2 種刷毛的電動(dòng)牙刷對(duì)菌斑清除功效及釉質(zhì)磨損的影響

張彭飛 苑克勇 黃正蔚

牙菌斑是指細(xì)菌以生物膜的形式附著于口腔軟硬組織表面而形成的復(fù)雜微生物群落[1]，可導(dǎo)致齲齒、牙齦炎、牙周炎等口腔疾病[2-4]。唾液中的大量微生物及宿主飲食中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等因素使得菌斑的產(chǎn)生不可避免，因而去除牙菌斑，維護(hù)口腔衛(wèi)生成為預(yù)防和治療口腔常見疾病，保障牙體和牙周組織健康的重要措施?？刂凭叩姆椒ㄓ泻芏?，如機(jī)械法，藥物法，免疫療法等。其中，機(jī)械法去除牙菌斑是最常見且可靠的，如刷牙、使用牙線、牙簽、牙間隙刷等，因其方便快捷在日常生活中逐漸得以普及[5-7]。但相較于其他機(jī)械去菌方法，人們對(duì)刷牙的依從性更好。并且多項(xiàng)研究表明，通過(guò)刷牙可有效去除牙齒表面的牙菌斑/生物膜，對(duì)預(yù)防口腔疾病，特別是齲齒、牙齦炎和牙周炎等有重要作用[2-4]。因此，在個(gè)人日?？谇恍l(wèi)生保健中使用牙刷已經(jīng)成為多數(shù)人潔齒護(hù)齒的重要方法[5]。

一般認(rèn)為，使用手動(dòng)牙刷是保持口腔衛(wèi)生的基本方法。自20 世紀(jì)60 年代初電動(dòng)牙刷問(wèn)世以來(lái)[8]，對(duì)于電動(dòng)牙刷的研究和開發(fā)日趨增多，其作為一種新形式的口腔保健方法也逐漸為大眾所認(rèn)可。電動(dòng)牙刷通過(guò)一定振動(dòng)頻率的刷頭的側(cè)向及旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)來(lái)模擬牙刷的手動(dòng)運(yùn)動(dòng)[9]，因此，不同的刷頭類型對(duì)電動(dòng)牙刷功效的影響也不盡相同。磨損是由于牙體硬組織因外力(單純機(jī)械磨擦)造成慢性磨耗的現(xiàn)象，可由遺傳因素，如先天性釉質(zhì)發(fā)育不全等，酸蝕，磨牙癥，橫刷牙等引起[10]。橫刷牙對(duì)牙齒頸部磨損影響較大，可導(dǎo)致牙本質(zhì)過(guò)敏，楔狀缺損等疾患。而牙刷毛的軟硬度也是影響刷牙對(duì)牙齒磨損的重要因素[11]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)造變異鏈球菌(S.mutans)和內(nèi)氏放線菌(A.naeslundii)雙菌種生物膜[12-13]，在體外模型中用不同硬軟頭電動(dòng)牙刷對(duì)牙面菌斑生物膜進(jìn)行接觸式去除，旨在比較硬軟頭電動(dòng)牙刷之間菌斑清除的功效；用硬軟頭電動(dòng)牙刷對(duì)磨片分別處理，借以對(duì)比不同硬度刷毛對(duì)釉質(zhì)磨損的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

腦心浸液培養(yǎng)液、瓊脂及血平板培養(yǎng)基(BD,美國(guó))；接種針、牛恒磨牙、革蘭氏染色劑 (上海生工生物科技)；95%乙醇；1%結(jié)晶紫；0.9%生理鹽水；牙膏(Colgate?，美國(guó))；上朵SD01電動(dòng)牙刷(尼龍絲刷頭:刷頭大小均10 mm×18 mm，刷毛數(shù)量1 800 根/支，刷毛直徑0.127 mm、納米軟膠刷頭：刷頭大小均10 mm×18 mm，刷毛數(shù)量1 800 根/支，刷毛直徑0.127 mm)、上朵YB8702手動(dòng)牙刷(刷頭大小10 mm×18 mm，數(shù)量1 600 根/支，刷毛直徑0.152 mm)(深圳市優(yōu)尼雅時(shí)尚電器有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

超凈工作臺(tái)；厭氧培養(yǎng)箱(含體積分?jǐn)?shù)80%的N2、10%的CO2和10%的H2)、分光光度儀、 超速離心機(jī)(Beckman Optima L-100XP，美國(guó))；酶標(biāo)儀(BIO-TEK，美國(guó))；光學(xué)顯微鏡(Whitley DG250,英國(guó))；SEM(FEI,Qnanta-200F，荷蘭)。

1.3 實(shí)驗(yàn)菌株培養(yǎng)及純度鑒定

本實(shí)驗(yàn)采用的S.mutansUA159和A.naeslundiiT14V-J1由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院口腔微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。室溫下復(fù)蘇-80 ℃冰箱中的細(xì)菌凍存液后，吸取30 μl菌液，四區(qū)劃線法涂布于固體培養(yǎng)基上。厭氧培養(yǎng)48 h后, 挑取單克隆菌落于4 ml BHI培養(yǎng)基中繼續(xù)厭氧培養(yǎng)，變異鏈球菌(S.mutans)培養(yǎng)24 h，內(nèi)氏放線菌(A.naeslundii)培養(yǎng)48 h。 革蘭氏染色鑒定兩菌種純度。

1.4 生物膜模型建立

將2 種細(xì)菌懸液室溫下以12 000 r/min離心5 min取沉淀， 并用0.9%生理鹽水清洗2 次以消除細(xì)菌團(tuán)塊。然后用BHI培養(yǎng)液稀釋，在600 nm波長(zhǎng)下用分光光度儀測(cè)量稀釋后菌液A值，將A值為0.5的2 種菌液稀釋液作為原液，調(diào)整菌液濃度為3×108CFU/ml。 將去除全部軟組織的離體牛牙頰面在無(wú)菌條件下制備成8 mm×8 mm×2 mm大小釉質(zhì)磨片， 共12 片， 分為4 組， 每組3 片。 121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min， 分別置于24 孔板中。將稀釋后的S.mutans及A.naeslundii細(xì)菌懸液各取100 μl依次滴至磨片表面，并用BHI將每孔補(bǔ)齊至1.5 ml將牛牙釉質(zhì)磨片完全覆蓋。將孔板置于37 ℃培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)，24 h換液，共培養(yǎng)48 h，在磨片表面形成雙菌種生物膜。

1.5 牙刷處理菌斑生物膜

將已形成生物膜的牛牙釉質(zhì)磨片分4 組， 每組3 片。 分別為： A:對(duì)照組，不做處理； B:硬刷毛電動(dòng)牙刷組，使用上朵SD01高頻振動(dòng)牙刷及尼龍絲刷頭處理； C:軟刷毛電動(dòng)牙刷組，使用上朵SD01高頻振動(dòng)牙刷及納米軟膠刷頭處理；D：手動(dòng)牙刷組，使用上朵YB8702手動(dòng)牙刷處理。電動(dòng)牙刷振動(dòng)頻率43 200 次/min，生物膜和牙刷刷毛均浸沒(méi)于含17%牙膏(Colgate?，美國(guó))的BHI培養(yǎng)液中。后3 組分別用相應(yīng)的牙刷對(duì)磨片表面菌斑生物膜進(jìn)行接觸式處理，牙刷均用砝碼加重后，垂直向施加1.5 N力于釉質(zhì)磨片，自近中至遠(yuǎn)中磨刷5 s[14-15]。

1.6 結(jié)晶紫吸附半定量實(shí)驗(yàn)

將牛牙釉質(zhì)磨片置于24孔板， 1 ml 0.9%生理鹽水漂洗生物膜3 次以去凈未結(jié)合到磨片上的細(xì)菌。每孔加入1%結(jié)晶紫染液1 ml， 靜置15 min后吸棄染料， 0.9%生理鹽水漂洗3 次去凈未結(jié)合的染液。每孔加入500 μl 95%乙醇，搖床脫色30 min。取倍比稀釋后的結(jié)晶紫脫色液100 μl至96 孔板(每組3 個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次)， 565 nm波長(zhǎng)處用酶標(biāo)儀下測(cè)定各孔吸光度(A值)。對(duì)照組結(jié)晶紫脫色液A值可半定量測(cè)量生物膜形成量，各個(gè)處理組的結(jié)晶紫脫色液A值可作為處理后剩余的生物膜量。各個(gè)處理組的生物膜去除量可按以下方法計(jì)算：

生物膜去除量=對(duì)照組A值-處理組A值

1.7 磨損實(shí)驗(yàn)

另制取3片8 mm×8 mm×2 mm牛牙釉質(zhì)磨片，樹脂包埋固定后，分為3 組。 A: 對(duì)照組，不做處理； B: 硬刷毛電動(dòng)牙刷組，使用上朵SD01高頻振動(dòng)牙刷及尼龍絲刷頭接觸式處理； C: 軟刷毛電動(dòng)牙刷組，使用上朵SD01高頻振動(dòng)牙刷及納米軟膠刷頭接觸式處理。電動(dòng)牙刷振動(dòng)頻率43 200 次/min，使用含17%牙膏的0.9%生理鹽水作為磨損液。牙刷均用砝碼加重后，垂直向施加1.5 N力于釉質(zhì)磨片，自近中至遠(yuǎn)中磨刷1 h后， 用0.9%生理鹽水清洗2 次以去除釉質(zhì)磨片表面磨損液。之后將各組標(biāo)本置于SEM下，觀察釉質(zhì)磨片的表面形貌。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)比較各處理組間生物膜去除量的差異，以P≤0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 結(jié)晶紫吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果

各處理組菌斑生物膜去除量結(jié)果如圖1，電動(dòng)牙刷和手動(dòng)牙刷均能有效的去除菌斑生物膜。上朵SD01電動(dòng)牙刷+尼龍絲刷頭菌斑生物膜去除量(0.45±0.02)與上朵SD01電動(dòng)牙刷+納米軟膠刷頭(0.44±0.03)均大于YB8702手動(dòng)牙刷組(0.25±0.02)，差距具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.31，P<0.01；t=5.13，P<0.01)。而兩電動(dòng)牙刷組菌斑生物膜去除量差距無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.35，P=0.75)。

圖1 結(jié)晶紫染色法比較各組菌斑生物膜去除量

2.2 SEM觀察結(jié)果

SEM下3 組釉質(zhì)磨片表面形貌如圖2。未經(jīng)刷牙處理的釉質(zhì)磨片(對(duì)照組)表面呈現(xiàn)較平整光滑的表面，無(wú)明顯凹陷；使用上朵SD01高頻振動(dòng)牙刷及尼龍絲刷頭處理的硬刷毛電動(dòng)牙刷組，釉質(zhì)磨片表面呈現(xiàn)大量密集不平整的凹陷，凹陷程度較深；使用上朵SD01高頻振動(dòng)牙刷及納米軟膠刷頭處理的軟刷毛電動(dòng)牙刷組，釉質(zhì)磨片表面呈現(xiàn)散在分布凹陷，凹陷數(shù)量較B組的少，凹陷程度也較B組稍淺。可以看出，使用電動(dòng)牙刷刷牙會(huì)對(duì)釉質(zhì)表面造成磨損，且牙刷刷毛硬度越大，造成釉質(zhì)表面的凹陷越大越深越多，表面形態(tài)越粗糙，對(duì)釉質(zhì)的磨損越重。

圖2 各組釉質(zhì)磨片表面形貌(SEM， ×5 000)

3 討 論

牙菌斑是導(dǎo)致齲患和牙周病的重要因素。唾液中的蛋白或糖蛋白吸附到牙面上形成獲得性薄膜后，很快不同種類的細(xì)菌按照不同的時(shí)空順序黏附到獲得性薄膜上從而形成牙菌斑生物膜。最早定植于牙面的細(xì)菌是鏈球菌和放線菌，之后更多致病和共生的菌株逐漸黏附其上，引起齲病，牙周病等疾病[12-18]。因而有效的去除牙菌斑生物膜就成為保護(hù)口腔健康的一項(xiàng)重要措施。刷牙則是日常生活中控制菌斑最普遍且有效的方法。隨著科技的發(fā)展，電動(dòng)牙刷，磁療牙刷，負(fù)離子牙刷等相繼出現(xiàn)，并逐漸走入大眾的視野，其中應(yīng)用廣泛的仍然是電動(dòng)牙刷。

變異鏈球菌(S.mutans)是目前公認(rèn)的主要致齲菌之一。其胞壁表面的脂磷壁酸，蛋白多糖等使得細(xì)菌在牙表面能夠黏附定植[16,18]；并具有產(chǎn)酸耐酸等毒力特征，在16 h內(nèi)就能在牙面形成致密的菌斑生物膜[12]。內(nèi)氏放線菌(A.naeslundii)也是牙面菌斑生物膜早期定植的先鋒菌之一，且與變異鏈球菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)無(wú)競(jìng)爭(zhēng)性抑制[12,17]，因而在早期牙菌斑生物膜的形成發(fā)展過(guò)程中，兩者起著非常重要的作用。Verkaik等[13]對(duì)各類體外菌斑生物膜去除實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)：A.naeslundii和S.mutans作為先鋒菌，二者通過(guò)共聚集作用定植于獲得性薄膜上，黏附力相對(duì)于單菌種或的其他多菌種生物膜更強(qiáng)。更適宜用作菌斑去除實(shí)驗(yàn)的體外模型。這與Paramonova等[19]的研究結(jié)果是一致的。本實(shí)驗(yàn)同樣采用A.naeslundii和S.mutans雙菌種，通過(guò)BHI培養(yǎng)液吸附到牛牙釉質(zhì)磨片上形成生物膜，能夠有效模擬體內(nèi)菌斑生物膜的特性，而且容易定量培養(yǎng)，利于后續(xù)重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

刷牙過(guò)程中牙刷是必不可少的工具，刷頭與牙面的摩擦起著主要清潔作用。清潔效果是評(píng)價(jià)牙刷功能最主要的方面。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)牛牙釉質(zhì)磨片及雙菌種生物膜構(gòu)建的體外模型，來(lái)比較不同刷頭的電動(dòng)牙刷接觸式刷牙時(shí)的菌斑清除效率，從而對(duì)口腔保健提供依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，電動(dòng)牙刷和手動(dòng)牙刷均能有效去除牙面菌斑生物膜，這說(shuō)明通過(guò)刷牙能夠有效的去除菌斑，對(duì)維護(hù)口腔清潔和健康具有重要積極作用。且電動(dòng)牙刷的菌斑清除效率均比手動(dòng)牙刷高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這說(shuō)明相較于傳統(tǒng)的手動(dòng)牙刷，電動(dòng)牙刷能夠更大程度的去除牙面菌斑生物膜，保障牙體及牙周組織健康，這與多項(xiàng)研究結(jié)果一致[3-4,14,18-21]。Schmidt等[22]還通過(guò)使用電動(dòng)牙刷處理鄰面菌斑生物膜體外模型，并用共聚焦顯微鏡觀察處理后的生物膜，計(jì)算總生物量，研究得出對(duì)于手動(dòng)牙刷難以清潔到鄰面菌斑生物膜，電動(dòng)牙刷表現(xiàn)出了良好的清潔功效，對(duì)預(yù)防鄰面齲等有著更為積極的作用。另外，電動(dòng)牙刷對(duì)于特殊人群[23]，以及調(diào)動(dòng)刷牙積極性上也有著不可替代的作用。因而，電動(dòng)牙刷具有更優(yōu)良的口腔保健能力。

本實(shí)驗(yàn)采用大小，形狀類似，但硬度不同的電動(dòng)牙刷刷頭來(lái)比較不同硬度刷毛的電動(dòng)牙刷對(duì)菌斑生物膜去除功效的影響，結(jié)果顯示2 種刷頭電動(dòng)牙刷處理后菌斑生物膜去除量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這說(shuō)明，對(duì)電動(dòng)牙刷而言，刷毛的材質(zhì)并不會(huì)影響其對(duì)菌斑生物膜的清除功效，這與Schmickler等[24]的研究結(jié)果是一致的。

在日常生活中，牙齒磨損是不可避免的[10,25]。如果發(fā)生重度磨損，則可能會(huì)導(dǎo)致咬合紊亂、咀嚼功能下降，顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病(TMD)等，給人們的生活帶來(lái)嚴(yán)重的影響。所以，盡量減少牙齒磨損對(duì)口腔保健至關(guān)重要[10-11,25]。刷牙是廣泛使用的口腔保健措施，從摩擦學(xué)角度看, 刷牙是牙刷、牙膏和牙齒之間相互摩擦的過(guò)程,而這種摩擦?xí)?dǎo)致牙齒釉質(zhì)表面基本結(jié)構(gòu)的改變。因刷牙導(dǎo)致的牙齒磨損早已被大量臨床和實(shí)驗(yàn)研究所證實(shí), 又被稱為“刷牙磨損”。刷牙的頻率，刷牙的力度，刷牙的時(shí)長(zhǎng)，刷毛的軟硬，牙膏的種類等[26-28]都可能對(duì)刷牙時(shí)釉質(zhì)的磨損產(chǎn)生影響。本實(shí)驗(yàn)選用與人牙結(jié)構(gòu)成分類似的牛牙，而未選用臨床拔取的人離體牙，是因?yàn)榇蟊娙巳弘y免會(huì)接受一些口腔保健措施，且方式、效果不盡相同，用其作為樣本一致性較差。使用從未接觸過(guò)口腔衛(wèi)生保健的牛牙，可以保證各組樣本初始特性具有一致性。由于目前對(duì)于刷毛的軟硬對(duì)釉質(zhì)的磨損的研究較少，故本實(shí)驗(yàn)將研究對(duì)象控制為刷毛硬度。廣泛宣傳的刷牙時(shí)間為每次至少2 min[3-5,21-24]，故本次實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)1 h刷牙時(shí)間來(lái)模擬1年的刷牙時(shí)長(zhǎng)。在本次實(shí)驗(yàn)中， SEM下觀察釉質(zhì)形貌發(fā)現(xiàn)，使用電動(dòng)牙刷刷牙會(huì)對(duì)釉質(zhì)表面造成磨損，且硬度較大的尼龍絲刷頭組造成釉質(zhì)表面的凹陷越大越深越多，表面形態(tài)越粗糙。這說(shuō)明，使用較軟的電動(dòng)牙刷刷頭，對(duì)釉質(zhì)的磨損較小，能夠更好的保護(hù)釉質(zhì)表面結(jié)構(gòu)。

綜上，在菌斑生物膜體外模型中，相對(duì)于傳統(tǒng)手動(dòng)牙刷，電動(dòng)牙刷可更高效的去除牙面菌斑生物膜，不同硬度刷毛的電動(dòng)牙刷的菌斑清除功效沒(méi)有明顯差異。且在使用電動(dòng)牙刷刷牙時(shí)，軟毛刷頭對(duì)釉質(zhì)表面的磨損較小，故使用軟毛刷頭電動(dòng)牙刷對(duì)日常口腔保健有著更積極的作用。