通心絡(luò)對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激致小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用＊

郝媛媛，劉 妍，李翠茹，高懷林

（1. 河北中醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院 石家莊 050200；2. 河北中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 石家莊 050200；3. 河北以嶺醫(yī)院 石家莊 050091；4. 絡(luò)病研究與創(chuàng)新中藥國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 石家莊 050035）

現(xiàn)代社會(huì)物資豐富，飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生了巨大變化，由于能量攝入過剩造成的脂代謝異常人口增多。內(nèi)皮功能障礙與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及其介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡相關(guān)，高血糖、氧化應(yīng)激、缺氧、鈣超載等均會(huì)引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[1]。此外，研究表明，心血管疾病、肥胖、炎癥等均與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激關(guān)系密切[2,3]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為蛋白質(zhì)翻譯、折疊、運(yùn)輸?shù)募?xì)胞器，在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)方面具有重要作用。未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）是一種細(xì)胞自我保護(hù)機(jī)制[4]，以適應(yīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生。早期通過減少蛋白質(zhì)的合成，增加蛋白質(zhì)的折疊和轉(zhuǎn)運(yùn)速度來恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)，但如果損傷過于嚴(yán)重，適應(yīng)機(jī)制不足以處理未折疊蛋白負(fù)荷，ERs會(huì)引起細(xì)胞凋亡[5]。過度或長(zhǎng)時(shí)間的ERS 能通過激活CHOP、JNK、Caspase12以及bcl-2家族引起的細(xì)胞凋亡[6,7]。

在脈絡(luò)學(xué)說營(yíng)衛(wèi)理論為指導(dǎo)下，探討“營(yíng)衛(wèi)不通，血凝不流”的基本病機(jī)，依據(jù)中醫(yī)學(xué)的“脈”與西醫(yī)學(xué)的“血管”在解剖形態(tài)上具有同一性，將在動(dòng)、靜脈中發(fā)生的多種血管疾病統(tǒng)稱為“脈絡(luò)-血管系統(tǒng)病”[8]。內(nèi)皮細(xì)胞作為微血管的基本構(gòu)成單位，在心血管事件鏈中發(fā)揮重要作用。本研究采高脂飲食喂養(yǎng)的C57BL/6J 小鼠，通心絡(luò)遵循了“絡(luò)以通為用”的治療原則進(jìn)行干預(yù),觀察其對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響，以評(píng)價(jià)通心絡(luò)對(duì)肥胖模型下小鼠的防治效果及血管內(nèi)皮功能的保護(hù)作用。

1 材料

1.1 動(dòng)物

5-6 周齡SPF 級(jí)雄性C57BL/6J 小鼠45 只，體質(zhì)量18-22 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司（許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0006），實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于河北省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)藥研究院新藥評(píng)價(jià)中心。溫度22-24℃，濕度50-60%，每籠5只，12 h明暗交替，自由進(jìn)食飲水。

1.2 主要試劑

總膽固醇（CHO）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）試劑盒（北京九強(qiáng)生物技術(shù)有限公司）；去甲腎上腺素（NE，天津金耀氨基酸有限公司）；乙酰膽堿（Ach，美國Sigma 公司）；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na，阿拉丁）；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（美國Thermo scientific 公司）；PSS 碳酸鹽緩沖液,KPSS 碳酸鹽緩沖液;Eastep?Super總RNA提取試劑盒（美國Promega公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR 試劑盒（日本Takara 公司）；GRP78 抗體、Caspase-9 抗體（Abcam 公司）；Caspase-3抗體、Caspase-7抗體（CST 公司）；引物（生工生物工程（上海）股份有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

DMT 620四通道微血管張力測(cè)定儀（DMT，丹麥），PowerLab 生物信號(hào)采集分析系統(tǒng)（AD instruments Co，Australia），顯微鏡，顯微手術(shù)解剖工具（Geuder，德國），電子天平（JA12002，上海越平科學(xué)儀器有限公司），微量移液器（Corning，美國），恒溫水浴鍋（DK-98-Ⅱ，天津市泰斯特儀器有限公司），純水儀（A10，Thermo），無菌工作臺(tái)（AIR TECH，蘇凈集團(tuán)安泰公司），7080 全自動(dòng)生化分析儀（日立公司，日本），Primo vert 倒置顯微鏡（蔡司，德國），SYNERGY4多功能酶標(biāo)儀（BioTek 公司，美國），Odyssey雙色紅外線掃膜儀（Li-Cor 公司，美國），ABI 7900 Real-Time PCR System（美國ABI公司）。

2 方法

2.1 藥物制備

通心絡(luò)超微粉（批號(hào):S-130901）由石家莊以嶺藥業(yè)有限公司提供。將通心絡(luò)粉末溶解于0.5%羥甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液中，制備成濃度為1.5 g·（kg·天）-1的灌胃混懸液。

2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模分組與給藥

45 只SPF 級(jí)雄性C57BL/6J 小鼠,適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分為3 組（n = 15），低脂對(duì)照組（低脂飲食，LFD+CMC），模型組（高脂飲食，HFD+CMC），通心絡(luò)組（高脂飲食+ 通心絡(luò)干預(yù)，1.5 g·（kg·天）-1，HFD +TXL），根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期研究選取通心絡(luò)的最優(yōu)給藥濃度為1.5 g·（kg·天）-1。在18 周給藥期間，每周稱量小鼠體質(zhì)量。

2.3 血液生化指標(biāo)

小鼠喂養(yǎng)18 周后，禁食12 h,摘眼球取血，冰上靜置30 min，4℃，3000 r·min-1，離心10 min，取上清，檢測(cè)TC，TG，HDL-C，LDL-C水平。

2.4 腸系膜動(dòng)脈血管環(huán)的制備

參考之前的報(bào)道[9]，用CO2吸入法處死小鼠，迅速取出腸血管組織，置于持續(xù)通氧的預(yù)冷PSS 緩沖液中，在解剖顯微鏡視野下，剝離血管周圍的脂肪組織及結(jié)締組織，選?、蠹?jí)腸系膜動(dòng)脈分支，剪取2 mm 左右血管，置于37 ℃含5 mL PSS 緩沖液的Chamber 中，用兩根鎢絲穿過血管，一根固定在張力轉(zhuǎn)換器，另一根固定在可調(diào)節(jié)負(fù)荷的裝置上，緩慢調(diào)至平衡狀態(tài)，使血管不受力，將固定有血管的Chamber 移至Interface 上，同時(shí)連接傳感器，并向浴槽內(nèi)持續(xù)通入含有95% O2和5% CO2混合氣體。穩(wěn)定15 min 后，進(jìn)行調(diào)零設(shè)置。腸系膜動(dòng)脈初始張力給與1.5 mN，平衡1 h后，再次進(jìn)行調(diào)零設(shè)置。給與60 mmol·L-1的K-PSS 溶液刺激血管，待收縮力達(dá)到平臺(tái)期時(shí)，更換PSS緩沖液洗脫4 次，每次5 min，直至基線附近，如此循環(huán)3 次。加入5 μL 的10-3mol·L-1NE 收縮血管，當(dāng)收縮值達(dá)到平臺(tái)期后加入乙酰膽堿（累加劑量10-8-10-5mol·L-1）舒張血管。舒張功能以血管舒張率表示，（Ach舒張幅度占PE 預(yù)收縮幅度的百分比）[10]。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，收集腸系膜動(dòng)脈，存放于-80℃冰箱凍存。

2.5 RT-PCR 檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)

表1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)制造商的說明，提取腸系膜動(dòng)脈中總RNA，使用微量核酸蛋白檢測(cè)儀（Gene 2000）測(cè)定RNA 的純度及濃度，選取A260/A280 值在1.9-2.1 范圍的樣品，按照Prime Script TM 合成試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA,按照SYBR Green PCR Master Mix 試劑盒說明書，在ABI 7900 H 序列檢測(cè)PCR 系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。引物設(shè)計(jì)如表1。

2.6 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

將HUVEC 細(xì)胞株培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1‰三抗的高糖DMEM 培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期則開始實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)分為3個(gè)組：正常對(duì)照組（control group）；模型組（Hcy group）；通心絡(luò)組（TXL group）。

2.7 MTS法確定Hcy給藥濃度

按照1 × 105的密度，將HUVEC 細(xì)胞接種于96 孔板中，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至70%后，分別加入含不同濃度的Hcy 培養(yǎng)液（0.25、1、2、4、6、8、10 mM），繼續(xù)培養(yǎng)24 h。吸取上清，每孔加入100 μL 的MTS（5 mg·mL-1）,37℃孵育1 h 后，選擇490 nm、630 nm 波長(zhǎng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，結(jié)合細(xì)胞形態(tài)觀察并確定最適造模濃度。

2.8 藥物細(xì)胞毒性檢測(cè)

當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%時(shí)，將HUVEC 細(xì)胞以每孔1×105的密度接種于96 孔板中，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后。分別用無血清（control group）、40、60、80、100 、150、200、400、600、800 μg·mL-1的TXL 處理細(xì)胞。處理24 h 后每孔加入100 μL MTS（5 mg·mL-1）,37℃孵育1 h，選擇490 nm、630 nm波長(zhǎng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，分析TXL對(duì)HUVEC細(xì)胞的毒性。

2.9 通心絡(luò)藥效實(shí)驗(yàn)

分別用無血清（control group），2 mM Hcy(Hcy group)、2 mM Hcy + 100 μg·mL-1TXL，2 mM Hcy + 200 μg·mL-1TXL，2 mM Hcy + 400 μg·mL-1TXL，2 mM Hcy +600 μg·mL-1TXL，2 mM Hcy + 800 μg·mL-1TXL 處理細(xì)胞，確定最適給藥濃度。

圖1 各組小鼠體質(zhì)量變化趨勢(shì)圖

2.10 Western blot

檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)收集細(xì)胞裂解液的蛋白樣品，采用BCA 法進(jìn)行蛋白定量，將提取的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE,然后轉(zhuǎn)移到NC膜上，37℃封閉1 h，一抗4℃孵育過夜，TBST 洗膜3 次，10 min/次，然后熒光二抗37℃搖床孵育1 h，TBST 洗膜3 次，10 min/次，通過Odyssey 成像系統(tǒng)檢測(cè)帶信號(hào)，并通過圖像分析軟件（LI-CO，USA）進(jìn)行量化。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以（x ±s）表示，采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）進(jìn)行檢驗(yàn)，方差齊性兩兩檢驗(yàn)采用LSD，方差不齊用Dunnett’s T3法，P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 TXL對(duì)高脂飲食小鼠體質(zhì)量和血脂的影響

與LFD 組小鼠相比，高脂飼料喂養(yǎng)（HFD）組小鼠體質(zhì)量從第四周開始明顯增加，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，TXL組小鼠體質(zhì)量較HFD組有所減輕（圖1）。與LFD組比較，HFD 組小鼠TC、TG、LDL-C 明顯升高，而TXL 組小鼠TC、TG、LDL-C的水平顯著降低（P＜0.05）（圖2）。

圖2 各組小鼠血脂水平比較

圖3 通心絡(luò)對(duì)Ach誘導(dǎo)的小鼠腸系膜動(dòng)脈舒張功能的影響

4.2 TXL在Ach介導(dǎo)小鼠腸系膜動(dòng)脈舒張中的作用

在終濃度為10-5mol·L-1的NE 誘發(fā)最大收縮后，分別累計(jì)濃度梯度Ach（10-9、10-8、10-7、10-6、10-5）mol·L-1介導(dǎo)的舒張作用下，LFD 組腸系膜動(dòng)脈血管舒張率為（86.6 ± 15.1）%，HFD 組腸系膜動(dòng)脈血管舒張率為（38.36±3.0）%，TXL 組血管舒張率為（61.21±4.7）%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01），表明TXL 可改善高脂飲食小鼠的內(nèi)皮依賴性血管舒張反應(yīng)（圖3）。

4.3 TXL對(duì)GRP78、凋亡通路蛋白及mRNA的表達(dá)

GRP78，又稱免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白,是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志性蛋白。與HFD 組相比，經(jīng)TXL 干預(yù)后，GRP78、PERK、CHOP、Bax mRNA 表達(dá)下調(diào)（P＜0.05），Bcl-2mRNA表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01）。

4.4 TXL對(duì)細(xì)胞活力的影響

圖4 通心絡(luò)對(duì)GRP78、PERK、CHOP、Bax、Bcl-2 mRNA表達(dá)的影響

圖5a 不同濃度Hcy對(duì)HUVEC細(xì)胞生存活性的影響

圖5b 不同濃度TXL對(duì)HUVEC細(xì)胞生存活性的影響

使用MTS 實(shí)驗(yàn)研究了不同濃度的Hcy 對(duì)HUVEC細(xì)胞存活狀態(tài)的影響，結(jié)果顯示，造模濃度為2 mM時(shí)，對(duì)細(xì)胞有明顯的損傷作用，隨后，觀察TXL 對(duì)HUVEC 細(xì)胞的毒性，在處理24 h 中，沒有發(fā)現(xiàn)明顯的細(xì)胞毒性作用，且當(dāng)通心絡(luò)濃度為200 μg·mL-1,TXL對(duì)Hcy 孵育的HUVEC 細(xì)胞具有明顯的保護(hù)作用（圖5a-c）。

4.5 通心絡(luò)通過抗凋亡途徑保護(hù)血管內(nèi)皮

圖5c TXL對(duì)Hcy誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷的影響

與control group 比較，Hcy group 凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3，Cleaved Caspase-3，Caspase-7，Caspase-9，表達(dá)升高（P ＜0.05）；與Hcy group 比較，TXL group Caspase-3, Cleaved Caspase-3，Caspase-7，Caspase-9蛋白表達(dá)明顯降低（P ＜0.05），表明通心絡(luò)能減少內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。

5 討論

內(nèi)皮功能障礙是心血管事件的早期風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)志之一[11]，其特征是eNOS 活性和/或表達(dá)降低，以及一氧化氮（NO）生物利用度降低[12]。而肥胖造成的脂質(zhì)沉積則是引起內(nèi)皮功能障礙的重要原因之一。肥胖患者的血管穩(wěn)態(tài)受損是由多種因素引起的，包括缺氧、免疫失衡、氧化應(yīng)激和脂肪因子分泌模式的改變，這些干擾因素獨(dú)立或協(xié)同地降低血管NO 的生物利用度，這被認(rèn)為是內(nèi)皮功能障礙進(jìn)展中的1 個(gè)關(guān)鍵步驟[13]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激加劇代謝功能障礙，從而導(dǎo)致血脂異常、脂肪肝和胰島素抵抗[5]。研究表明，胰高血糖素樣肽1（GLP1）激活UCP2/AMPK通路，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，恢復(fù)eNOS 活性，進(jìn)而改善內(nèi)皮細(xì)胞功能[14]；在肺動(dòng)脈高壓患者中，描述了ERs對(duì)eNOS表達(dá)的負(fù)面影響[15]。

長(zhǎng)期的高脂飲食會(huì)引起甘油三酯和膽固醇的升高，導(dǎo)致高脂血癥，而高脂血可通過氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、OX-LDL等作用機(jī)制導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷，造成內(nèi)皮功能紊亂，增加內(nèi)皮炎癥反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)采取高脂飲食喂養(yǎng)C57BL/6J小鼠復(fù)制肥胖模型，以期進(jìn)一步探究通心絡(luò)在肥胖模型下，對(duì)血管內(nèi)皮功能的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，通心絡(luò)可降低血清中TC、TG、LDL-C 水平。前期研究顯示[16]，通心絡(luò)具有劑量依賴性調(diào)節(jié)血脂水平，可通過激活PI3K/AKT 信號(hào)通路的表達(dá)，上調(diào)NO的濃度，減少ET-1的表達(dá)，改善血管內(nèi)皮功能。

腸系膜動(dòng)脈是形成外周阻力的主要血管，對(duì)血壓的調(diào)節(jié)有著重要意義[17]。血管內(nèi)皮細(xì)胞通過與血管壁和管腔細(xì)胞之間多個(gè)復(fù)雜的相互作用來維持血管內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定[18]。血管的收縮、舒張功能失調(diào)可能會(huì)導(dǎo)致心腦血管疾病的發(fā)生。血管舒縮活動(dòng)的異常，引起血管張力的升高，外周阻力增大，進(jìn)而引起高血壓的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究，小鼠肥胖模型下腸系膜動(dòng)脈內(nèi)皮舒張功能，提示高脂喂養(yǎng)所致脂代謝紊亂可引起內(nèi)皮性舒張功能障礙，通心絡(luò)組的血管舒張率較高脂組明顯提高，表明通心絡(luò)可改善高脂飲食動(dòng)物的內(nèi)皮依賴性血管舒張反應(yīng)，保護(hù)血管內(nèi)皮功能。

圖6 TXL對(duì)Hcy誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞損傷蛋白表達(dá)情況的影響

GRP78 是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志性蛋白。檢測(cè)HUVEC 細(xì)胞中GRP78 蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生，而經(jīng)通心絡(luò)干預(yù)后，GRP78 表達(dá)下調(diào)。長(zhǎng)期且嚴(yán)重的ERs通過激活CHOP、JNK、Caspase-12 3條通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，上調(diào)Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9 的蛋白表達(dá)，通心絡(luò)干預(yù)后凋亡相關(guān)的蛋白表達(dá)較Hcy 組明顯下調(diào)。另外，通心絡(luò)能增加抗凋亡蛋白Bcl-2的基因表達(dá)，降低促凋亡蛋白Bax的基因表達(dá)。ERs 發(fā)生后，激活Caspase-12,進(jìn)而激活Caspase-9、Caspase-3 等效應(yīng)Caspase。N 端前域長(zhǎng)的Caspase-8、Caspase-9 作為凋亡的啟始蛋白，位于級(jí)聯(lián)反應(yīng)凋亡的最上游，N 端前域短的Caspase-3、Caspase-7 位于凋亡“瀑布”反應(yīng)下游，Caspase-3 在促凋亡信號(hào)的最后一步被激活，而抑制Caspase 活性則能減弱細(xì)胞的損傷和凋亡[19]。Caspase-3 是死亡受體途徑、線粒體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑三者共同的效應(yīng)分子。

通心絡(luò)以絡(luò)病學(xué)說為指導(dǎo)，益氣活血、搜風(fēng)通絡(luò)為原則而創(chuàng)立。由人參、蜈蚣、全蝎、水蛭、土鱉蟲、赤芍、酸棗仁、降香等藥物組成。方中人參益氣通絡(luò)，蜈蚣、土鱉蟲通絡(luò)剔瘀，全蝎、蟬蛻搜風(fēng)解痙，赤芍涼血化瘀，酸棗仁養(yǎng)血安神，配伍芳香之檀香、降香、乳香、冰片入絡(luò)通竅[8]。有研究表明，通心絡(luò)通過激活PI3K/Akt通路，來實(shí)現(xiàn)抗ERs所致凋亡作用[20]。大量實(shí)驗(yàn)和臨床證據(jù)表明[16,21,22]，通心絡(luò)可降低NO 水平，改善血管內(nèi)皮功能、氧化應(yīng)激指標(biāo)和減輕微炎癥狀態(tài)等多重作用。最新研究顯示[23]，通心絡(luò)膠囊可延緩頸動(dòng)脈平均內(nèi)中膜厚度、斑塊面積和血管重構(gòu)指數(shù)的進(jìn)展。通心絡(luò)的獨(dú)特理論特色和確切臨床效果引起了國內(nèi)中西醫(yī)學(xué)界的關(guān)注，其可改善血管內(nèi)皮功能這一血管病始動(dòng)因素，并可有效阻斷血管病變的不同病理環(huán)節(jié)，體現(xiàn)了通絡(luò)中藥標(biāo)本兼治、防治結(jié)合的作用特點(diǎn)。但針對(duì)肥胖導(dǎo)致的血管損傷并未見報(bào)道，本研究發(fā)現(xiàn)，通心絡(luò)能改善細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡的作用，有效預(yù)防高脂膳食導(dǎo)致的血管內(nèi)皮功能損害。