特點，避免了化療藥物毒性大、安全性差的缺點[8]。有研究表明[9]，其對腫瘤抗癌的作用廣泛，涉及腫瘤細胞的生長、轉(zhuǎn)移等多個重要環(huán)節(jié)，在腫瘤疾病的治療中逐漸顯現(xiàn)出了新的功能和活力。目前有一些臨床研究結(jié)果表明其在腫瘤臨床應(yīng)用上有可能起到如下的應(yīng)用： ①金龍膠囊能夠通過聯(lián)合化療藥物增強機體對腫瘤的自身免疫力，通過其增加T細胞、NK巨噬細胞、Lak細胞、巨噬細胞等多種抗腫瘤殺傷細胞的數(shù)量或功能，增強與抗惡性腫瘤藥物相關(guān)的細胞因子活性而有效地達到對抗惡性腫瘤的聯(lián)合化療作用[2]。②金龍膠囊能夠作為聯(lián)合化療用藥，減少聯(lián)合化療的不良反應(yīng)。在化療藥物介入腫瘤治療中，減少冠狀動脈栓塞，減少對胃腸道反應(yīng)、抑制體內(nèi)白細胞減少、血小板的數(shù)量下降，減少死亡率[10]。

綜上所述，金龍膠囊能夠?qū)δ妥仙即技翱ㄣK卵巢癌H08910細胞起到逆轉(zhuǎn)及增敏作用，有望提高卵巢癌患者術(shù)后輔助化療的療效，為金龍膠囊抗腫瘤研究提供參考。

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收稿日期：2019-12-10;修回日期：2019-12-20

編輯/杜帆