甜菜分子標記InDel-PCR引物的篩選

魏茜雅，劉乃新，吳則東，邳植，興旺

（黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院，哈爾濱150080）

0 引言

糖用甜菜是我國主要經(jīng)濟作物之一,是我國東北、西北、華北地區(qū)制糖的主要工業(yè)原料,在三北地區(qū)甜菜在農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整和發(fā)展地方經(jīng)濟中占有重要地位。但由于中國不是甜菜起源國,缺少種質(zhì)資源，再加之相關(guān)研究和資源積淀較薄,所以我國的甜菜研究水平整體落后。而隨著基因組學(xué)研究的飛速發(fā)展,分子標記育種成為作物遺傳改良的重要途徑之一，新的分子標記不斷被開發(fā)和廣泛應(yīng)用，從而加速了作物基因組輔助育種和設(shè)計育種的進程[1]。

甜菜分子標記技術(shù)近年來發(fā)展較快，已經(jīng)有多種分子標記技術(shù)應(yīng)用到甜菜的育種工作，如SSR[2]、ISSR[3-4]、AFLP[4-5]、RAPD[5]以及RFLP[6]等。InDel（Insertion-deletion）標記是基于同一物種不同個體基因組的同源序列發(fā)生核苷酸片段的插入或者缺失，也是通過對DNA同源序列比對產(chǎn)生空位的現(xiàn)象，根據(jù)基因組中插入缺失位點，設(shè)計一些擴增這些插入缺失位點的PCR-引物，其本質(zhì)仍屬于長度多態(tài)性遺傳標記[7-8]。InDel作為一種高通量遺傳標記，具有基因組內(nèi)分布廣泛、帶型簡單、重復(fù)性好、準確性高、變異穩(wěn)定、密度高、數(shù)目眾多等特點，與其他分子標記相比，在基因組的同一位置出現(xiàn)相同大小的InDel標記的概率非常低，避免了由于特異性和復(fù)雜性導(dǎo)致的后續(xù)分析模糊；在作物種質(zhì)資源遺傳多樣性分析中，可顯著提高其重現(xiàn)性、準確性和分辨率，因此能解決引種材料中名稱混亂不清、種質(zhì)資源整理困難、親本材料間遺傳重復(fù)度高等問題[7-9]；從分布密度看，InDel略低于SNP標記，卻遠高于SSR 標記[8]。該標記已應(yīng)用于動植物的圖位克隆、基因定位、遺傳圖譜的構(gòu)建、群體遺傳分析、種質(zhì)資源分析與分子輔助遺傳育種等。在水稻[10]、玉米[11]、棉花[12-13]、油菜[14]、綠豆[15]、番茄[16]、甜菜[17-18]和辣椒[9]等作物及果樹[19]中得到了很好的應(yīng)用。

目前甜菜InDel-PCR 引物報道的較少[17]，目前農(nóng)業(yè)農(nóng)村部甜菜質(zhì)檢中心已經(jīng)利用甜菜重測序結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù)開發(fā)了3 000多對InDel引物，我們從中合成了300 對InDel引物，通過對這300 對引物進行擴增、檢測，篩選出適合于甜菜分子標記的InDel核心引物，并從中選擇可以用于多重PCR 構(gòu)建的引物，為InDel引物更好地在甜菜分子生物學(xué)上的利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試8個甜菜品種由糖料產(chǎn)業(yè)體系育種研究室提供，分別為：Beta240、Beta237、Beta379（美國Betaseed公司），MA3018、MA3005（丹麥Maribo公司），KWS3418、KWS2134、KWS2463（德國KWS公司），編號見表1。

表1 試驗中用到的甜菜品種名稱、編號及來源Table 1 Name,number and origin of sugar beet varieties used in tests

1.2 引物

試驗中用到的300對InDel引物由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部甜菜質(zhì)檢中心提供，按照ND1～300進行編號，所有引物均由上海生工生物工程公司合成，Hap純化。

1.3 主要試劑及儀器

PCR 擴增所用的主要試劑dNTPs、Taq DNA 酶、10×Buffer、模板DNA、ddH2O。主要儀器有穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（DYY-8B型）、DYCZ-30C型電泳槽、eppendorf PCR儀。

1.4 試驗方法

1.4.1 甜菜基因組DNA的提取

試驗中用到的甜菜品種首先在光照培養(yǎng)室中進行播種，取一對真葉展開期的甜菜幼苗基因組DNA，利用改良的CTAB 法[20]進行提取，用滅菌的純凈水進行溶解，經(jīng)核酸蛋白測定儀檢測濃度后，取部分稀釋成10ng/μL的工作液，原液放入冰箱冷凍層進行保存。

1.4.2 擴增及檢測

利用8個差異較大的甜菜基因組DNA 對合成的300對甜菜InDel引物進行篩選，所用的體系參考吳則東等人[21]的SSR反應(yīng)體系，所用的PCR 程序中的退火溫度均為55度，循環(huán)35次。反應(yīng)結(jié)束后，利用銀染法進行染色，拍照后進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，只統(tǒng)計條帶清晰、易于識別并具有多態(tài)性的條帶，分別記錄每一對引物擴增的全部條帶以及多態(tài)性條帶。

表2 篩選出的甜菜InDel 引物及多態(tài)性條帶數(shù)Table 2 The band number of primer and its polymorphism of InDel in sugar beet

2 結(jié)果與分析

2.1 甜菜InDel引物的篩選

利用300對InDel引物對8 個甜菜品種DNA 進行擴增，大部分InDel引物沒有多態(tài)性或者條帶不易識別。最終按照多態(tài)性較好、條帶清晰、易于識別的標準，篩選出甜菜InDel引物44 對，篩選的引物名稱、擴增總條帶數(shù)、多態(tài)性條帶數(shù)以及多態(tài)性百分比見表2。這44對引物共擴增出總條帶116條，其中多態(tài)性條帶109條，多態(tài)性比率為94%；44 對引物擴增的總條帶數(shù)從2條到8 條不等，但以2 條為最多，為29 對，占總篩選出引物的66%；其中有37 對引物擴增的總條帶為2 或3 條，可作為多重InDel 引物的首選。圖1 為引物ND279、ND280及ND281擴增銀染圖。

圖1 引物ND279、ND280及ND281擴增銀染圖Fig.1 Primer ND279,ND280 and ND281 amplified silver dyeing chart

2.2 多重InDel引物的確立

進一步確定InDel 多重引物。多重引物確立的一個標準就是不同引物擴增條帶不能有重疊，因此條帶太多很難構(gòu)建成功多重PCR，因此最終確定總條帶為2 條或者3 條的InDel 引物做為將來可以利用的多重InDel 引物。在篩選出的37 對引物中共篩選出了7 對引物可以構(gòu)建一個四重、多個三重以及二重PCR，這7對引物按照擴增條帶分子量從大到小排列順序為：ND228、ND31、ND267、ND229、ND66、ND231、ND22。如圖2 為可以建立三重InDel 的其中3 個引物：ND22、ND31、ND66，可以看到，這3 對引物擴增的條帶沒有重疊和交叉，且擴增的總條帶數(shù)較少，適合于構(gòu)建多重PCR。

圖2 可以構(gòu)建二重及三重PCR的3對引物Fig.2 Three pairs of primers constructed for double and triple PCR

3 結(jié)論與討論

本文通過對300對甜菜InDel引物進行篩選，從中篩選出44 對可以用于甜菜分子標記利用的核心引物，這44 對引物共擴增出總條帶116 條，其中多態(tài)性條帶109 條，多態(tài)性比率為94%；其中有37 對引物擴增的總條帶為2 或3 條，可以作為將來多重InDel 引物的首選；又從中篩選出7 對多重InDel 引物：ND228、ND31、ND267、ND229、ND66、ND231、ND22。甜菜InDel 引物的篩使得InDel 引物將來在甜菜分子生物學(xué)上的應(yīng)用提供了可能，而多重Indel 引物的篩選也為高效地利用InDel 引物、減少藥品的使用、提高效率提供了思路[22-23]。InDel分子標記在作物種質(zhì)資源遺傳多樣性分析中有較好的重現(xiàn)性、準確性和分辨率，由于其分布廣泛，因此需要花費更多的時間對其進行開發(fā)研究，以便篩選出更加合適的引物用于其分析鑒別研究[23]。

目前品種鑒定已經(jīng)發(fā)展到分子階段，用于構(gòu)建品種指紋的DNA 分子標記應(yīng)具有多態(tài)性高，重復(fù)性和穩(wěn)定性好，帶型清晰，易于識別統(tǒng)計，不容易受環(huán)境條件的影響等特點[16]。由于InDel引物的二態(tài)性標記特點，各引物僅兩個等位基因且預(yù)期產(chǎn)物大小明確，對組建多重PCR 優(yōu)勢明顯，能夠保證引物充分擴增、避免其交叉，易于實現(xiàn)多重PCR，且InDel引物不會出現(xiàn)連續(xù)多峰現(xiàn)象，便于數(shù)據(jù)整理與統(tǒng)計分析[11]。但是二態(tài)性InDel標記在檢測多倍體物種中，用一對引物不能實現(xiàn)該位點多種不同變異的檢測，因此最終產(chǎn)生的二態(tài)性InDel標記組合需要覆蓋整個基因組，才能保證品種鑒定的準確性[12]。InDel-PCR 擴增產(chǎn)物受多因素綜合影響，若模板DNA 濃度較高，則會使抑制反應(yīng)的成分增加而產(chǎn)生非特異性擴增；若模板DNA 濃度較低，則會使擴增產(chǎn)物條帶殘缺甚至不顯現(xiàn)。而引物過高或過低的濃度對InDel-PCR 的帶型也產(chǎn)生很大影響，要注意會產(chǎn)生形成引物二聚體或擴增不完全等現(xiàn)象。在提取DNA 之前的樣品處理方法中，直接用研磨機打磨的方法，可以極大地提高樣品研磨效率；而用錫箔研磨的樣品損失小、DNA 無降解[24]。提取高純度的模板DNA是進行InDel-PCR 的前提和基礎(chǔ)，在甜菜樣品基因組DNA 提取眾多方法中，最常用的是CTAB 法，一般能滿足各種要求，而SDS法成本較低，更適合甜菜葉片大量提取DNA，堿裂解法最適合快速檢測[25]。本試驗DNA提取方法是常用的CTAB法，該方法具有穩(wěn)定性較好、得率較高、費用較低、操作步驟繁瑣、耗時長，部分藥品中毒性較大等特點；而DNA 提取試劑盒提取法具有操作較簡單、純度較高、雜質(zhì)少、毒害較少、成本較高特點，高通量優(yōu)質(zhì)提取法在作物中逐漸被重視與應(yīng)用[9，25]，今后應(yīng)探討該方法的應(yīng)用效果，以期快速獲得高質(zhì)量的DNA、篩選出多重引物，更好地用于InDel標記遺傳多樣性分析。